TGF-β1 通過腎素(前體)受體和V-ATP 酶誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化

龍作鵬 程麗慧 符微微 宋科秀

T(三亞市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，海南 三亞 572000)

腹膜透析(PD)是一種腎臟替代療法，具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，但是腹膜纖維化可改變腹膜功能并限制PD治療時(shí)間〔1〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是引起腹膜纖維化和人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)損傷的重要介質(zhì)〔2，3〕。TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞增殖并增加許多細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成。盡管瞬時(shí) TGF-β1活性增加參與組織的修復(fù)和再生，但持續(xù)的 TGF-β1刺激可導(dǎo)致組織過度纖維化〔4，5〕。無論是由感染、缺血、炎癥還是手術(shù)引起的腹膜損傷，都可導(dǎo)致腹膜纖維化，TGF-β1 是該過程的主要調(diào)節(jié)因子。腹膜損傷時(shí)組織和細(xì)胞同時(shí)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化和功能下降，如酸性細(xì)胞器(主要是溶酶體) 裂解。TGF-β1在傷口愈合和對(duì)傷害的反應(yīng)很重要，也是腹膜中關(guān)鍵的纖維生長因子并介導(dǎo)腹膜纖維化。腎素/腎素前體受體〔(P)RR〕可與腎素及腎素前體結(jié)合，增強(qiáng)組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活性，同時(shí)誘導(dǎo)非RAS 的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如在絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路中引起細(xì)胞增殖，上調(diào)促TGF-β1和纖維化因子等表達(dá)增加。 研究發(fā)現(xiàn)(P)RR的功能與V-ATP酶有重要聯(lián)系，參與細(xì)胞器酸化和細(xì)胞囊泡介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸〔6～8〕。(P)RR幾乎表達(dá)于體內(nèi)所有的組織中，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。TGF-β1已被證實(shí)可通過V-ATP酶介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路參與腎小管上皮細(xì)胞損傷〔9〕，然而TGF-β1與(P) RR、V-ATP酶是否參與腹膜纖維化的發(fā)生，目前尚不明確。本研究旨在探討 TGF-β1與(P)RR、 V-ATPase在 HPMC轉(zhuǎn)分化中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 山羊抗人(P) RR 抗體購自 Santa Cruz公司；小鼠抗人 V-ATPase 單克隆抗體、TGF-β1、TMEPAI純品購自 Sigma 公司；纖維化蛋白FBRS試劑盒購自大連生工；免疫熒光染色試劑盒購自索萊寶。

1.2HPMCs 的分離、培養(yǎng)、鑒定 從接受腹部手術(shù)患者的網(wǎng)膜組織收集 HPMCs。 所有患者簽署知情同意書。使用胰蛋白酶-EDTA方法分離 HPMCs，并在含有20%胎牛血清(FBS)的 M199 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過細(xì)胞角蛋白和血管平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA) 的免疫熒光染色來篩選 HPMCs 群體。為了最大限度地減少成纖維細(xì)胞的污染，使用鵝卵石形狀的 HPMCs，如果成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的含量>5%，則丟棄細(xì)胞。將細(xì)胞匯合鋪板并使其在含 1% FBS 的 M199 培養(yǎng)基中靜置 24 h以使其生長同步。通過摻入 5-溴-2脫氧尿苷(BrdU)來測(cè)量細(xì)胞增殖。

1.3分組

1.3.1TGF-β1處理HPMCs mRNA水平檢測(cè)將細(xì)胞以每孔 1×104細(xì)胞數(shù)接種在96孔板中，隨機(jī)分為下列各組：對(duì)照組(Con組，只加1% FBS 的 M199 培養(yǎng)基)，1 ng/ml TGF-β1組，2 ng/ml TGF-β1組，3 ng/ml TGF-β1組，4 ng/ml TGF-β1組，5 ng/ml TGF-β1組；每組又分為藥物刺激24 h、48 h和72 h 3個(gè)亞組，因此共檢測(cè)18個(gè)亞組中(P)RR和V-ATPase基因的表達(dá)。

1.3.2(P)RR-siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞以每孔1×104細(xì)胞數(shù)接種在96孔板中，(P)RR-siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞在1%FBS的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后用2 ng/ml TGF-β1處理 24 h。分組：共分為4組，Con組、TGF-β1刺激組、TGF-β1+si-N組(轉(zhuǎn)染非靶向siRNA)和TGFβ1+si-(P)RR〔轉(zhuǎn)染靶向(P) RR的siRNA〕組。以上每組4個(gè)復(fù)孔。

1.4細(xì)胞內(nèi)(P)RR 和 V-ATPase 的 Western 印跡 蛋白溶解液將細(xì)胞裂解后，取50 μg總蛋白以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜上，在室溫下用含3%牛血清白蛋白(BSA)和5%脫脂奶粉的封閉液封閉，分別與抗(P)RR單克隆抗體、抗V-ATPase多克隆抗體孵育雜交，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的多克隆山羊抗兔免疫球蛋白或山羊抗小鼠免疫球蛋白用作Western印跡分析的二抗。用ECL顯影劑顯影。通過光密度測(cè)定法定量陽性免疫反應(yīng)條帶，并與人β-actin 表達(dá)進(jìn)行比較。

1.5細(xì)胞內(nèi)(P)RR和V-ATPase基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA純度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA污染和降解狀況。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)說明書方法先逆轉(zhuǎn)錄合成第1條cDNA，再以此 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR，引物序列(P)RR：上游引物：5′-GACCTTTGCCATGTGCTTCCT-3′；下游引物：5′-CCAAAAAC-TATTCCAGCACCCA-3′；β-actin：上游引物：5′-CTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游引物：5′-CGCAACTAAGTCATAGTCCGCC-3′；V-ATPase：上游引物：5′-TCCGGAGCGCAAA TACTCTGT-3′，下游引物：5′-CCGGCTTCATCGTATTCCTGT-3′。 反應(yīng)條件為：預(yù)變性97℃30 s，變性92℃30 s，退火62℃ 30 s，延伸 72℃50 s，32 次循環(huán)，PAI-1循環(huán)27次，結(jié)束循環(huán)后再延伸72℃ 50 s，35℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離，進(jìn)行凝膠掃描和分析，以目的片段/內(nèi)參照GAPDH片段的條帶光密度的比值作半定量比較。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β1對(duì)HPMC中(P)RR和V-ATPase基因及蛋白表達(dá)的影響 (P)RR和V-ATPase mRNA 表達(dá)水平隨TGF-β濃度增加和孵育時(shí)間的延長而上調(diào)，且均顯著高于Con組(均P<0.05)。見圖1、表1。

2.2敲減(P)RR可抑制HPMCs中TGF-β1誘導(dǎo)的(P)RR 和 V-ATPase表達(dá)增加 TGF-β1組(4.23±0.98)、TGF-β1+si-N組(3.42±1.05)、TGF-β1+si-(P)RR組(2.48±0.56)組V-ATPase蛋白表達(dá)水平均顯著高于Con組(1.00±0.00，P<0.05)，且TGF-β1+si-(P)RR組V-ATPase蛋白表達(dá)水平顯著低于TGF-β1+si-N組(P<0.05)。見圖2。

圖2 (P)RR敲低降低TGF-β1誘導(dǎo)的V-ATPase蛋白表達(dá)水平

3 討 論

腹膜病變患者長期在高糖、細(xì)菌脂多糖、金葡菌腸毒素、終末糖基化產(chǎn)物、腹透液增塑劑、血管緊張素Ⅱ、多種炎性細(xì)胞因子等各種內(nèi)、外源性因素的刺激下，可以引起內(nèi)源性TGF-β1升高〔10〕，而TGF-β1是腹膜纖維化病變中最重要的促發(fā)因子之一。研究表明TGF-β1通過Smad3信號(hào)通路調(diào)節(jié)許多基因 (Collagen Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ，α-SMA等)表達(dá)，使腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生 EMT，最后導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展〔11〕。此外TGF-β1還可以活化MAPK的全部3條通路〔12〕。 研究發(fā)現(xiàn)MAPK 尤其是p38 MAPK通路與促進(jìn)ECM產(chǎn)生〔13，14〕和抑制ECM 降解的關(guān)系，說明MAPK作為TGF-β1的下游信號(hào)通路在纖維化病變機(jī)制中具有重要意義。(P)RR已被證明在組織RAS中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其自身細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)的作用在高血壓和糖尿病終末器官損傷的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。(P)RR的一個(gè)片段也被稱為ATP6AP2，與空泡H+-V-ATPase(V-V-ATPase)相關(guān)V-V-ATPase是一種多亞基質(zhì)子泵，參與細(xì)胞生理學(xué)的各種基本方面，包括受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和回收、蛋白質(zhì)和信號(hào)分子的加工、膜分選和運(yùn)輸以及溶酶體/自噬體酶的激活。(P)RR和V-V-ATPase定位于HPMCs酸性細(xì)胞器中。HPMCs酸性細(xì)胞器中的(P)RR和V-ATP酶在促纖維化分子細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)中發(fā)揮作用，在其他細(xì)胞中也有類似報(bào)告〔7，15〕。TGF-β1 及(P)RR、V-ATPase 都參與細(xì)胞纖維化中的作用。

綜上，TGF-β1可通過刺激(P)RR過表達(dá)途徑而促進(jìn)HPMC 的轉(zhuǎn)分化。通過RNAi技術(shù)干擾(P)RR基因表達(dá)，可以下調(diào)(P)RR 和V-ATPase蛋白表達(dá)，抑制HPMC 的轉(zhuǎn)分化。