丁苯酞和TLR4 抑制劑預(yù)處理對冠狀動脈微栓塞大鼠心肌損傷的改善作用及其機(jī)制

黃駿文，陳志清，周游，李浪

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，南寧 530021；2 前海人壽南寧醫(yī)院心血管內(nèi)科

冠狀動脈微栓塞（CME）指冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂后，斑塊碎片和脂質(zhì)等致血栓成分流向遠(yuǎn)端微小血管引起微循環(huán)堵塞，是冠脈介入治療（PCI）的常見并發(fā)癥之一［1］。CME容易使冠脈發(fā)生“慢血流”或“無復(fù)流”，嚴(yán)重影響患者預(yù)后［2-3］。研究表明，炎性因子參與的心肌組織局部炎性反應(yīng)，與CME 所致的心肌損傷密切相關(guān)［4-5］。

丁苯酞（NBP）在臨床中廣泛用于治療缺血性卒中，具有抗炎［6］、抗氧化應(yīng)激［7］、抗血小板聚集［8］、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡［9］多種分子靶點。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NBP 預(yù)處理可減輕冠狀動脈微栓塞大鼠心肌炎癥反應(yīng)并保護(hù)心功能［10］。研究顯示，Toll 樣受體4（TLR4）抑制劑聯(lián)合右美托咪定能減輕缺氧復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)右美托咪定單藥治療效果［11］。然而，NBP聯(lián)合TLR4抑制劑能否增強(qiáng)抗炎效應(yīng)，增強(qiáng)NBP 對CME 大鼠的心肌保護(hù)作用仍未明確。2019年6月—2021年6月，本研究通過構(gòu)建大鼠CME 模型，以單用NBP 作為對照，觀察預(yù)先給予NBP 和TLR4 抑制劑的CME 大鼠心臟功能、心肌組織病理及TLR4 通路相關(guān)蛋白和炎性因子表達(dá)變化，以明確NBP 聯(lián)合TLR4 的干預(yù)效果是否優(yōu)于單用NBP，同時探討了NBP 聯(lián)合TLR4 抑制劑預(yù)處理對CME大鼠心肌損傷的改善作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑及儀器 32 只SPF 級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（動物合格證號SYXK 桂2020-0004）。實驗方案通過廣西醫(yī)科大學(xué)動物福利與倫理委員會審查。直徑45 μm 微栓塞球（美國Polyscience 公司），用生理鹽水調(diào)整密度為3×104/mL。丁苯酞軟膠囊（石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20050299），用食用植物油調(diào)配成80 mg/mL。TLR4抑制劑TAK-242（美國APExBIO公司）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR 試劑盒購自Monad 公司。 兔抗鼠TLR4、兔抗鼠MyD88、兔抗鼠NF-κB、兔抗鼠IL-1β、兔抗鼠TNF-α 單克隆抗體、β-actin 單克隆抗體及熒光羊抗兔二抗購自索萊寶科技有限公司。ALCV9A 小型動物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技公司）；E-Saote Mylab 彩色多普勒B 超儀（意大利百勝公司）；NanoDrop 分光光度計、StepOnePlus熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；T100 PCR 儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀等（美國Bio-rad 公司）；FluorChem FC3 全能型成像系統(tǒng)（美國proteinsimple 公司）；低溫離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；BX50 光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 大鼠分組及NBP 灌胃、TAK-242 尾靜脈注射、微栓塞球左心室注射 按隨機(jī)數(shù)字表法將32 只大鼠隨 機(jī)分為NBP + TAK-242 組、NBP 組、CME 組、Sham組，每組8只。NBP組CME術(shù)前予NBP 80 mg／kg連續(xù)灌胃7 d，NBP + TAK-242 組在NBP 組基礎(chǔ)上CME 術(shù) 前30 min 按2 mg/kg 尾靜脈注射0.5 mg/mL的TLR4抑制劑TAK-242，其余各組同法注射4 mL/kg的生理鹽水。 CME 術(shù)前予3% 戊巴比妥鈉按1.5 mL/kg 腹腔注射麻醉，術(shù)區(qū)剃毛、消毒，頸正中切口暴露氣管，經(jīng)口氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)輔助通氣，于胸骨左緣剪開皮膚，鈍性分離肌肉，剪斷第2～4肋骨進(jìn)胸，開瞼器撐開肋骨，打開心包并暴露升主動脈，用血管夾鉗夾主動脈根部，CME 組、NBP組及NBP + TAK-242組立即用注射器從心尖部將直徑42 μm微栓塞球混懸液0.1 mL注射至左心室，10 s后松開血管夾，Sham 組同法注射0.1 mL 生理鹽水。待心跳平穩(wěn)后逐層關(guān)胸，待蘇醒后拔管脫機(jī)。大鼠術(shù)后6～12 h心功能明顯下降，心肌病理切片可見微栓塞提示CME模型制備成功。

1.3 心功能檢查 術(shù)后6 h 麻醉大鼠，超聲探頭頻率12 MHz，測量左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、短軸縮短率（FS）、左心室舒張末徑（LVEDd）、左心室收縮末徑（LVEDs），連續(xù)測量3個心動周期，取平均值。

1.4 大鼠心肌組織病理學(xué)觀察及心肌微梗死面積的測量 術(shù)后6 h，行心臟彩超后，處死大鼠，取大鼠心底部組織，放入4%多聚甲醛固定液中浸泡，12 h后取出，石蠟包埋，切片，行HE染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察大鼠心肌組織病理學(xué)改變。行HBFP染色，普通光學(xué)顯微鏡拍照，Image J v1.80測量心肌微梗死面積。

1.5 心肌組織TLR4 mRNA 檢測 采用RT-PCR法。心臟超聲檢查后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，沿原術(shù)口開胸取出心臟，預(yù)冷生理鹽水清洗，去除心耳、心房，心尖部用干冰冷凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。取心肌組織200 mg，按照TRIzol 試劑盒說明提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實驗的特異性引物由Sangon 公司合成：TLR4上游引物：5'-CTGCATAGAGGTAGTTCCT-3’；下游引物：5'-TCCAGCCACTGAAGTTCTGA-3’。GAPDH 上游引物：5'-TGTGAACGGATTTGGCCGTA-3’；下游引物：5'-GATGGTGATGGGTTTC-CCGT-3’。按試劑說明設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù)，用SYBRGREENI 法檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，每個樣本均做3個復(fù)孔檢測，結(jié)果以2-ΔΔCT表示。

1.6 心肌組織TLR4 通路相關(guān)蛋白（TLR4、myD88、NF-κB）及炎性因子（IL-1β、TNF-α 蛋白）檢測 采用Western blotting法。取心肌組織加入RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑，組織研磨儀中研磨，4 ℃、12000 r/min 離心15 min，取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度，將各組樣品濃度統(tǒng)一調(diào)至10 μg/μL。配制10% 的分離膠和5% 的濃縮膠，每孔加樣5 μL，恒壓60 V 電泳，Marker分層后調(diào)至110 V 進(jìn)行電泳；恒流350 mA 60 min濕法將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，置于TLR4、myD88、NF-κB、IL-1β、TNF-α 的一抗溶液（1：1000）中，4 ℃下孵育過夜，次日TBST 洗膜后放置在相應(yīng)1∶10000 熒光二抗室溫孵育1 h；TBST 洗膜后用化學(xué)發(fā)光液顯影，全能型成像系統(tǒng)掃膜；最后，用ImageJv1.80測量條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。采用Shapro-Wilk 檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，使用Levene 檢驗進(jìn)行方差齊性檢驗，當(dāng)方差齊時，兩兩比較采用LSD-t檢驗，當(dāng)方差不齊時，兩兩比較采用Tambane’sT2 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 與Sham 組相比，其余各組LVEF 和FS 下降（P均＜0.01）；與CME 組相比，NBP 組 及NBP + TAK-242 組LVEF 和FS 升高（P均＜0.01）；與NBP 組 相 比，NBP + TAK-242組LVEF 和FS 升高（P均＜0.05）。與Sham 組相比，CME 組LVEDs 增加（P＜0.01）；與CME 組相比，NBP組及NBP + TAK-242 組LVEDd、LVEDs 降低（P均＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠心功能比較（±s）

表1 各組大鼠心功能比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與CME組相比，△P＜0.05；與NBP組相比，#P＜0.05。

組別NBP + TAK-242組NBP組CME組Sham組LVEF（%）72.6 ± 2.4*△#68.9 ± 4.2*△56.4 ± 1.6*77.0 ± 2.1 FS（%）36.5 ± 2.2*△#33.5 ± 3.1*△25.4 ± 0.7*40.4 ± 2.2 LVEDd（mm）5.3 ± 0.55.1 ± 0.5△5.7 ± 0.45.4 ± 0.2 LVEDs（mm）3.4 ± 0.3△3.4 ± 0.3△4.2 ± 0.3*3.2 ± 0.1

2.2 各組大鼠心肌病理學(xué)表現(xiàn)及心肌微梗死面積 HE染色顯示Sham 組未見微栓塞球及心肌梗死灶；其余各組均可見血管內(nèi)微栓塞球，微球周圍心肌細(xì)胞核溶解或消失，細(xì)胞水腫、變性，周圍可見白細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出。與CME 組比較，NBP 組及NBP + TAK-242 組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變較輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，見圖1。HBFP 染色結(jié)果顯示，Sham 組心肌組織未見明顯的微梗死灶，其余各組均可見血管內(nèi)微栓塞球及周圍明顯的微梗死灶（梗死區(qū)顯紅色）。Sham 組、CME 組、NBP 組、NBP + TAK-242 組的微梗死面積占比分別為3.72% ± 0.51%、17.25% ± 1.74%、13.60% ± 1.59%、11.30% ±0.51%。與CME 組相比，NBP 組及NBP + TAK-242組的微梗死面積減?。≒均＜0.01）；與NBP 組相比，NBP + TAK-242 組心肌微梗死面積進(jìn)一步減?。≒＜0.01）。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果（×100）

2.3 各組TLR4 mRNA 相對表達(dá)量比較 NBP +TLR4 組、NBP 組、CME 組、Sham 組的TLR4 mRNA 相對表達(dá)量分別為1.44 ± 0.21、1.67 ± 0.47、3.18 ±0.57、0.87 ± 0.28。 與Sham 組 相 比，CME 組TLR4 mRNA 相對表達(dá)量升高（P＜0.01）。與CME 組相比，NBP 組及NBP + TAK-242 組TLR4 mRNA 相對表達(dá)量降低（P均＜0.01）。與NBP 組相比，NBP +TAK-242 組TLR4 mRNA 相對表達(dá) 水 平降低（P＞0.05），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 各組大鼠心肌TTLR4、MyD88、NF-κB 及炎性因子蛋白相對表達(dá)量比較 與Sham 組相比，CME組、NBP 組TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、TNF-α 蛋白相對表達(dá)量升高（P均＜0.05）。與CME 組相比，NBP 組及NBP + TAK-242 組TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、TNF- α蛋白相對表達(dá)量均降低（P均＜0.05）。與NBP 組相比，NBP + TAK-242 組TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α 蛋白相對表達(dá)量降低（P均＜0.05）；NBP + TAK-242 組NF-κB 蛋白相對表達(dá)量降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表2、圖2。

表2 各組大鼠心肌TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β相對表達(dá)量比較（±s）

表2 各組大鼠心肌TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β相對表達(dá)量比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與CME組相比，△P＜0.05；與NBP組相比，#P＜0.05。

組別NBP + TAK-242組NBP組CME組Sham組TLR40.70 ± 0.28△#0.89 ± 0.20*△0.96 ± 0.22*0.77 ± 0.23 MyD880.64 ± 0.19△#0.87 ± 0.25*△1.08 ± 0.27*0.61 ± 0.11 NF-κB 0.70 ± 0.28△0.88 ± 0.27*△1.12 ± 0.31*0.58 ± 0.18 TNF-α 0.81 ± 0.16△#1.13 ± 0.20*△1.23 ± 0.27*0.77 ± 0.23 IL-1β 0.73 ± 0.16*△#0.97 ± 0.21*△1.05 ± 0.23*0.56 ± 0.18

圖2 各組大鼠心肌組織TLR4通路相關(guān)蛋白及炎性因子的電泳圖（Western blotting）

3 討論

研究顯示，CME 可導(dǎo)致心肌損傷及近、遠(yuǎn)期心功能明顯下降，與急性ST 段抬高型心肌梗死患者PCI 治療后1年內(nèi)心衰的病死率和住院率密切相關(guān)［3］。炎性因子參與CME 后心肌組織局部炎性反應(yīng)，心肌炎癥反應(yīng)與CME 后心肌收縮功能障礙密切相關(guān)［4-5］，抑制炎癥因子水平、減輕CME 后心肌炎癥反應(yīng)可改善CME后心功能［12-13］。

NBP 有多種生物靶點，研究表明NBP 能減輕神經(jīng)血管炎癥，保護(hù)神經(jīng)功能［14-15］。BAI 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，NBP 可抑制大鼠急性心肌梗死后IL-1β、TNF-α表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡。QIU 等［16］發(fā)現(xiàn)在大鼠心力衰竭模型中，NBP 能抑制TNF-α 蛋白表達(dá)水平，保護(hù)心功能。在前期研究中，我們也發(fā)現(xiàn)NBP 預(yù)處理能減少CME 大鼠心肌IL-1β、TNF-α表達(dá)水平，減輕心肌炎癥反應(yīng)，并改善CME 大鼠心功能［10］。

TLR4/MyD88/NF-κB 信號傳導(dǎo)通路與心肌炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)［17］。SU 等［18］發(fā)現(xiàn)使用TLR4 特異性抑制劑TAK-242 可有效抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路激活，減輕CME 后心肌炎癥反應(yīng)，改善心功能。另外，在大鼠CME 模型中，使用大蒜素、尼可地爾等同樣能抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活，減輕CME后心肌炎癥反應(yīng)［19-20］，提示阻斷TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路可能成為減少CME 后心肌損傷的有效方法。本研究針對NBP 聯(lián)合TAK-242 能否增強(qiáng)抗炎效應(yīng)，提高NBP保護(hù)CME所致心肌損傷的作用進(jìn)行了研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，CME 后6 h 大鼠心功能下降，心肌組織HE 染色可見血管內(nèi)微梗塞球及周圍壞死心肌組織，白細(xì)胞浸潤明顯，心肌炎癥因子水平升高，而給予NBP 可明顯改善這種變化，與前期實驗結(jié)果基本一致。通過進(jìn)一步檢測，我們發(fā)現(xiàn)CME 大鼠心肌組織TLR4 在mRNA 及蛋白水平的表達(dá)明顯升高，同時TLR4 調(diào)控的MyD88、NF-κB 蛋白水平均升高，提示CME 后TLR4 信號通路激活參與調(diào)控CME后大鼠心肌炎癥反應(yīng)。給予NBP 后，大鼠心肌組織TLR4 mRNA 及蛋白水平的表達(dá)明顯降低，TLR4 調(diào)控的MyD88、NF-κB 蛋白及炎癥反應(yīng)因子IL-1β、TNF-α水平均降低，提示NBP可能通過抑制TLR4表達(dá)，抑制TLR4信號通路激活，減輕CME 大鼠心肌炎癥反應(yīng)。在NBP 聯(lián)合TAK-242 預(yù)處理后，CME 大鼠心肌TLR4 及下游通路蛋白水平進(jìn)一步降低，心肌微梗死面積進(jìn)一步減少，大鼠心功能進(jìn)一步改善，說明NBP 聯(lián)合TAK-242 能協(xié)同抑制TLR4 通路激活，進(jìn)一步減輕心肌炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷，提高NBP單獨(dú)用藥對CME大鼠心肌損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，NBP 聯(lián)合TAK-242 可能通過協(xié)同抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路信號激活，減輕CME 所致的心肌炎癥反應(yīng)，從而減輕心肌損傷，改善心功能。NBP 聯(lián)合TAK-242 可能為防治CME 所致心肌損傷提供新的線索與方向。