毛細支氣管炎患兒血清IL-35、Th2類細胞因子水平變化及其意義

汪廉，孫明月，彭萬勝

蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院兒科，安徽 蚌埠 233004

毛細支氣管炎是一種嬰幼兒常見的呼吸系統(tǒng)疾病，臨床上主要表現(xiàn)為喘息、氣促及三凹征等［1］，主要由呼吸道合胞病毒（RSV）感染引起。全球每年約有300 萬兒童因患毛細支氣管炎住院治療，其中有6～20萬兒童最終因其死亡［2］。毛細支氣管炎與免疫反應密切相關，Th1/Th2 免疫失衡被認為是毛細支氣管炎的主要發(fā)病機制，表現(xiàn)為免疫反應向Th2 型反應偏移，IL-4 等Th2 類炎癥性細胞因子的水平升高［3］。

有研究表明，IL-35可促進調節(jié)性T 細胞（Tregs）的分泌，抑制Th2 類細胞因子介導的炎癥反應［4］。IL-35 是由Tregs 及多種免疫調節(jié)細胞分泌的細胞因子，為p35 與EBI3 亞基結合形成的異二聚體，屬于IL-12 家族［5-6］。IL-35 通過與T 細胞上的受體結合產生效應，在炎癥性腸病、膠原誘導的關節(jié)炎及過敏性氣道疾病等的發(fā)病過程中具有重要作用［7-9］。但目前國內關于IL-35 與毛細支氣管炎關系的研究報道較少。本研究觀察了毛細支氣管炎患兒血清IL-35及Th2類細胞因子的水平變化，探討了血清IL-35及Th2 類細胞因子之間的關系，并分析了二者對毛細支氣管炎病情嚴重程度的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2019年12月—2021年3月收治的診斷為毛細支氣管炎的患兒68 例。納入標準：符合《毛細支氣管炎診斷、治療與預防專家共識（2014年版）》［1］中毛細支氣管炎的診斷標準。排除標準：①先天性氣道發(fā)育畸形、先天性心臟病、免疫缺陷病、哮喘等；②合并細菌感染；③合并全身多系統(tǒng)、器官的損害；④近期使用免疫調節(jié)藥物。根據《毛細支氣管炎診斷、治療與預防專家共識（2014年版）》［1］，將患兒分為輕度組34例及中重度組34例，對照組選取我院兒科康復病房同期同年齡，近期無呼吸道感染臨床癥狀，無其他系統(tǒng)感染史的兒童（診斷為發(fā)育指標延遲、全面性發(fā)育落后等的兒童）。由于中、重度毛細支氣管炎的診斷標準較為接近，且中、重度組病例數(shù)相對輕度組少，故將其合并為一組。觀察組年齡中位數(shù)為7 個月，對照組年齡中位數(shù)為11個月，兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。輕度組年齡中位數(shù)為6 個月，入院時的病程中位數(shù)為4 天，中重度組年齡中位數(shù)為8.5個月，入院時的病程中位數(shù)為3.5天，兩組年齡、入院時的病程差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，患兒家屬知情同意。

1.2 血清IL-35、Th2 類細胞因子的檢測 患兒入院24 h 內，抽取空腹外周靜脈血，靜置半小時后，以3000 r/min 離心10 min，離心半徑為10 cm，將血清分裝在凍存管內，做好標記放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA 法檢測血清中的IL-35 及Th2 類細胞因子，IL-35 試劑盒由Elabscience 公司生產，各Th2 類細胞因子試劑盒均由ABclonal 公司生產，操作嚴格按照說明書進行，反應終止后在ELISA 檢測儀上，于450 nm 波長下，以空白對照孔調零后測各孔OD 值，用ELISA 數(shù)據分析軟件計算對應樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk 檢驗進行正態(tài)性檢驗，并進行方差齊性分析，如果數(shù)據呈正態(tài)分布，用±s表示，比較采用t檢驗；如果數(shù)據呈非正態(tài)分布，用M（P25，P75）表示，比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。細胞因子間相關性分析采用Spearman 相關。影響因素分析采用多元線性回歸。診斷效能分析采用ROC。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 水平比較 觀察組血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 水平 分 別 為10.55（9.00，12.11）、（7.73 ± 1.39）、（129.15 ± 17.80）、（741.00 ± 109.87）、31.21（24.92，38.38） pg/mL，對 照 組 分 別 為14.34（12.48，16.81）、（5.46 ± 1.17）、（158.58 ± 17.14）、（569.12 ±96.91）、52.92（45.18，60.45）pg/mL。與對照組比較，觀察組血清IL-35、IL-10、IL-33 水平低，IL-4、IL-13水平高（P均＜0.01）。

中重度組血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 水平 分 別 為（9.65 ± 1.74）、8.45（7.49，9.71）、（121.49 ± 17.26、（788.00 ± 95.80）、（29.21 ±7.75）pg/mL，輕度組分別為（11.52 ± 1.90）、6.93（6.29，7.45）、（136.80 ± 14.99）、（694.00 ± 103.81）、（34.09 ± 8.63）pg/mL。與輕度組比較，中重度組血清IL-35、IL-10、IL-33 水平低（P均＜0.05），IL-4、IL-13水平高（P均＜0.01）。

2.2 觀察組血清IL-35與TH2類細胞因子之間及二者與病情之間的關系 血清IL-35與IL-10呈正相關（rs=0.291，P＜0.05），與IL-4 呈負相關（rs=-0.251，P＜0.05）。

以中重度毛細支氣管炎為因變量（是=1，否=0），以IL-4、IL-10、IL-13、IL-33、IL-35為自變量（均以實際值賦值）進行回歸分析。結果顯示，IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 是疾病嚴重程度的影響因素（P均＜0.05）。見表1。

表1 觀察組疾病嚴重程度的多元線性回歸分析結果

2.3 血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 對中重度毛細支氣管炎的診斷效能 IL-35 的診斷界值為10.53 pg/mL，曲線下面積（AUC）為0.760（95%CI：0.641～0.855，P＜0.001），靈敏度為70.6%，特異度為70.6%；IL-4 的診斷界值為7.3 pg/mL，AUC 為0.827（95%CI：0.716～0.908，P＜0.001），靈敏度為82.4%，特異度為73.5%；IL-10 的診斷界值為115.38 pg/mL，AUC 為0.712（95%CI： 0.589～0.815，P＜0.001），靈 敏 度 為44.1%，特 異 度 為97.1%；IL-13 的 診 斷 界 值 為643 pg/mL，AUC 為0.739（95%CI：0.618～0.838，P＜0.001），靈敏度為97.1%，特異度為41.2%；IL-33 的診斷界值為22.61 pg/mL，AUC 為0.635 （95%CI： 0.509～0.748，P＜0.05），靈 敏 度 為26.5%，特 異 度 為100.0%，詳見圖1。

圖1 血清IL-35、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33診斷中重度毛細支氣管炎的ROC

3 討論

隨著近年來毛細支氣管炎發(fā)病率的上升，疾病免疫學方面的研究逐漸增多。研究認為，毛細支氣管炎的發(fā)病過程與免疫反應密切相關，Th1/Th2 免疫失衡是毛細支氣管炎的主要發(fā)病機制之一，主要表現(xiàn)為Th2 型免疫反應增強，Th1 型免疫反應減弱［3］。針對相關細胞因子的研究對診斷及治療毛細支氣管炎具有重要意義。

IL-35 主要由Tregs 細胞產生，IL-35 在T 細胞上有3 種受體，包括IL-12Rβ2同型二聚體、gp130 同型二聚體及IL-12Rβ2/gp130 異二聚體，IL-35 通過與T細胞上的受體結合，激活JAK1、JAK2、STAT1 及STAT4 信號轉導通路，發(fā)揮生物學效應［6］。IL-35 可通過抑制細胞分裂G1期向S 期分化，抑制CD4+、CD8+T 細胞（Th1、Th17 等）的增殖，抑制Th1 類細胞因子及IL-17A 的分泌［10］；可通過抑制GATA3 和IL-4的表達，抑制Th2 的增殖，抑制Th2 型免疫反應［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，毛細支氣管炎患兒血清IL-35 水平低，且中重度患兒較輕度患兒更明顯，提示IL-35在毛細支氣管炎中可能具有保護作用。通過研究細胞因子間相關性發(fā)現(xiàn)，IL-35與IL-10呈正相關，與IL-4呈正相關。ROC顯示，IL-35對中重度毛細支氣管炎具有較高的診斷效能，提示IL-35可用于輔助判斷毛細支氣管炎的嚴重程度。FAN 等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，RSV 感染組患兒IL-35的水平較健康對照組升高。IL-35的水平變化存在爭議。有證據表明，IL-10在RSV感染不同階段中的表達有差異［13］，且IL-35 與IL-10 存在相關性［12］，因此，IL-35 可能存在類似的變化。廖廷彥等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，RSV 感染的毛細支氣管炎患兒入院后第2 天血清IL-35 的水平低于對照組，本研究的結果與其一致，說明IL-35 在RSV 感染不同階段中的表達存在差異，可能是不同研究中IL-35水平差異產生的原因。

Th2 類細胞因子IL-4 是Th2 型免疫反應的特征性細胞因子，可抑制Th1 類細胞因子IFN-γ 的活性［3］。IL-10 由CD4+及CD8+T 細胞產生，參與RSV激活的免疫細胞產生的促炎細胞因子和趨化因子的調節(jié)。在毛細支氣管炎中，IL-10缺乏可引起疾病嚴重程度增加，恢復延遲［13］。IL-13在哮喘的發(fā)病過程中具有重要作用，可促進IgE 的產生［15］。在呼吸道疾病中，IL-33 是哮喘等過敏性氣道疾病的重要介質。IL-33 主要由組織細胞表達，包括上皮細胞、內皮細胞及成纖維細胞，在炎癥感染時可由肥大細胞及樹突樣細胞表達［16］。IL-33 受體包括ST2 蛋白及IL-1 受體輔助蛋白，IL-33 與受體結合，通過MyD88、MAPK 及NF-κB 蛋白轉導信號，參與機體的先天性免疫及適應性免疫［15-16］。當感染或組織損傷時，IL-33從壞死的細胞核釋放到細胞外，促使2 型先天性淋巴細胞（ILC2s）刺激Th2類細胞因子IL-5、IL-13的分泌，免疫反應向Th2 偏移［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，毛細支氣管炎患兒血清IL-4、IL-13 水平高，IL-10、IL-33 水平低，且中重度患兒較輕度患兒更明顯。多元回歸分析顯示IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 均是疾病嚴重程度的影響因素，提示Th2 類細胞因子與疾病嚴重程度相關。ROC 顯示，IL-4、IL-10、IL-13、IL-33 對中重度毛細支氣管炎均具有較高的診斷效能，提示Th2類細胞因子可用于輔助判斷毛細支氣管炎的嚴重程度。FAN等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染組患兒IL-10的水平較健康對照組顯著升高，中重度患兒血清IL-10的水平較輕度患兒顯著降低。GAO 等［19］通過小鼠模型發(fā)現(xiàn)，RSV 感染小鼠的外周血Tregs 及IL-10 的水平低于健康小鼠。IL-10 的水平變化存在爭議。SUN 等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，在RSV 感染后的24 h 內，小鼠表現(xiàn)為細胞因子、趨化因子的表達增加，此時，IL-10 未誘導Th2 類細胞因子的產生，而在感染后的8～10 天，小鼠表現(xiàn)為Th2 類細胞因子的表達增加。在RSV 感染后的第6 天，IL-10 呈高表達，在第8 天，IL-10 的水平逐漸降低。因此，IL-10 在RSV 感染不同階段中的表達差異可能是不同研究中IL-10 水平差異產生的原因。VU 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，中重度RSV感染患兒的鼻咽分泌物IL-4、IL-13、IL-33 及ILC2s的水平較輕度患兒顯著升高，多元回歸分析顯示IL-4（OR=9.67，95%CI：2.45～38.15，P=0.001）是疾病嚴重程度的影響因素。CHRISTIAANSEN 等［3］的研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)RSV 感染患兒Th1 及Th2 類細胞因子的水平升高，但IL-33 及Tregs 的水平降低。IL-33 的水平變化存在爭議。CHRISTIAANSEN 等［3］認為，RSV感染時細胞凋亡而非壞死可能是IL-33水平變化的原因，IL-33 的降低使Tregs 募集減少，引起Tregs的水平降低，但該推論仍有待進一步證實。

綜上所述，毛細支氣管炎患兒血清IL-35、IL-10、IL-33 水平低，IL-4、IL-13 水平高，且中重度患兒較輕度患兒更明顯。血清IL-35水平與IL-10呈正相關，與IL-4 呈負相關。Th2 類細胞因子是毛細支氣管炎疾病嚴重程度的影響因素。IL-35 及Th2 類細胞因子可用于輔助判斷毛細支氣管炎的嚴重程度。隨著對毛細支氣管炎發(fā)病機制的研究，免疫治療的重要性越發(fā)突出，針對相關細胞因子開發(fā)潛在的免疫治療藥物，對緩解毛細支氣管炎的癥狀，縮短病程具有重要意義。本研究在設計上仍然存在一些缺陷。例如：患兒病原體的檢出率較低，未能對引起毛細支氣管炎的病原體進行具體劃分，無法驗證不同病原體對細胞因子水平的影響；患兒的年齡范圍較廣，未再進行準確分類，無法驗證年齡對細胞因子水平的影響；針對患兒血清進行研究較呼吸道分泌物準確性差。以上均有可能對研究結果產生影響。下一步研究將篩選RSV 感染的毛細支氣管炎患兒，觀察疾病不同階段血清IL-35 及Th2 類細胞因子的變化，探討IL-35及Th2類細胞因子在疾病各階段的作用。