組氨酸激酶BaeS對溶藻弧菌毒力因子和環(huán)境應激的作用

李瑩玉， 賀小賢， 蔣合陽， 曹娟娟， 肖 苗， 蘆 平， 劉 歡, 2*

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術研究院， 陜西 西安 710021)

0 引言

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是海水環(huán)境中一種常見的條件致病菌.該菌為兼性厭氧菌，具有進行液體條件下游動的極生鞭毛和固體表面爬動的周生鞭毛系統(tǒng)，無芽孢和莢膜，最適生長溫度為17 ℃～35 ℃.溶藻弧菌也是一種重要的食源性病原菌，主要分布在海洋、湖泊、河口和入?？诘人w環(huán)境中，由溶藻弧菌引起的魚體發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為出血癥，呈現(xiàn)為受感染的魚體行動變得遲緩，進食次數(shù)減少，皮膚暗淡無光，魚鱗開始掉落，魚體表面發(fā)生潰瘍甚至出血，同時魚體內(nèi)部的腹膜、肝臟、魚鰾以及腸壁毛細管出現(xiàn)充血現(xiàn)象.溶藻弧菌容易引起淺表傷口和耳部感染(中耳炎和外耳炎)，如果人食用了被溶藻弧菌污染的海產(chǎn)品，會引起食物中毒、腹瀉和腸胃炎等癥狀[1-3].為應對快速變化的環(huán)境，溶藻弧菌體內(nèi)進化出了多種感染機制，包括菌落相變、生物被膜和群體感應等[4-6].這些機制通過細菌體內(nèi)復雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡實現(xiàn)，而基因表達的調(diào)控包括表達過程的所有階段，即轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯以及翻譯后修飾[7，8].

雙組分系統(tǒng)(Two-component systems，TCS)是一種常見的細菌信號轉(zhuǎn)導通訊模式，它們在生物體內(nèi)感知和傳遞各種不同的輸入信號，對細胞外和細胞內(nèi)的環(huán)境變化進行適應性反應.在原核生物中，雙組分系統(tǒng)通常是由一個膜結合傳感器組氨酸激酶(Histitine kinase sensor,HK)和一個DNA結合響應調(diào)控元件(Responce regulator,RR)組成.當傳感器激酶感知胞外信號后會發(fā)生自磷酸化，隨后磷酸基團會轉(zhuǎn)移至響應調(diào)控元件，使其由“非活性”轉(zhuǎn)變?yōu)椤盎钚浴睜顟B(tài)，激活后的響應調(diào)控元件通過與靶標DNA的結合影響其轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)對不同細胞功能的調(diào)控[9，10].TCS廣泛參與調(diào)控細菌的各種生理功能，包括細胞生長繁殖、致病性、毒力因子表達、環(huán)境應激、營養(yǎng)獲取和代謝以及抗生素耐藥性等[11-15].細菌HK作為關鍵信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)TCS的組分，已成為新型抑菌劑的潛在靶標而備受關注[16].在大腸桿菌中，BaeSR是五大細胞壓力應激系統(tǒng)(BaeSR,CpxAR,RscBC,Psp和σE)之一，由組氨酸激酶BaeS和響應元件BaeR組成，參與多重耐藥性、趨化性、鞭毛合成、六型分泌系統(tǒng)合成、滲透壓、缺鐵應激等多種生理功能的調(diào)控[17-20].而關于BaeSR在溶藻弧菌中的作用尚未見報道.本文對溶藻弧菌組氨酸激酶BaeS進行序列分析以及突變株的構建，通過對毒力因子表達以及不同環(huán)境壓力下的生長分析，初步明確了BaeS對溶藻弧菌毒力、抗生素耐受性以及溫度、SDS、吐溫等不同環(huán)境應激的調(diào)控作用，為進一步研究BaeSR對溶藻弧菌生理功能的調(diào)控機制以及新型抑菌劑的開發(fā)奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗菌株、培養(yǎng)基及試劑

1.1.1 實驗菌株

溶藻弧菌EPGS(WT)，質(zhì)粒pDM4，大腸桿菌DH5α，DH5αλpir，SM10λpir均為實驗室保存；pDM19-T載體購于寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司.

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB培養(yǎng)基：1%(w/v)NaCl、1%(w/v)胰蛋白胨、0.5%(w/v)酵母提取物.

LBS培養(yǎng)基：3%(w/v)NaCl、1%(w/v)胰蛋白胨、0.5%(w/v)酵母提取物.

固體培養(yǎng)基則添加1.5%(w/v)瓊脂，溶藻弧菌在培養(yǎng)過程中添加氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)100μg/mL，大腸桿菌則根據(jù)質(zhì)粒特性添加對應的抗生素.

1.2 主要儀器與設備

Micro 17型低溫高速離心機，芬蘭賽默飛世爾科技有限公司；移液器，德國Eppendorf公司； WH-3型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DK-98 II型核酸定量儀，美國Quawell；Agilent 2100型生物電泳圖像分析系統(tǒng)，美國安捷倫；Varioskan Flash型酶標儀，芬蘭賽默飛世爾科技有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株生長條件

溶藻弧菌在LBS培養(yǎng)基30 ℃下培養(yǎng)，大腸桿菌在LB培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)，固體靜置，液體則在200 rpm下震蕩培養(yǎng).

1.3.2 氨基酸序列比對及結構域分析

將BaeS氨基酸序列提交至Interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)進行其保守結構域的分析，同時利用Genedoc軟件對不同細菌的BaeS氨基酸序列進行比對分析.

1.3.3ΔbaeS突變株的構建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的溶藻弧菌EPGS全基因組序列，以baeS基因為模板，設計上游同源臂引物對baeSup-F/R和下游同源臂引物對baeSdown-F/R，由北京擎科生物科技有限公司合成.利用Overlap PCR構建ΔbaeS片段后與pDM4進行連接重組，并依次轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αλpir和SM10λpir，挑取陽性克隆株并進行菌落PCR驗證，對重組克隆株進行保種.將溶藻弧菌WT與含有pDM4-ΔbaeS質(zhì)粒的大腸桿菌SM10λpir供體菌分別于30 ℃和37 ℃搖床活化培養(yǎng)后，接種至對應的新鮮液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.8左右，進行接合實驗，通過兩輪同源重組交換，篩選得到ΔbaeS突變株.

1.3.4 生長曲線的測定

將活化好的溶藻弧菌野生株WT和突變株ΔbaeS菌液濃度統(tǒng)一至OD600=1.0，按1%接種量分別將野生株WT和突變株ΔbaeS接種到50 mL LBS液體培養(yǎng)基中，同時添加100μg/mL Amp，30 ℃、200 rpm培養(yǎng)，每小時取樣測定OD600，連續(xù)取12 h，繪制生長曲線，至少做三次獨立重復實驗.

1.3.5 運動性的測定

對于運動性的測定參考鄧益琴等[21]的方法：將活化的菌液濃度調(diào)整至OD600=1.0，分別取2μL菌液，垂直懸空滴加到含有0.3%(軟平板)和1.5%(硬平板)瓊脂粉的LBS平板上，待菌液晾干后放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，硬平板倒置培養(yǎng)12 h，軟平板正置培養(yǎng)9 h，取出拍照.

1.3.6 生物被膜的測定

采用結晶紫染色法測定生物被膜的形成[22]，將活化后的菌液濃度稀釋至相同值(OD600=1.0)，用移液槍吸取30μL菌液滴加到含有10 mL LBS培養(yǎng)基的血清瓶中，放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)24 h，不可搖晃.輕輕地取出血清瓶，在每個血清瓶中滴入2%(w/v)結晶紫溶液，靜置5 min后倒出培養(yǎng)液，并用純凈水緩慢地沖洗血清瓶直至流出的水呈無色狀態(tài)，將血清瓶放置60 ℃干燥箱烘干，拍照保存；之后向每個血清瓶中加入1 mL 33%(v/v)冰乙酸溶解染色的生物被膜，在570 nm處測定其吸光值.每個菌株至少進行三個獨立重復實驗.

1.3.7 胞外蛋白酶活性測定

首先對溶藻弧菌胞外蛋白酶的活性進行定量檢測，將活化后的菌液濃度統(tǒng)一至OD600=1.0，用移液槍各吸取1.5 mL菌液于EP管中，4 ℃，5 000 rpm離心10 min，取1 mL上清液于血清瓶，再加入1 mL PBS(pH 7.2)和0.05 g天藍皮粉(HPA)，搖勻后于37 ℃搖床200 rpm培養(yǎng)2 h，離心后對上清液進行600 nm處吸光度的測定.同時采用含1%(w/v)脫脂奶粉的LBS平板定性測定胞外蛋白酶活性，將活化后的菌液濃度統(tǒng)一至OD600=1.0，分別吸取2μL菌液滴加到1%(w/v)脫脂奶粉的LBS平板上，待菌液晾干后，倒置于30 ℃培養(yǎng)24 h，拍照觀察透明圈大小.

1.3.8 對不同抗生素抗性實驗

將過夜培養(yǎng)的WT和突變株ΔbaeS菌液濃度調(diào)整為OD600=1.0，用新鮮的LBS培養(yǎng)基對菌液梯度稀釋(1、10-1、10-2、10-3、10-4)，分別吸取2μL菌液平行3次滴定到各含有25μg/mL四種抗生素(氯霉素、鏈霉素、克林霉素和卡那霉素)的LBS固體培養(yǎng)基上，待菌液晾干后，于30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)并拍照.

1.3.9 環(huán)境應激能力實驗

檢測溶藻弧菌WT和突變株ΔbaeS在不同環(huán)境下的生存能力，即在LBS固體培養(yǎng)基中添加不同物質(zhì)形成不同的環(huán)境壓力，包括不同NaCl含量：3%、5%、10% NaCl(v/v)；不同SDS含量：0.5%、1%、3%(w/v)；不同吐溫80含量：0.5%、1%、3%(w/v).步驟如下：將過夜培養(yǎng)的WT和突變株ΔbaeS菌液濃度調(diào)整為OD600=1.0，用新鮮的LBS培養(yǎng)基對菌液梯度稀釋(1、10-1、10-2、10-3、10-4)，分別吸取2μL菌液平行3次滴定到LBS固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)，觀察菌落生長情況，同時進行拍照.

1.3.10 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗重復至少3次，每次實驗設置3個平行；使用Origin9.1軟件作圖，顯著性水平為5%.

2 結果與討論

2.1 baeS序列分析

TCS通常由兩個元件組成，即感知外界信號的受體蛋白(組氨酸激酶)和將信號轉(zhuǎn)化為不同生理生化過程的響應蛋白，通常這兩個蛋白由相鄰近的基因編碼.圖1(a)為baeS基因(orf04422)在溶藻弧菌EPGS基因組中的位置，共由1 371 bp堿基組成.位于其上游的orf04421基因(666 bp)編碼響應調(diào)控元件，即TCS中的RR；其上游的orf04420基因(711 bp)編碼甘油磷酸二酯酶；位于baeS基因下游的orf04423基因(2 097 bp)則編碼TonB依賴型的鐵載體受體蛋白.可見，在溶藻弧菌中作為受體蛋白的BaeS及其響應元件是由兩個相鄰的基因編碼的.

不同的組氨酸激酶所含有的結構域差異較大，但是通常都含有以下三個結構域，即感應區(qū)域(HK_Sensor)，二聚化和組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶結構域(dimerization and histitine phosphotrasfer domain,DHp)，以及ATP結合和催化結構域(catalysis and ATP-binding domain,CA).此外，還含有如HAMP(在histidine kinases,adenylyl cyclases,methyl-accepting proteins,phosphatases中存在的結構域),PAS,GAF等信號轉(zhuǎn)導結構域[23].

利用Interpro在線分析了溶藻弧菌BaeS蛋白的結構域組成和細胞定位，結果如圖1(b)和(c)所示.溶藻弧菌BaeS除了含有HK_Sensor，DHp和CA三個基本結構域外，還含有HAMP結構域.其中，244位為保守的組氨酸位點(H)，在激酶狀態(tài)下HK將ATP中的磷酸基團轉(zhuǎn)移至該組氨酸位點，之后再轉(zhuǎn)移至RR中的天冬氨酸位點，從而改變RR的轉(zhuǎn)錄，酶解或調(diào)控活性.通過對其結構域細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，HK_sensor區(qū)域主要位于細胞周質(zhì)空間，其兩側(cè)為兩個跨膜區(qū)，HAMP、DHp以及CA區(qū)則位于細胞質(zhì)中.此外，對不同細菌中BaeS氨基酸序列進行了比對分析，結果如圖1(d)所示，BaeS在三個弧菌中保守性較高，溶藻弧菌(WP_005374264.1)與副溶血弧菌(WP_005459362.1)和哈氏弧菌(KIP66134.1)BaeS氨基酸序列的同源度分別達到82.45%和78.56%；與大腸桿菌(CAD6009838.1)和福氏志賀氏菌(AIL41268.1)BaeS氨基酸序列同源度分別為27.80%和28.16%，其中DHp結構域氨基酸組成較為保守，如組氨酸位點.

(a)baeS基因在溶藻弧菌EPGS基因組中的位置

(b)BaeS蛋白結構域分析

CM：細胞質(zhì)區(qū)；TM：跨膜區(qū)；NCM：周質(zhì)區(qū)(c)BaeS細胞定位分析

(d)BaeS氨基酸組成比對分析圖1 BaeS基因組定位以及生物信息學分析

2.2 ΔbaeS缺失株的篩選鑒定

通過Overlap PCR獲得缺失第4-279位堿基的片段，與自殺質(zhì)粒pDM4進行重組后接合至溶藻弧菌野生型菌株中，對兩次同源重組后的菌液進行PCR擴增，并以野生型菌株作為對照，結果如圖2所示.由圖可知，2號泳道的ΔbaeS突變株較1號泳道的野生株片段少約270 bp.為進一步確定敲除片段是否正確，對ΔbaeS缺失株進行基因組提取，并利用引物進行基因測序，結果發(fā)現(xiàn)ΔbaeS突變株第4-279位堿基缺失，表明ΔbaeS突變株成功構建.

2.3 BaeS對溶藻弧菌生長的影響

通過測定溶藻弧菌野生株WT和突變株ΔbaeS在LBS培養(yǎng)基中的吸光度，研究BaeS對溶藻弧菌生長的影響，結果如圖3所示.由圖可知，溶藻弧菌在LBS豐富培養(yǎng)基中生長迅速，經(jīng)過1 h的短暫適應期后便進入對數(shù)生長期，11 h后逐漸進入穩(wěn)定期.相比于溶藻弧菌野生株，ΔbaeS突變株雖然也能快速適應LBS培養(yǎng)基，但在對數(shù)期和穩(wěn)定期其生長受到明顯限制，菌體生長速度放緩，培養(yǎng)至12 h后菌液的吸光度僅為0.7左右，而野生株可達1.0左右.可見，BaeS對于溶藻弧菌在LBS豐富培養(yǎng)基中的生長具有一定的正調(diào)控作用.

圖3 溶藻弧菌野生株WT和ΔbaeS突變株在LBS中的生長情況

2.4 BaeS對溶藻弧菌運動性的影響

溶藻弧菌野生株WT和突變株ΔbaeS運動性檢測結果如圖4所示.野生株具有較強的游動和爬動能力，培養(yǎng)一定時間后可在平板上形成一定運動距離的菌落；而ΔbaeS在軟平板和硬平板上的運動能力均明顯降低，基本喪失了爬動能力.即BaeS對溶藻弧菌的游動和爬動能力均具有一定的促進作用.

圖4 WT和ΔbaeS突變株運動性測定

2.5 BaeS對溶藻弧菌生物被膜形成的作用

首先通過結晶紫染色法觀察生物被膜的產(chǎn)生情況，如圖5(a)所示.溶藻弧菌野生株可在試管壁上形成大量的生物被膜，突變株ΔbaeS生物被膜形成量明顯較野生株減少；之后用冰乙酸對生物被膜進行充分溶解，在570 nm處測定吸光值，結果如圖5(b)所示，突變株ΔbaeS生物被膜形成量較野生株減少.可見，BaeS參與溶藻弧菌生物被膜形成的調(diào)控過程.

(a)結晶紫染色法測定生物被膜

(b)核酸定量儀測定OD570處吸光值圖5 WT和ΔbaeS突變株生物被膜的形成

2.6 BaeS對溶藻弧菌胞外蛋白酶活性的調(diào)控作用

堿性絲氨酸蛋白酶Asp是溶藻弧菌主要的毒力因子.通過HPA定量測定了野生株WT和突變株ΔbaeS胞外蛋白酶的活性，結果如圖6(a)所示.野生株能夠產(chǎn)生大量的Asp，而basS基因缺失后，溶藻弧菌所分泌的Asp較野生株顯著降低(p≤0.05).此外，利用脫脂牛奶平板定性分析了酪蛋白酶產(chǎn)量的變化，結果發(fā)現(xiàn)突變株ΔbaeS菌落直徑雖變小，但是其仍可形成與野生株基本相同的透明圈，如圖6(b)所示.可見，BaeS促進溶藻弧菌Asp的表達，而對于酪蛋白酶的合成影響不大.

(a)堿性絲氨酸蛋白酶活性測定

(b)酪蛋白酶活性測定圖6 不同菌株胞外蛋白酶活性測定

2.7 BaeS對溶藻弧菌不同抗生素抗性的影響

選取四種抗生素氯霉素，鏈霉素，克林霉素和卡那霉素測試溶藻弧菌野生株WT和ΔbaeS突變株對抗生素的敏感性，結果如圖7所示.野生株和ΔbaeS突變株對氯霉素均具有高度的敏感性，在含有25μg/mL氯霉素平板上培養(yǎng)后，均未見任何生長.相比野生株而言，ΔbaeS突變株對其他三種抗生素(鏈霉素，克林霉素和卡那霉素)也表現(xiàn)出不同程度的敏感性；其中對克林霉素最敏感(圖7).由此可見，BaeS參與了溶藻弧菌耐受克林霉素的作用過程.TCS廣泛參與細菌抗生素耐受性的調(diào)控，可通過細胞表面修飾，減少藥物流入或增加藥物流出，上調(diào)抗生素降解酶的表達，或者通過形成生物被膜等其他耐藥形態(tài)來提高細菌對抗生素的耐受性[24].在大腸桿菌中，BaeSR通過上調(diào)MDR藥物外排泵實現(xiàn)對新生霉素的耐藥性[25].副溶血弧菌VbrKR則通過激活β-內(nèi)酰胺酶基因的表達實現(xiàn)對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐受性[26].溶藻弧菌BaeSR對克林霉素的耐受性的調(diào)控機制則需進一步深入研究.

圖7 溶藻弧菌對不同抗生素耐受性的分析

2.8 BaeS對溶藻弧菌不同環(huán)境應激能力的影響

TCS在細菌中普遍存在，對維持體內(nèi)平衡至關重要，使細菌能夠感知環(huán)境的變化并做出相應的反應.首先檢測了野生株WT和ΔbaeS突變株在不同鹽濃度下的生長情況，結果如圖8(a)所示.WT在0.5%、1.0%和3.0%(w/v)NaCl的平板上生長良好，但隨著鹽濃度的降低，在相同稀釋度下的生長有所降低.ΔbaeS突變株在3個不同鹽度下均能生長，但隨著鹽度的降低其菌落生長有所減弱；在相同鹽度下，ΔbaeS突變株的菌落生長較野生型有所減弱，在稀釋度為10-4時，在1.0%和3.0%(w/v)NaCl的平板上ΔbaeS突變株所形成的菌落較WT略顯稀疏，而在0.5%(w/v)NaCl平板上WT仍可生長，而ΔbaeS突變株已無肉眼可見的菌落形成，這可能是由于BaeS對溶藻弧菌生長影響所引起的.可見，溶藻弧菌作為一種嗜鹽菌，其生長隨著鹽度的降低而受到一定限制，而BaeS對溶藻弧菌在低鹽條件下的適應并無明顯的調(diào)控作用.

之后考察了不同濃度吐溫對溶藻弧菌野生株WT和ΔbaeS突變株生長的影響，結果如圖8(b)所示.由圖可以看到，WT在添加了吐溫的平板上可以生長，隨著吐溫濃度的增加，生長受到一定的抑制，在添加3%吐溫平板上WT所形成的菌落較低濃度下更為疏松.而ΔbaeS突變株的生長也隨著吐溫濃度的增加而有所減弱，但相較于相同水平下的WT而言，ΔbaeS突變株對吐溫具有較強的耐受性，在相同培養(yǎng)條件下所形成的菌落直徑明顯增大.可見，BaeS在溶藻弧菌響應外界吐溫壓力的過程中具有重要的調(diào)控作用.

在添加了不同濃度SDS平板上，WT均能較好地生長，且SDS濃度的增加對其生長的影響不顯著.而ΔbaeS突變株在0.5%SDS平板上生長與WT基本一致，但在1%和3%SDS平板上其生長受到明顯的抑制，尤其在3%SDS平板上，ΔbaeS突變株僅在未稀釋時形成菌落，稀釋10倍后便未有肉眼可見的菌落形成，見圖8(c)所示.可見，BaeS在溶藻弧菌響應SDS的生理過程中扮演著至關重要的角色.在金黃色葡萄球菌Newman中，SDS可以直接作用于SaeSR雙組份系統(tǒng)中組氨酸激酶SaeS，影響其激酶/磷酸酶活性，改變下游基因的表達，從而降低金黃色葡萄球菌對SDS的耐受[27].下一步可以深入研究SDS是否也能直接作用于BaeS影響其激酶/磷酸酶活性，從而調(diào)控溶藻弧菌在SDS壓力下的響應活性.

(a)不同鹽濃度對WT和ΔbaeS突變株生長的影響

(b)不同濃度吐溫對WT和ΔbaeS突變株生長的影響

(c)不同濃度SDS對WT和ΔbaeS突變株生長的影響圖8 WT和ΔbaeS突變株在不同環(huán)境壓力下的生長情況

3 結論

(1)成功構建了無標記基因缺失突變株ΔbaeS.BaeS含有HK_Sensor，HAMP，DHp和CA四個結構域，244位為進行磷酸化的組氨酸位點，此外，還含有兩個TM結構域.溶藻弧菌BaeS氨基酸組成與副溶血弧菌和哈氏弧菌具有較高的相似度.

(2)BaeS對溶藻弧菌的生長和不同毒力因子，包括運動性、堿性絲氨酸蛋白酶、生物被膜等具有正向調(diào)控作用.

(3)BaeS對溶藻弧菌克林霉素耐受性以及對吐溫、SDS等環(huán)境變化的應激能力具有重要的調(diào)控作用.