氟伐他汀對高糖環(huán)境中培養(yǎng)的原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷改善作用及其機制

雷永芳，林敏華，汪余嘉，聶雪坤，林小惠，陳子春

寧德師范學院附屬寧德市醫(yī)院臨床藥學室，福建 寧德 352100

糖尿病已成為繼腫瘤與心血管疾病之后第三大嚴重威脅人類健康的慢性疾病［1］。該病引發(fā)的微血管及大血管并發(fā)癥，可造成患者中風、截肢、失明甚至死亡等嚴重不良后果［2-3］。研究提出，內(nèi)皮功能障礙是糖尿病患者誘發(fā)并加重糖尿病血管病變的重要危險因素，可獨立預測心血管疾病風險［4］。FORSTERMANN等［5］研究提出氧化應激是誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥主要因素之一，持續(xù)的氧化應激可促進血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)展［6］。據(jù)報道，Ⅲ型組蛋白去乙酰化酶（SIRT1）是代謝性疾病的關鍵因子，對調(diào)控細胞內(nèi)氧化應激、衰老及凋亡等起重要作用［7-8］。上調(diào)SIRT1 可有效防御高糖引起的氧化應激反應，消除高糖引起的內(nèi)皮細胞損傷。因此，SIRT1 可能具有抵抗高糖誘導血管內(nèi)皮功能障礙的作用，激活SIRT1 相關信號通路有望成為糖尿病血管并發(fā)癥的重要防治策略。研究顯示，他汀類藥物除調(diào)脂功能還具有如抑制血小板功能、減輕炎癥及氧化應激等多效性作用［9-10］。其中，氟伐他汀（Flu）是第一個具有抗氧化活性的全合成他汀，在改善糖尿病誘導血管內(nèi)皮氧化損傷方面具有潛在的臨床作用。糖尿病及血管內(nèi)皮損傷作為動脈粥樣硬化的前驅(qū)因素，在疾病發(fā)展過程中存在較多交叉機制［11-12］。研究提出，SIRT1 在他汀對冠狀動脈粥樣硬化性心血管的保護作用中起重要作用［13］，但SIRT1 在他汀對糖尿病血管疾病中的作用機制卻尚未完全闡明。2020年6月—2021年5月，本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細胞為實驗對象，觀察Flu 對高糖環(huán)境培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞活力及氧化應激的影響，并分析SIRT1在Flu改善高糖誘導血管內(nèi)皮損傷中的作用，為他汀類藥物防治糖尿病血管病變提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人臍靜脈內(nèi)皮細胞從寧德市醫(yī)院產(chǎn)科健康足月孕婦計劃性剖腹產(chǎn)所剝離胎盤上的臍帶中分離培養(yǎng)所得，該研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。ECM 培養(yǎng)基，購自美國ScienCell公司；Flu、葡萄糖粉末，購自美國Sigma 公司；Alexa Fluor 647 標記山羊抗兔、DAPI，購自上海碧云天；MTS試劑盒，購自美國Promega公司；活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒，均購自南京建成生物工程公司；血管性血友病因子（VWF）購自美國Cell Signaling Technology 公司；SIRT1、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1（FOXO1）、SOD2 mRNA 引物，均購自上海生工生物工程公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑、染料法PCR 試劑盒，購自美國Promega 公司。CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國ThermoFisher Scientific 公司；超凈工作臺購自上海Heal Force公司；超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技公司；熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；流式細胞儀購自美國BD 公司；酶標儀購自美國Molecular Devices 公司；熒光定量PCR 儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)及Flu 的給予方法人臍靜脈內(nèi)皮細胞用含10% FBS 的ECM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)至3～5 代可開始構(gòu)建模型。首先將人臍靜脈內(nèi)皮細胞隨機分組，各組細胞在處理前均用不含F(xiàn)BS 的ECM 培養(yǎng)基饑餓處理24 h。Flu + 高糖組分別在含30.5 mmol/L葡萄糖培 養(yǎng) 基 中 加 入0.01、0.1、0.125、0.25、0.5、1.0 μmol/L Flu 干預12 h；高糖組用含30.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；Flu組在常規(guī)培養(yǎng)的基礎上加入0.01、0.1、0.125、0.25、0.5、1.0 μmol/L Flu 干預12 h；對照組常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力檢測 采用MTS法。各組細胞接種于96 孔板中，貼壁培養(yǎng)，加入20 μL MTS，培養(yǎng)箱中避光孵育2 h。酶標儀預熱30 min，波長設為490 nm 測定吸光度值（A）。細胞活力=（A 給藥-A 空白）÷（A 對照-A 空白）×100%。根據(jù)細胞活力值，后續(xù)實驗中Flu + 高糖組中Flu 的濃度選定0.25、0.5、1.0 μmol/L。

1.4 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞中ROS、MDA、SOD、CAT、GSH 檢測 ROS 檢測采用流式細胞術。收集各組細胞并加入1 mL 熒光探針DCFH-DA，培養(yǎng)箱中孵育30 min。無血清培養(yǎng)基清洗，消化收集細胞沉淀。500 μL PBS 吹打均勻，流式細胞儀檢測各組細胞內(nèi)的熒光強度，ROS水平以給藥組熒光度/對照組熒光度表示。

MDA、SOD、CAT、GSH 檢測采用化學比色法。收集各組細胞，1000 g 離心10 min，棄上清，留細胞沉淀。加入200 μL PBS 輕輕混勻，采用超聲破碎儀處理，收集各組細胞破碎混懸液。按照MDA、SOD、CAT、GSH 試劑盒說明書分別處理細胞破碎液，依次加入各組試劑及顯色劑，處理的各組混合液取200 μL置于96孔板中。酶標儀測定各孔OD值。

1.5 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞中SIRT1、FOXO1、SOD2 mRNA 檢測 采用RT-PCR 法。 收集各組細胞，TRIzol 提取細胞中總RNA。分光光度計檢測RNA 濃度，按說明書在RNA 中加入逆轉(zhuǎn)錄試劑，PCR 儀反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再采用實時定量PCR 儀擴增。根據(jù)試劑盒要求設置PCR 條件：95 ℃、2 min預變性，熱循環(huán)95 ℃、15 s，退火溫度50～60 ℃（根據(jù)引物情況設置：SIRT1 為50 ℃；FOXO1 為53 ℃；SOD2 與ACTB 為60 ℃），時間均為60 s，40 個循環(huán)。ACTB 引物生工提供；SIRT1 上游引物序列為5’ACTGTGAAGCTGTACGAGG3’，下游引物序列為5’CTGAAACATGAAGAGGTGTG3’；FOXO1 上游引物序列為5’AAACACCAGTTTGAATTCACCC3’，下游引物序列為5’TCGACTTATTGTCCTGAAGTGT3’；SOD2 上游引物序列為5’GGCTTTGGGGTATCTGGGCT3’，下游引物序列為5’TGGTACTTCTCCTCGGTGACGTT3’。每組3 個復孔，以ACTB 為內(nèi)參，根據(jù)2－ΔΔCt公式計算目的基因mRNA相對表達情況。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。采用Shapiro-Wilk方法進行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。方差齊性檢驗采用F檢驗評估。當方差齊時，LSD 檢驗比較組間差異；方差不齊時，Games-Howell 檢驗比較組間差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力比較 Flu組加入0.01、0.1、0.125、0.25、0.5、1.0 μmol/L Flu 后，細胞活力分別為99.52% ± 7.84%、98.62% ± 1.73%、100.29% ± 1.80%、101.40% ± 4.50%、102.83% ±6.02%、105.78% ± 4.38%，對照組為100%，F(xiàn)lu組與對照組比較，P均＞0.05。 高糖組細胞活力為72.80% ± 1.37%。Flu + 高糖組加入0、0.01、0.1、0.125、0.25、0.5、1.0 μmol/L Flu 后細胞活力分別為72.80% ± 0.69%、73.01% ± 0.85%、72.22% ±0.95%、75.67% ± 1.87%、85.46% ± 1.60%、89.55% ± 2.01%、99.04% ± 2.81%，0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L Flu 各組相比高糖組細胞活力明顯提高（P均＜0.05）。

2.2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)ROS、MDA、SOD、CAT、GSH 水平的比較 與對照組比較 高糖組ROS、MDA、GSH 水平升高，SOD、CAT 水平降低（P均＜0.05）。 與 高 糖 組 比 較，F(xiàn)lu + 高 糖 組 加 入0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L Flu后細胞內(nèi)ROS 水平降低（P＜0.05）；加入1.0 μmol/L Flu 后細胞內(nèi)MDA、GSH 水平降低，SOD 與CAT 水平提高（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞內(nèi)ROS、MDA、SOD、CAT、GSH水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05。

組別Flu + 高糖組0.25 μmol/L Flu 0.5 μmol/L Flu 1.0 μmol/L Flu高糖組對照組ROS 1.73 ± 0.12#1.08 ± 0.07#1.12 ± 0.03#2.31 ± 0.04*1.00 MDA（nmol/mg·prot）3.42 ± 0.203.67 ± 0.312.28 ± 0.01#3.71 ± 0.05*2.01 ± 0.23 SOD（U/mg·prot）32.31 ± 0.3738.19 ± 1.82#36.41 ± 0.95#31.63 ± 1.46*38.44 ± 1.65 CAT（U/mg·prot）14.31 ± 0.1719.81 ± 0.53#17.91 ± 0.76#14.52 ± 0.21*21.62 ± 0.48 GSH（μmol/mg·prot）70.31 ± 4.68#52.70 ± 3.20#42.87 ± 0.63#96.19 ± 3.77*69.46 ± 3.43

2.3 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)SIRT1、FOXO1、SOD2 mRNA相對表達量比較 與對照組比較，高糖組中SIRT1、SOD2 mRNA 相對表達量下降（P均＜0.05）；與高糖組比較，F(xiàn)lu + 高糖組加入1.0 μmol/L Flu 后SIRT1、SOD2 mRNA 相對表達量升高（P均＜0.05）。各組FOXO1 mRNA 相對表達量比較，P均＞0.05。見表2。

表2 各組SIRT1、FOXO1、SOD2 mRNA 相對表達量比較（±s）

表2 各組SIRT1、FOXO1、SOD2 mRNA 相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05。

組別Flu + 高糖組0.25 μmol/LFlu 0.5 μmol/L Flu 1.0 μmol/L Flu高糖組對照組SIRT1 mRNA 0.78 ± 0.221.30 ± 0.252.46 ± 0.54#0.70 ± 0.09*1.00 FOXO1 mRNA 1.00 ± 0.131.00 ± 0.121.26 ± 0.130.93 ± 0.021.00 SOD2 mRNA 1.10 ± 0.301.26 ± 0.11#1.42 ± 0.14#0.82 ± 0.04*1.00

3 討論

2 型糖尿病發(fā)病率逐年增高，且并發(fā)癥較多。其中，血管并發(fā)癥是最常見疾病之一，也是2型糖尿病患者的主要致死原因［14］。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖誘發(fā)的內(nèi)皮功能障礙是糖尿病心血管事件的主導因素，但機制不明。本研究擬深入研究高血糖誘導血管內(nèi)皮功能障礙的作用機制，探索有效的治療藥物，為防治上述疾病提供理論依據(jù)。

血管內(nèi)皮是存在于血管壁與血流之間的一層保護屏障，由單層的內(nèi)皮細胞構(gòu)成［15］。本研究從人臍靜脈中分離獲取原代血管內(nèi)皮細胞，并利用免疫熒光化學法鑒定血管內(nèi)皮細胞的生物標志因子VWF。結(jié)果顯示，VWF 在分離培養(yǎng)的細胞中表達顯著，提示分離細胞為人臍靜脈內(nèi)皮細胞。

Flu為經(jīng)典的調(diào)脂藥物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用［16-17］。前期研究顯示，F(xiàn)lu 對波動高糖誘導的血管內(nèi)皮損傷具有保護作用［18］。同時有報道指出0.01～0.1 μmol/L 的Flu 可阻止H2O2誘導的內(nèi)皮細胞凋亡［19］。本研究將人臍靜脈內(nèi)皮細胞置于30.5 mmol/L 的高糖中培養(yǎng)，以構(gòu)建糖尿病體外模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖可顯著降低人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力，而0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L Flu可明顯改善高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷。

機體長期處于高血糖環(huán)境可產(chǎn)生過多ROS，且ROS 持續(xù)或過量產(chǎn)生，可氧化蛋白質(zhì)、脂類和核酸，產(chǎn)生有毒衍生物，進而誘導血管內(nèi)氧化應激反應，影響胰島素分泌，加劇糖尿病血管病變［20-21］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖組細胞中的ROS 水平升高；與高糖組比較，F(xiàn)lu + 高糖組加入0.25、0.5、1.0 μmol/L Flu 后細胞內(nèi)ROS 水平降低，提示Flu可改善高糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞的氧化反應。MDA 可作為細胞內(nèi)氧化應激的重要標志物，而抗氧化酶SOD、CAT、GSH 等是抵御氧化應激的重要生物酶［22］。上調(diào)抗氧化酶的表達可保護細胞免受ROS攻擊，改善細胞內(nèi)氧化應激狀態(tài)。本研究結(jié)果表明，高糖處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞可導致MDA、GSH 水平顯著升高，同時SOD、CAT 水平明顯下降；而Flu 干預后，可逆轉(zhuǎn)高糖誘導的氧化應激狀態(tài)。此外，本研究中GSH 異常表達可能是在高糖誘導的氧化效應下反應性升高，而Flu 干預后，GSH 也隨之下降，與ALVES-FERNANDES 等［23］相關研究結(jié)果一致，提示Flu 可通過增強人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的抗氧化防御機制，減輕高糖誘導的氧化損傷。

SIRT1 可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與激活因子，如FOXO1、核因子-κB（NF-κB）及腫瘤抑制基因P53等，參與氧化應激、炎癥及DNA 修復等過程［24-25］。上調(diào)SIRT1 可顯著改善人臍靜脈內(nèi)皮細胞的氧化損傷，研究發(fā)現(xiàn)，在以高糖高脂構(gòu)建的糖尿病小鼠中SIRT1 的表達明顯下調(diào)［7］。XU 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，激活SIRT1 可有效抵抗氧化誘導的內(nèi)皮細胞衰老，并促進血管生成。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)lu 可上調(diào)高糖中SIRT1 與SOD2 的mRNA 表達，但不影響FOXO1的mRNA 表達，這可能與SIRT1 對FOXO1 的去乙?；{(diào)控作用相關。因此，推測Flu 可能通過調(diào)控SIRT1 相關信號通路增強人臍靜脈內(nèi)皮細胞抗氧化作用，對高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷起保護作用。

綜上，在高糖環(huán)境下，F(xiàn)lu 可能通過上調(diào)SIRT1表達從而提高抗氧化酶含量并降低ROS 水平，發(fā)揮提高人臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞活力、抵抗氧化應激反應、改善高糖誘導的血管內(nèi)皮功能障礙的作用。但是Flu 在高糖環(huán)境下調(diào)控SIRT1 的具體機制及對SIRT1/FOXO1/SOD 信號通路的影響仍需進一步探索。