富氫液腹腔注射對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠急性肺損傷的預(yù)防作用及其機(jī)制

王樹(shù)志，李麗華，付乃寬

天津市胸科醫(yī)院，天津市心血管病研究所心功能科，天津 300222

心肌缺血/再灌注損傷是急性冠脈綜合征、心外科手術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)、心肺復(fù)蘇等臨床治療中常見(jiàn)并發(fā)癥。心肌缺血/再灌注損傷時(shí)過(guò)度炎性反應(yīng)釋放大量炎性因子，可經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至其他重要臟器［1］。遷移的炎性因子可誘導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞活化聚集并浸潤(rùn)肺組織，進(jìn)一步釋放大量炎性因子，產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，表現(xiàn)為肺上皮細(xì)胞損傷、毛細(xì)血管通透性改變及肺水腫等［2-3］。氫氣作為自然界最小的分子，具有明顯的抗氧化、抗炎及抗凋亡作用［4］。研究表明，2% 氫氣吸入可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激來(lái)減輕膿毒癥小鼠肺損傷［5］。血紅素氧合酶-1（HO-1）是一種內(nèi)源性保護(hù)蛋白，其具有明顯的抗氧化、抗炎及抑制細(xì)胞凋亡等作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)，氫氣治療可通過(guò)上調(diào)HO-1抑制炎癥反應(yīng)來(lái)減輕膿毒癥小鼠肺損傷［7］。然而，目前尚無(wú)富氫液對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠急性肺損傷影響的研究。2019年6—12月，我們?cè)诖笫笮募∪毖?再灌注急性肺損傷前給予富氫液，觀察大鼠肺損傷程度以明確富氫液是否具有預(yù)防肺損傷作用，同時(shí)檢測(cè)炎性因子以及HO-1，以探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 成年雄性SD 大鼠（220～250 g，中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要試劑：鋅原卟啉（ZnPPIX，Sigma 公司，美國(guó)），ELISA 試劑盒（Elabscience 公司，武漢），蛋白定量試劑盒（Bio-Rad公司，美國(guó)），蘇木素染液（邁新生物有限公司，福州），一抗鼠單抗HO-1（Abcam 公司，英國(guó)），兔單抗β-actin（華安公司，杭州），羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗（中杉金橋生物有限公司，北京）。主要儀器：DW-2000 型動(dòng)物呼吸機(jī)（嘉鵬科技有限公司，上海），生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（泰盟軟件有限公司，成都），GCH-500 型高純氫氣發(fā)生器（同普分析儀器科技有限公司，天津），MK3 酶標(biāo)儀（Thermo 公司，美國(guó)），光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司，日本），Gel-pro 圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics公司，美國(guó)）。

1.2 大鼠分組、心肌缺血/再灌注模型建立及富氫液腹腔注射 SD 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為心肌缺血/再灌注+ 富氫液+ HO-1 抑制劑組（抑制劑組）、心肌缺血/再灌注+ 富氫液組（HS組）、心肌缺血/再灌注組（I/R組）和假手術(shù)組（S組）各18例。

采用冠脈結(jié)扎術(shù)建立心肌缺血/再灌注急性肺損傷模型［8］，腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠后，氣管插管行機(jī)械通氣，皮下電極監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。大鼠開(kāi)胸后置于手術(shù)臺(tái)穩(wěn)定10 min，以利于大鼠適應(yīng)，于左鎖骨中線處切開(kāi)胸壁，分離左前降支并穿線，穩(wěn)定10 min后結(jié)扎其30 min，松開(kāi)結(jié)扎線再灌注120 min，左前降支結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)：心前區(qū)變白，心電圖ST 段弓背向上抬高（＞0.12 mV），再灌注成功標(biāo)準(zhǔn)：ST段下降1/2以上，心尖復(fù)紅。

抑制組大鼠在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)前30 min腹腔注射鋅原卟啉（25 mg/kg），于再灌注前5 min腹腔注射富氫液10 mL/kg［9］（使用GCH-500 高純氫氣發(fā)生器制備氫氣，將生理鹽水置于高純氫氣環(huán)境中，在0.4 MPa 壓力下暴露4 h，至氫飽和狀態(tài)，γ 射線消毒滅菌。富氫液含氫濃度為0.6 mmol/L）。HS組大鼠于再灌注前5 min 腹腔注射富氫液10 mL/kg。I/R 組大鼠分離左冠狀動(dòng)脈前降支并結(jié)扎30 min 后，松開(kāi)結(jié)扎線再灌注120 min。S組大鼠僅穿線不結(jié)扎。心肌缺血/再灌注誘導(dǎo)急性肺損傷模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)：BALF、肺濕/干重比增加：肺血管通透性和肺水腫程度增加；肺組織病理學(xué)檢查：肺細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)和肺泡水腫，肺泡內(nèi)及肺泡壁充血、實(shí)變，肺間質(zhì)滲出嚴(yán)重。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 大鼠BALF 總蛋白檢測(cè) 再灌注2 h 時(shí)，取上述大鼠麻醉后，用0.5 mL PBS灌洗右側(cè)肺，重復(fù)3次，收集灌洗液，4 ℃下1500×g 離心15 min，取上清液，采用蛋白定量試劑盒測(cè)定大鼠BALF總蛋白。

1.3.2 大鼠肺組織病理評(píng)分測(cè)算 再灌注2 h，取上述大鼠左肺組織，甲醛固定6 h，石蠟包埋切片后，行蘇木素—伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡（×40）下觀察肺組織病理改變，評(píng)分包括肺組織水腫、充血、中性粒細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)、肺泡內(nèi)出血、實(shí)變及增生情況，每項(xiàng)評(píng)分按損傷程度分為0、1、2和3分，取各項(xiàng)評(píng)分總和。

1.3.3 大鼠肺組織濕/干重比檢測(cè) 再灌注2 h時(shí)，每組取6只大鼠，麻醉后取左肺組織，生理鹽水充分漂洗，濾紙吸干多余水分，稱(chēng)濕重，恒溫干燥箱80 ℃烘烤24 h稱(chēng)干重，計(jì)算肺組織濕/干重比值（W/D）。

1.3.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10 檢測(cè) 再灌注2 h時(shí)，每組取6只大鼠，采集下腔靜脈血樣2 mL，4 ℃下3000×g 離心15 min，取血清。參照ELISA 試劑盒檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-10。

1.3.5 大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-10 和HO-1 檢測(cè) 再灌注2 h 時(shí)，取上述大鼠右肺組織，勻漿后，4 ℃下10000×g 離心15 min，取上清液。參照ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-10和HO-1。

1.3.6 大鼠肺組織HO-1 蛋白檢測(cè) 采用Westerm blotting 法。再灌注2 h 時(shí)，每組取6 只大鼠，麻醉后取左肺組織并稱(chēng)重，加入含蛋白酶抑制劑RIPA 裂解液，勻漿，4 ℃下14000 r∕min離心15 min，取上清為總蛋白。BCA 法蛋白定量后保存于-80 ℃冰箱備用。 取50 μg 蛋白樣品，加入4×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，然后進(jìn)行凝膠電泳1 h，轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入一抗鼠單抗HO-1（稀釋度1∶1000）和兔單抗β-actin（稀釋度1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗5次×5 min，加入羊抗小鼠二抗（稀釋度l∶2000）或羊抗兔二抗（稀釋度1∶2000），室溫孵育1 h，ECL 顯影，采用Gel-pro 圖像分析軟件測(cè)定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin 灰度值的比值來(lái)反映目的蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)性分布檢驗(yàn)采用shapiro-Wilk法，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以xˉ± s 表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BALF 總蛋白含量、肺組織病理評(píng)分及肺W/D 比較 與S 組相比，I/R 組、HS 組、抑制劑組大鼠BALF 總蛋白含量、肺組織病理評(píng)分及肺W/D 均高（P均＜0.05），提示肺組織出現(xiàn)損傷。與I/R組相比，HS組大鼠BALF總蛋白含量、肺組織病理評(píng)分和肺W/D 均低（P均＜0.05）。與HS 組相比，抑制劑組大鼠BALF 總蛋白含量、肺組織病理評(píng)分及肺W/D均高（P均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺組織BALF總蛋白含量、肺組織病理評(píng)分、W/D比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織BALF總蛋白含量、肺組織病理評(píng)分、W/D比較（±s）

注：與S 組比較，aP ＜0.05；與I/R 組比較，bP ＜0.05；與HS 組比較，cP＜0.05。

組別抑制劑組HS組I/R組S組BALF總蛋白（mg/mL）5.13 ± 0.82ac 2.67 ± 0.52ab 6.16 ± 0.68a 0.42 ± 0.08肺組織病理評(píng)分（分）8.67 ± 1.24ac 4.54 ± 1.32ab 9.85 ± 1.57a 0.62 ± 0.36 W/D 5.82 ± 0.67ac 4.26 ± 0.56ab 6.52 ± 0.53a 3.14 ± 0.26

2.2 各組大鼠血清和肺組織TNF-α、IL-1β及IL-10水平比較 與S組相比，I/R組、HS組、抑制劑組大鼠血清和肺組織TNF-α、IL-1β和IL-10水平均高（P均＜0.05）。與I/R組相比，HS組大鼠血清和肺組織TNF-α、IL-1β水平均低，IL-10水平高（P均＜0.05）。與HS組相比，抑制劑組大鼠血清和肺組織TNF-α、IL-1β水平均高，IL-10水平低（P均＜0.05），見(jiàn)表2、表3。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較（±s）

注：與S組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05；與HS組比較，cP＜0.05。

組別抑制劑組HS組I/R組S組TNF-α（pg/mL）289.56 ± 33.59ac 186.73 ± 24.53ab 335.15 ± 32.87a 15.36 ± 1.85 IL-1β（pg/mL）315.57 ± 34.63ac 201.72 ± 6.91ab 365.63 ± 38.28a 19.62 ± 1.94 IL-10（pg/mL）33.36 ± 8.23ac 62.95 ± 7.56ab 30.56 ± 4.27a 16.62 ± 1.34

表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較（±s）

注：與S組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05；與HS組比較，cP＜0.05。

組別抑制劑組HS組I/R組S組TNF-α（pg/mg·prot）573.43 ± 38.62ac 313.37 ± 36.56ab 626.86 ± 45.48a 19.45 ± 2.04 IL-1β（pg/mg·prot）603.33 ± 42.86ac 336.26 ± 32.84ab 653.35 ± 48.54a 26.36 ± 3.45 IL-10（pg/mg·prot）47.36 ± 4.12ac 95.39 ± 5.52ab 45.74 ± 4.35a 13.34 ± 1.25

2.3 各組大鼠肺組織HO-1 水平比較 與S 組相比，I/R組、HS組、抑制劑組大鼠肺組織HO-1蛋白濃度和水平均高（P均＜0.05）。與I/R組相比，HS組大鼠肺組織HO-1 蛋白濃度和水平均高（P均＜0.05）。與HS 組相比，抑制劑組大鼠肺組織HO-1 蛋白濃度和水平低（P均＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠肺組織HO-1蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠肺組織HO-1蛋白水平比較（±s）

注：與S組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05；與HS組比較，cP＜0.05。

組別抑制劑組HS組I/R組S組HO-1蛋白（pmol/mg）9.3 ± 2.1ac 19.6 ± 4.5ab 9.8 ± 1.8a 4.5 ± 0.9 HO-1蛋白1.64 ± 0.13ac 1.96 ± 0.18ab 1.65 ± 0.16a 1.00 ± 0.00

3 討論

冠脈結(jié)扎術(shù)是建立心肌缺血/再灌注損傷的經(jīng)典模型。心肌缺血/再灌注時(shí)造成心肌損傷的同時(shí)可激活機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)并釋放大量炎性因子，炎性因子經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)作用于相鄰和遠(yuǎn)端臟器［3］。急性肺損傷是指各種因素導(dǎo)致的彌漫性肺間質(zhì)和肺泡水腫，主要表現(xiàn)為肺順應(yīng)性降低、滲出性病變等。本研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血/再灌注后大鼠支氣管肺泡灌洗液總蛋白濃度高，肺W/D 高，表明肺血管通透性和肺水腫程度增加；同時(shí)肺組織病理學(xué)檢查顯示肺細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)和肺泡水腫，肺泡內(nèi)及肺泡壁充血、實(shí)變，肺間質(zhì)滲出嚴(yán)重，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明大鼠心肌缺血/再灌注后發(fā)生了急性肺損傷。

缺血/再灌注早期，炎癥因子經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)至肺組織，可誘導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞聚集，發(fā)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，還可激活肺組織發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞損傷、肺毛細(xì)血管通透性增加、肺水腫等。因此，調(diào)控炎癥介質(zhì)的釋放是改善心肌缺血/再灌注后自身和遠(yuǎn)隔臟器損傷的關(guān)鍵因素。炎性反應(yīng)中，不同炎性因子可發(fā)揮不同作用：促炎因子TNF-α、IL-1β 等可促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)展，放大炎性效應(yīng)；抗炎因子IL-10 等則能抑制炎性細(xì)胞的活性，減輕炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果表明心肌缺血/再灌注后，I/R 組大鼠血清和肺組織促炎因子TNF-α和IL-1β含量明顯增高，與肺組織損傷表現(xiàn)一致，而血清和肺組織抗炎因子IL-10也部分增高，表明心肌缺血/再灌注同時(shí)激活了肺組織的促炎和抗炎反應(yīng)，并與肺組織損傷密切相關(guān)。

氫氣作為一種新型的醫(yī)療作用氣體分子，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡以及調(diào)控基因表達(dá)和信號(hào)通路等作用，其已被證實(shí)對(duì)多種疾病具有防治作用。 研究發(fā)現(xiàn)，富氫液可通過(guò)抑制TLR4/MyD88 信號(hào)通路來(lái)降低肺組織TNF-α、IL-1β 等炎性因子水平，改善大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn)于心肌缺血/再灌注后，給予富氫液處理組大鼠血清和肺組織促炎因子TNF-α、IL-1β 含量明顯降低，抗炎因子IL-10 明顯增高，肺組織損傷明顯減輕，表明富氫液可抑制心肌缺血/再灌注誘發(fā)的肺組織炎性反應(yīng)，并促進(jìn)抗炎反應(yīng)。

HO 是機(jī)體對(duì)抗損傷、細(xì)胞應(yīng)激、炎癥等傷害性刺激的重要保護(hù)系統(tǒng)。HO-1 能催化血紅素代謝生成膽綠素、鐵和一氧化碳，這些代謝產(chǎn)物均有抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用。研究表明氫氣治療可通過(guò)上調(diào)HO-l來(lái)抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕膿毒癥小鼠肺損傷，而給予HO-1 抑制劑ZnPPIX 后可部分逆轉(zhuǎn)氫氣對(duì)膿毒癥肺損傷的保護(hù)作用［7］。此外，腹腔注射ZnPPIX（25 mg/kg）也可明顯抑制脂聯(lián)素對(duì)膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)給予富氫液處理后，心肌缺血/再灌注大鼠肺組織HO-1 蛋白濃度和水平均明顯提高，炎癥水平明顯降低，抗炎水平提高；而給予HO-1 抑制劑ZnPPIX 后，肺組織HO-1蛋白濃度和水平均顯著減低，炎癥水平又明顯升高，抗炎水平降低，表明富氫液可減輕心肌缺血/再灌注大鼠肺組織炎癥，并與上調(diào)HO-1有關(guān)。

綜上所述，富氫液處理可明顯減輕心肌缺血/再灌注大鼠肺組織損傷，其機(jī)制可能與上調(diào)HO-1減輕肺組織炎性反應(yīng)有關(guān)。因此，富氫液可能是預(yù)防心肌缺血/再灌注誘導(dǎo)急性肺損傷的一種有效措施。