宏基因二代測序技術在重癥肺炎病原體檢測及治療方案制定中的應用

張安兵，袁小玲，夏秀瓊，呂燕華，張丹丹，梁劍平

中山市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣東 中山 528400

重癥肺炎是臨床常見危重疾病之一，病死率20%～50%［1］，快速確定病原體并進行針對性抗感染治療尤為重要［2］。傳統(tǒng)痰、灌洗液培養(yǎng)陽性率低、周期長，不能有效指導臨床抗感染治療。宏基因二代測序技術（mNGS）是借助二代測序平臺快速測序獲得樣品中的核酸序列，并進一步與各個物種的基因組序列對比，從而得知樣品中微生物種類的技術［3］。mNGS被逐漸應用于探究疑難感染病原體，但目前將該技術應用于重癥肺炎病原體的診斷及治療中的研究鮮見報道。本研究以傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)為對照，探討mNGS 在重癥肺炎病原體檢測及治療方案制定中的應用效果。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取中山市人民醫(yī)院2019年1月—2021年6月收治的重癥肺炎患者112例，男55例、女57例，年齡18～85（61.72 ± 11.35）歲。患者入院時均予經(jīng)驗性抗感染治療及其他常規(guī)治療，需有創(chuàng)機械通氣者行氣管插管，外接呼吸機機械通氣（美國鳥牌8400 型呼吸機）。納入標準：①符合2019年美國感染病學會/美國胸科學會（IDSA/ATS）“成人社區(qū)獲得性肺炎診治指南”對重癥肺炎的診斷標準［1］。主要標準：需要氣管插管行機械通氣治療；膿毒癥休克經(jīng)積極液體復蘇后仍需要血管活性藥物治療。次要標準：呼吸頻率≥30 次/min；氧合指數(shù)≤250；多肺葉受累；意識障礙；血尿素氮≥20 mg/dL；白細胞計數(shù)＜4×109/L；血小板計數(shù)＜100×109/L；體溫＜36 ℃；低血壓需要液體復蘇。符合1條主要標準，或至少3項次要標準可診斷。②年齡≥18 歲。排除標準：結締組織疾病累及肺部；患獲得性免疫缺陷綜合征者；粒細胞缺乏者；嚴重肝功能、腎功能損害者；妊娠或哺乳期婦女；存在纖支鏡檢查禁忌證者?；颊呔炇鹬橥鈺狙芯揩@醫(yī)院倫理委員會審核通過。將符合入選標準的112 例患者采用隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組，各56 例。實驗組男26 例、女30例，年齡（62.57 ± 12.52）歲，BMI（21.23 ± 3.45）kg/m2，有吸煙史21 例，合并基礎疾病41 例，行機械通 氣 治 療48 例，氧 分 壓（PO2）為（63.21 ±7.96）mmHg，氧合指 數(shù)（PaO2/FiO2）為（197.16 ±11.87）mmHg，白細胞（WBC）為（17.63 ± 4.63）×109/L，中性粒細胞比例（N%）為87.87% ± 8.53%，C-反應蛋白（CRP）為（155.72 ± 13.26）mg/L，降鈣素原（PCT）為（3.83 ± 0.83）ng/mL，急性生理與慢性健康評分（APACHE II評分）為（16.73 ± 6.57）分；對照組男29 例、女27 例，年齡（60.91 ± 11.84）歲，BMI（20.65 ± 2.83）kg/m2，有吸煙史26 例，合并基礎疾病43 例，行 機 械 通 氣 治 療45 例，PO2（62.73 ±8.37）mmHg，PaO2/FiO2（198.97 ± 13.24）mmHg，WBC（18.26 ± 5.13）×109/L，N%（86.96 ± 7.97）%，CRP（157.73 ± 14.25）mg/L，PCT（3.76 ± 0.95）ng/mL，APACHE Ⅱ評分（17.38 ± 7.19）分。兩組上述指標比較，P均＞0.05。

1.2 病原體檢測的宏基因二代測序法 患者均由5年以上操作經(jīng)驗的纖支鏡醫(yī)師完成纖支鏡肺泡灌洗術；患者在咪達唑侖靜脈鎮(zhèn)靜下，經(jīng)氣管插管或鼻腔進鏡，2% 利多卡因氣道黏膜表面麻醉，選取病變嚴重的段支氣管，將支氣管鏡頂端嵌頓在支氣管樹分支，注入生理鹽水60～120 mL 灌洗，然后以100 mmHg 負壓抽吸，回收率40%～60%，回收的灌洗液裝入滅菌容器中，灌洗液培養(yǎng)樣本量不少于10 mL。實驗組患者肺泡灌洗液樣本收集后立即干冰保存送深圳華大基因行mNGS 檢測（DNA 檢測），mNGS 標本的采集、保存和運輸嚴格按照該公司標準化規(guī)范執(zhí)行。

取3～5 mL 肺泡灌洗液置于離心試管中，將試管置于4 ℃環(huán)境中，以4000 r/min 高速離心10 min，按照TIANamp Micro DNA Kit（DP316，天根生化科技（北京）有限公司）試劑盒說明書提取DNA。將提取到的樣本DNA 超聲破碎至150 bp 左右的片段。使用Agilent 2100 Bioanalyzer 質(zhì)控文庫插入片段大小為200～300 bp，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific Inc）質(zhì)控DNA文庫濃度，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結構。環(huán)化后的文庫經(jīng)滾環(huán)復制生成DNB 納米球。制備好的DNB 納米球加載到測序芯片，使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000 進行測序。測序數(shù)據(jù)下機后去除低質(zhì)量短片段（長度＜35 bp）獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。通過BWA（BWA：http：//bio-bwa.sourceforge.net/）測序分析軟件將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對到人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除。剩下的數(shù)據(jù)在去除低復雜度序列后與細菌、真菌、病毒、寄生蟲4 個微生物大數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數(shù)，根據(jù)序列數(shù)的高低以及臨床其他檢測來判斷可能的病原體。患者根據(jù)肺泡灌洗液mNGS結果調(diào)整抗感染方案。

對照組患者肺泡灌洗液標本送本院檢驗醫(yī)學中心行一般細菌、真菌培養(yǎng)，并根據(jù)肺泡灌洗液培養(yǎng)結果及其他檢查結果調(diào)整抗感染方案。

1.3 mNGS 應用效果的評定 比較兩組病原體檢出率。治療結束后比較兩組患者抗生素的使用時間、機械通氣時間、住院日、住院費用、臨床療效、病死率的差異。臨床療效評價采用三級標準。治療第二周參照金平珍等［4］文獻公布的標準，分顯效、有效、無效3 級，顯效和有效合計為總有效。顯效：體溫、呼吸道癥狀及體征、實驗室檢查（包含血象、CRP、PCT）均恢復正常，影像學恢復正?；虼蟛糠治眨ú∽兾铡?0%）。有效：體溫、呼吸道癥狀及體征、實驗室檢查均恢復正常或明顯好轉，影像學有吸收。無效：體溫、呼吸道癥狀及體征、實驗室檢查至少有一項改善不明顯甚至惡化，或一度改善后又惡化，影像學無吸收或進展；有效率=（顯效+ 有效）/總例數(shù)×100%。統(tǒng)計患者28 d病死率。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料用Shapiro-Wilk 法進行正態(tài)分布檢驗，如符合正態(tài)分布以±s表示，比較采用兩個樣本獨立的t檢驗；如為偏斜分布數(shù)據(jù)則以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)（%）表示，比較使用χ2檢驗。用Kaplan-Meier方法得出累積有效率和病死率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 mNGS 在重癥肺炎病原體檢測中的應用效果實驗組檢出細菌26例（銅綠假單胞菌4例，肺炎克雷伯菌5例，鮑曼不動桿菌6例，肺炎鏈球菌2例，金黃色葡萄球菌4例，嗜肺軍團菌2例，奴卡氏菌1例，黏質(zhì)沙雷菌1 例，洋蔥伯克霍爾德菌1 例），真菌14 例（白色念珠菌4例，耶氏肺孢子菌6例，煙曲霉4例），病毒6例（人類皰疹病毒1型3例、人類皰疹病毒5型2 例、巨細胞病毒1 例），鸚鵡熱衣原體4 例，結核分枝桿菌1例，堪薩斯分枝桿菌1例。對照組檢出細菌22例（銅綠假單胞菌4例，肺炎克雷伯菌5例，鮑曼不動桿菌6例，肺炎鏈球菌2例，金黃色葡萄球菌4例，黏質(zhì)沙雷菌1例），真菌7例（白色念珠菌4例，煙曲霉菌3 例）。實驗組灌洗液mNGS 病原體檢測陽性率92.85%（52 例/56 例），對照組灌洗液培養(yǎng)陽性率51.78%（29例/56例），兩組比較，χ2=23.59，P＜0.05。

2.2 mNGS 在重癥肺炎病原體治療方案制定中的應用效果 ①兩組臨床療效比較：治療2 周后實驗組顯效29 例、有效21 例、無效6 例；對照組顯效14例、有效28例、無效14例。實驗組、對照組有效率分別 為89.29%、75.00%，兩 組比 較，χ2=3.895，P=0.048。②兩組機械通氣時間、抗菌藥物使用時間、抗菌藥物調(diào)整頻次、ICU 停留時間、住院日、住院費用比較：兩組抗菌藥物使用時間、抗菌藥物調(diào)整頻次、ICU 停留時間、住院日、住院費用比較，t 分別為3.851、5.095、11.717、4.155、5.094、5.306，P 均＜0.05，見表1。 ③病死率：實驗組患者死亡6 例（10.71%），對照組患者死亡10例（17.85%），兩組病死率比較，χ2=1.037，P=0.308。

表1 兩組機械通氣時間、抗菌藥物使用時間、抗菌藥物調(diào)整頻次、ICU停留時間、住院時間、住院費用（±s）

表1 兩組機械通氣時間、抗菌藥物使用時間、抗菌藥物調(diào)整頻次、ICU停留時間、住院時間、住院費用（±s）

組別實驗組對照組n 5656機械通氣時間（d）8.69 ± 4.7312.35 ± 5.31抗菌藥物使用時間（d）16.43 ± 2.7119.46 ± 3.53抗菌藥物調(diào)整頻次（次）2.36 ± 0.533.71 ± 0.68 ICU停留時間（d）10.69 ± 4.6414.75 ± 5.65住院時間（d）18.46 ± 2.6421.93 ± 4.36住院費用（萬元）6.61 ± 1.057.92 ± 1.52

3 討論

重癥肺炎高病死率與約60% 患者不能明確感染病原體有關［5］，感染病原體不明嚴重影響了經(jīng)驗性抗感染治療效果，盡早明確感染病原體并進行針對性抗感染是治療重癥肺炎的關鍵。傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)條件要求高、周期長、陽性率低，且抗生素使用影響其培養(yǎng)［6］；因此，臨床亟需新的檢測技術來快速、準確找到感染病原體，給予精準抗感染治療，改善患者預后。

mNGS能一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，能夠檢測出可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物的基因序列，繞過了微生物的分離和培養(yǎng)過程，具有病原體檢出陽性率高、快速、靈敏度高等特點，且不受宿主因素、抗生素及激素使用等因素的影響［7-9］。本研究中實驗組灌洗液mNGS病原體檢出率達92.85%，明顯高于對照組的51.78%。實驗組患者感染病原體占比由高到低依次為細菌、真菌、病毒、其他病原體，細菌中以革蘭陰性菌為主，革蘭陰性菌中又以銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌為主，革蘭陽性菌以金黃色葡萄球菌為主。因此，對重癥肺炎經(jīng)驗性抗感染時可考慮抗銅綠假單胞菌的β-內(nèi)酰胺類藥物、氟喹諾酮類藥物，必要時加用萬古霉素。實驗組檢出真菌14例，我們發(fā)現(xiàn)這些患者均為長期使用激素或免疫抑制劑或免疫力低下人群，對這類患者應常規(guī)完善G 試驗、GM 試驗檢查，盡早經(jīng)驗性抗真菌治療；另外，該組中檢出耶氏肺孢子菌6 例（42.85%），臨床上經(jīng)驗性抗感染可考慮予伏立康唑聯(lián)用復方磺胺甲噁唑。實驗組檢測出奴卡氏菌、結核分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等少見病原體，而這些病原體傳統(tǒng)培養(yǎng)條件要求極高，一般需在結核病?？漆t(yī)院培養(yǎng)，提示mNGS 可提高少見病原體的檢出率。孫雯雯等［10］報道m(xù)NGS 診斷肺結核的敏感度為59%，顯著高于涂片法（15%）和培養(yǎng)法（26%），但與Xpert 法（52%）比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.090）?？娗嗟龋?1］研究報道，mNGS 對非結核分枝桿菌感染的診斷價值與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比無顯著優(yōu)勢（24.7%vs.21.9%），考慮與非結核分枝桿菌較難破壁以及不同公司的破壁技術有關，他們建議改進對該類菌的檢測技術。對于大量的非結核病?？漆t(yī)院而言，mNGS 在非結核分枝桿菌的檢測中仍然有很好的應用價值。本研究中有4例重癥肺炎患者最后通過mNGS 確診為鸚鵡熱衣原體感染，據(jù)報道鸚鵡熱衣原體肺炎占社區(qū)獲得性肺炎約1%［12］，傳統(tǒng)的血清學檢測或PCR 檢測敏感性、特異性均不高，且該病原體極難培養(yǎng)，以前受限于檢測條件的限制大部分患者被漏診或誤診，隨著mNGS 技術的推廣該病越來越多被報道［13-15］；對有禽類接觸史，以發(fā)熱、乏力、肌肉酸痛等流感樣癥狀為主的肺炎患者應考慮該病可能，可予多西環(huán)素或喹諾酮類經(jīng)驗性治療。病毒在醫(yī)院的普通實驗室極難培養(yǎng)，對于病毒性肺炎的診斷一直是臨床難題，既往多通過病毒核酸或抗體檢測，而這兩種方法敏感性、特異性均不令人滿意，臨床多結合病史、胸部CT 表現(xiàn)進行經(jīng)驗性診斷，對患者的準確診斷、診療均嚴重滯后。本研究中實驗組檢出病毒感染6例，而對照組未檢出病毒，說明mNGS在病毒感染的診斷中具有較好的效果。

肺炎患者大部分病原體診斷不明，尤其重癥患者需長期、大劑量使用廣譜抗生素，使得病原菌對抗菌藥物的耐藥率不斷升高，這是當前亟待解決的全球性問題。本研究顯示，通過mNGS 及早明確病原體，及時調(diào)整治療方案，明顯降低了抗菌藥物調(diào)整頻次及使用時間，這給抗菌藥物的管理提供了一個新的方向。隨著技術的進步，我們期待mNGS 能對耐藥基因進行檢測，更好指導臨床抗感染治療。同時發(fā)現(xiàn)，實驗組臨床治療有效率更高，住院時間、住院費用更低，改善患者預后的同時減少了其經(jīng)濟負擔。在ICU 患者中機械通氣時間越長，發(fā)生呼吸機相關院感的風險越高。本研究中實驗組患者呼吸機使用時間、ICU 停留時間明顯縮短，大大降低了發(fā)生院感的風險。上述結果均提示mNGS 在指導重癥肺炎患者治療方案的選擇上起到了積極的作用。本研究中對照組患者病死率高于實驗組，但差異無統(tǒng)計學意義，考慮可能與樣本量偏少有關。

綜上所述，mNGS 應用于重癥肺炎患者能提高病原體檢出率，提高患者臨床療效，縮短抗生素使用時間、機械通氣時間，減少住院時間及住院費用。但本研究為單中心研究，尚有不足之處，期待更大樣本量的多中心研究驗證。