低共熔溶劑對燕麥蛋白質(zhì)提取的影響

朱振寶， 梁珍珍， 易建華

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

燕麥(Oat，學(xué)名 Avena sativa L.)為禾本科(Gramineae)燕麥屬(Avena)糧食作物.據(jù)統(tǒng)計(jì)，燕麥總產(chǎn)量在谷物中排名第六位[1].燕麥中蛋白質(zhì)含量較高，可達(dá)13%～20%，營養(yǎng)價(jià)值豐富，人體利用率高[2]，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源[3,4].目前提取蛋白質(zhì)常用的方法為堿溶酸沉法和酶法.堿溶酸沉法需要反復(fù)離心和調(diào)整pH，不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且蛋白質(zhì)容易變性，生產(chǎn)過程中不環(huán)保[5]；酶法提取蛋白質(zhì)條件比較溫和，但是存在生產(chǎn)成本高，蛋白質(zhì)提取率低等缺點(diǎn)，不能保持蛋白質(zhì)原有活性.因此亟需開發(fā)新的植物蛋白提取工藝和方法，實(shí)現(xiàn)綠色、環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展的理念.

低共熔溶劑(Deep Eutectic Solvents，DESs)是近年來興起的一種物化性質(zhì)類似離子液體的新型綠色溶劑.2003年，Abbott等[6]首次提出并合成低共熔溶劑.由于DESs具有生物降解性、可持續(xù)性、低毒性[7]等諸多優(yōu)點(diǎn)，引起人們高度關(guān)注.DESs主要是由氯化膽堿[8](Choline chloride，ChCl)等氫鍵受體(hydrogen bond acceptor，HBA)和多元醇、羧酸等氫鍵供體(hydrogen bond donor，HBD)按一定摩爾比組合而成[9]的兩組分或三組分低共熔混合物，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化學(xué)合成、電沉積、萃取分離、電化學(xué)等諸多領(lǐng)域.

目前,關(guān)于DESs提取植物蛋白質(zhì)的研究如下：Ronny等[10]以羧酸鹽/尿素(1∶2，10%水)合成DESs提取啤酒糟中的蛋白質(zhì)，提取率為79%；Ester等[11]以氯化膽堿/醋酸合成DESs提取石榴皮蛋白質(zhì)，提取率最高為20 mg/g；Aleksandra等[12]以氯化膽堿/甘油(2∶1)合成DESs提取油籽餅蛋白質(zhì)，菜籽餅和月見草餅中蛋白質(zhì)提取率達(dá)20%和35%；Liu等[13]用超聲波-微波輔助氯化膽堿/聚乙二醇合成的DESs提取南瓜籽蛋白質(zhì)，提取率可達(dá)93.95%；Yue等[14]以氯化膽堿/丁二醇異構(gòu)體合成DESs提取燕麥蛋白質(zhì)，結(jié)果表明，氯化膽堿/1,4-丁二醇/水(1∶3∶1)對燕麥蛋白質(zhì)的提取效果較好，蛋白質(zhì)含量、溶解度、發(fā)泡性和穩(wěn)定性均最好.

本文在前人研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究不同DESs體系對燕麥蛋白質(zhì)提取的影響，并系統(tǒng)探究了提取工藝條件(溫度、時(shí)間、含水量、料液比)對燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量和回收率的影響，以期實(shí)現(xiàn)DESs對燕麥蛋白質(zhì)的高效提取和綠色開發(fā)，為其它植物蛋白質(zhì)的利用提供新的思路.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

燕麥(晉燕17)，購買于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；氯化膽堿(C5H14ClNO)、乙二醇(CH2OH2)、1,3-丙二醇(C3H8O2)、1,4-丁二醇(C4H10O2)，購買于上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀，購買于天津市天力化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、硫酸鋅，購買于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.以上試劑均為分析純.

1.1.2 主要儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海力晨邦西儀器科技有限公司；H1850離心機(jī)，湘儀離心機(jī)有限公司；FD-1D-50冷凍干燥機(jī)，上海比郎儀器制造有限有限公司；SPH120消解儀、KN580全自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司；COSUDI高速多功能粉碎機(jī)，武漢海納電器有限公司；WZZ-2A自動(dòng)旋光儀，上海易測儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 燕麥的預(yù)處理

將顆粒飽滿、成熟的裸燕麥用多功能粉碎機(jī)粉碎.查閱文獻(xiàn)[15]可知，燕麥過篩目數(shù)越大，蛋白質(zhì)含量越低.燕麥麩皮上蛋白質(zhì)含量最高.因此，后續(xù)研究采用未過篩的燕麥粉.

1.2.2 燕麥基本成分測定

(1)灰分測定：采用GB 5009 4-2016灰化法.

(2)蛋白質(zhì)測定：采用GB 5009 5-2016凱氏定氮法.

(3)粗脂肪測定：采用GB 5009 6-2016索氏抽提法.

(4)水分測定：采用GB 5009 3-2016恒重法.

(5)粗淀粉含量測定：采用1%鹽酸旋光法.

1.2.3 DESs提取燕麥蛋白質(zhì)的方法步驟

參考文獻(xiàn)[12]所述方法并稍作改動(dòng).分別稱取5 g燕麥和45 g DESs混合，在集熱式恒溫磁力攪拌器80 ℃，500 r/min攪拌2 h.冷卻至室溫后，3 500 r/min離心10 min，取上清液，將上清液轉(zhuǎn)移至300 mL錐形瓶中.沉淀物用DESs(3×5 g)再次洗滌、3 500 r/min離心10 min，洗滌并離心3次除去其它可能的雜質(zhì).并將上清液移至錐形瓶中.

上清液加入250 mL去離子水，4 ℃冰箱放置12 h.6 500 r/min離心10 min，收集沉淀物；每次分別用20 mL去離子水洗滌沉淀物并離心、重復(fù)3次使其純度更高.沉淀物用冷凍干燥機(jī)干燥.沉淀物即為提取的粗蛋白質(zhì).制備的蛋白質(zhì)樣品放于干燥器中保存.將上述用低共熔溶劑制備的燕麥蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn).

1.2.4 不同DESs體系及不同DESs摩爾比對燕麥蛋白質(zhì)提取條件選擇

按照1.2.3中方法，將燕麥和DESs的料液比設(shè)置為1∶9，提取時(shí)間為120 min，提取溫度為80 ℃.將氯化膽堿和乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇按照摩爾比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4混合，觀察是否可以合成DESs及是否可以提取燕麥蛋白質(zhì).

1.2.5 蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)得率、提取率、回收率的計(jì)算

用凱氏定氮儀測定蛋白質(zhì)含量，得率、提取率、回收率分別按照式(1)～(3)計(jì)算:

(1)

(2)

(3)

式(1)、(2)、(3)中：W1-凍干蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)；W2-粗燕麥蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)；P1-提取的蛋白質(zhì)含量(%)；P2-燕麥中的蛋白質(zhì)含量(%).

1.2.6 脫脂與否對燕麥蛋白質(zhì)提取的影響

采用正己烷對燕麥進(jìn)行脫脂，按1∶3(w/v)比例室溫震蕩3 h[16]、風(fēng)干、備用.用DESs分別對脫脂與未脫脂燕麥來提取蛋白質(zhì)，并測定蛋白質(zhì)含量.綜合考慮得率、提取率、蛋白質(zhì)含量和回收率四個(gè)指標(biāo)確定是否脫脂.

1.2.7 DESs提取燕麥蛋白質(zhì)單因素實(shí)驗(yàn)

將氯化膽堿/乙二醇按照摩爾比為1∶3制備DESs，時(shí)間為40 min、60 min、80 min、100 min、120 min；溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃；料液比為1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13；含水量為0%、5%、10%、15%、20%(體積比).分別考察各個(gè)因素對燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量和回收率的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 燕麥基本組成成分

本研究對燕麥基本成分測定結(jié)果如表1所示.從表1可知，燕麥成分含量最高為淀粉，達(dá)60.02%；其次蛋白質(zhì)含量達(dá)13.61%，高于常見谷物中的蛋白質(zhì).另外，燕麥水分、脂肪、灰分含量分別為10.22%、7.94%、2.25%.

表1 燕麥的基本成分

2.2 DESs的制備

根據(jù)章節(jié)1.2.3所述方法，從表2可知，三種組合中，摩爾比為1∶2、1∶3、1∶4的氯化膽堿/乙二醇可以合成DESs；摩爾比為1∶3、1∶4的氯化膽堿/1，3-丙二醇、氯化膽堿/1，4-丁二醇可以合成DESs.其它較高濃度的DESs(1∶1和1∶2)的混合物在高溫下為液態(tài)，室溫下恢復(fù)為固態(tài).表明高濃度的氯化膽堿不能和多元醇相互作用，合成DESs.原因可能是摩爾比為1∶1和1∶2的氯化膽堿與多元醇形成DESs的氫鍵相互作用較弱[17].也可能是氯化膽堿/多元醇混合后粘度較高，不利于形成DESs.因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取DESs摩爾比為1∶3和1∶4的氯化膽堿/醇基(乙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇)三種組合.

表2 DESs是否可以合成及DESs是否可以提取蛋白質(zhì)

2.3 不同種類和不同摩爾比DESs對燕麥蛋白質(zhì)提取的影響

為了探究最佳DESs體系對燕麥蛋白質(zhì)提取的影響，分別將氯化膽堿與多元醇按照摩爾比為1∶3和1∶4混合，不同DESs體系對燕麥蛋白提取的結(jié)果如表3所示.

由表3可知，不同種類DESs對燕麥蛋白質(zhì)提取順序依次為氯化膽堿/乙二醇>氯化膽堿/1,3-丙二醇>氯化膽堿/1,4-丁二醇.其中，氯化膽堿/乙二醇對燕麥蛋白質(zhì)的提取率和蛋白質(zhì)含量最高，分別達(dá)到79.43%和50.34%.

從表3還可以看出，以氯化膽堿/乙二醇合成的DESs提取蛋白質(zhì)，摩爾比為1∶3的提取率要比1∶4提取率高，但蛋白質(zhì)含量無顯著差異.從節(jié)約成本考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇氯化膽堿/乙二醇(摩爾比1∶3)作為DESs最佳組合.

表3 不同種類DESs對燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量和回收率的影響

2.4 DESs對脫脂燕麥和未脫脂燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量、回收率的影響

脫脂與否對燕麥蛋白提取的結(jié)果如表4所示.從表4可知，燕麥脫脂后，蛋白質(zhì)含量由48.82%提高到57.79%；但蛋白質(zhì)得率由11.38%降低到3.91%,提取率由83.84%降低到26.19%.

表4 DESs對脫脂燕麥和未脫脂燕麥蛋白質(zhì)提取的影響

這可能是因?yàn)槲疵撝帑溨械鞍踪|(zhì)和脂肪共同沉淀，使未脫脂燕麥蛋白質(zhì)提取率高，蛋白質(zhì)含量低.先前研究發(fā)現(xiàn)油體蛋白是一種穩(wěn)定性籽粒蛋白，在大豆蛋白的等電點(diǎn)pH為4.5[18].因此，在蛋白質(zhì)沉淀過程中，未經(jīng)過脫脂的燕麥粉，油體蛋白和球蛋白共沉淀，從而使提取的蛋白質(zhì)存在更多的油.所以未脫脂燕麥粉比脫脂燕麥粉提取的蛋白質(zhì)得率、提取率高，而蛋白質(zhì)含量低.

回收率是綜合考慮得率和蛋白質(zhì)含量兩個(gè)因素，未脫脂燕麥蛋白質(zhì)回收率為40.85%；而脫脂燕麥蛋白質(zhì)回收率為15.30%，從成本考慮，選擇未脫脂燕麥進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.5 DESs對燕麥蛋白質(zhì)提取的工藝條件

2.5.1 提取時(shí)間對燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量、回收率的影響

提取時(shí)間對燕麥蛋白質(zhì)的影響如圖1所示.從圖1可知，提取時(shí)間對蛋白質(zhì)得率沒有顯著影響.從40 min到100 min，蛋白質(zhì)含量在增加，40 min時(shí)蛋白質(zhì)含量為46.48%，100 min時(shí)蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到52.84%；100 min到120 min，蛋白質(zhì)含量沒有顯著變化；當(dāng)時(shí)間為120 min時(shí)，蛋白質(zhì)含量為52.17%.蛋白質(zhì)含量隨著提取時(shí)間降低的原因可能是在80 ℃的高溫下，較長的時(shí)間可以促進(jìn)燕麥中β-葡聚糖的溶出，從而降低蛋白質(zhì)含量.

從圖1還可知，從40 min到80 min，得率從10.16%增加到12.05%，從80 min到120 min，得率反而下降.綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇提取時(shí)間為100 min.

圖1 提取時(shí)間對燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量、回收率的影響

2.5.2 溫度對燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量、回收率的影響

已有文獻(xiàn)報(bào)道燕麥蛋白質(zhì)平均變性溫度為102 ℃[19]，燕麥淀粉平均糊化溫度為86.98 ℃[20].當(dāng)選擇溫度為90 ℃時(shí)，DESs可以從5 g燕麥粉提取約1.2 g物質(zhì)，經(jīng)推理，提取的物質(zhì)更多的為雜質(zhì).因此，選擇溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃來研究DESs對蛋白質(zhì)的得率、提取率、含量、回收率的影響.

從圖2可知，燕麥蛋白得率、提取率隨著溫度升高而增加.溫度從40 ℃升高到80 ℃，得率由8.4%增加到10.9%，提取率由61.80%增加到79.81%.而蛋白質(zhì)含量隨著溫度升高而降低.從40 ℃到80 ℃，蛋白質(zhì)含量由54.80%降低到48.73%.這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，淀粉的粘稠度逐漸增加甚至糊化，不易與蛋白質(zhì)分離；也可能是因?yàn)槠渌s質(zhì)溶出的緣故.

圖2 溫度對燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量、回收率的影響

當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，得率9.6%、提取率為70.64%、蛋白質(zhì)含量為53.87%、回收率為38.05%，結(jié)果相對較好.綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇溫度50 ℃.

2.5.3 DESs含水量對燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量、回收率的影響

DESs的高粘度可能是由于化合物之間存在大量氫鍵，限制了DESs內(nèi)部物質(zhì)的遷移.還有如范德華力和靜電相互作用等其它作用力，也可能導(dǎo)致DESs[18]的高粘度.為了克服這一缺點(diǎn)，通常對DESs組分中加水進(jìn)行改性來降低其粘度.氯化膽堿可以溶解在醇和水的溶液中，在室溫下保持液態(tài).水可以作為共溶劑來增加與氯化膽堿之間的氫鍵，從而促進(jìn)DESs的形成[21].一定的含水量能降低DESs體系的粘度，增大溶劑與提取物質(zhì)的接觸面積，從而提高目標(biāo)物的提取率.

DESs體系含水量對燕麥蛋白得率、提取率、蛋白質(zhì)產(chǎn)量以及回收率的影響如圖3所示.總體上看，含水量對燕麥蛋白質(zhì)含量的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于溫度和時(shí)間等因素.由圖3可知，隨著DESs體系含水量的增加，燕麥蛋白質(zhì)含量顯著增加.當(dāng)含水量從0%增加到5%時(shí)，蛋白質(zhì)含量由53.87%提高到65.35%；當(dāng)含水量為15%時(shí)，蛋白質(zhì)含量為65.35%；但隨著含水量繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)含量并沒有隨之提高.

這可能是因?yàn)樗倪^量加入削弱DESs各組分之間的氫鍵相互作用[22].而且本研究表明，隨著含水量繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)提取率有所降低.因此本實(shí)驗(yàn)選含水量為15%的DESs來提取燕麥蛋白質(zhì).

圖3 DESs含水量對燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量、回收率的影響

2.5.4 料液比對燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量、回收率的影響

不同料液比對燕麥蛋白質(zhì)影響如圖4所示.從圖4可知，燕麥蛋白得率、提取率隨著料液比的增大而降低.當(dāng)料液比為1∶5時(shí)，其得率、提取率分別為10.28%、75.55%；而料液比為1∶13時(shí)，燕麥得率、提取率分別降至5.7%和41.93%.其原因可能是料液比值低時(shí)，粘稠度較大，DESs更易滲入到燕麥中，有利于提取蛋白質(zhì).離心分離時(shí)，黏稠度較大的上清液中蛋白質(zhì)含量更多.隨著料液比值增大，料液粘稠度變小，離心時(shí)上清液中蛋白質(zhì)含量少.

圖4 料液比對燕麥蛋白質(zhì)得率、提取率、蛋白質(zhì)含量、回收率的影響

總體而言，料液比對蛋白質(zhì)含量影響不顯著，其變化范圍為61.89%～64.96%.綜合考慮，本研究選取1∶7為最佳料液比.

3 結(jié)論

本文研究DESs體系對燕麥蛋白質(zhì)的分離工藝，實(shí)驗(yàn)確定了最佳DESs體系組成為：摩爾比為1∶3、含水量為15%的氯化膽堿/乙二醇合成的DESs.結(jié)果表明不同的DESs體系和含水量對燕麥蛋白質(zhì)提取影響較大，而料液比、溫度、時(shí)間等工藝條件對其影響較小.較佳工藝為：料液比1∶7、溫度50 ℃、時(shí)間100 min，在此條件下，燕麥蛋白得率可達(dá)8.26%、提取率為60.7%、蛋白質(zhì)含量為64.37%、蛋白質(zhì)回收率為39.07%.

該法具有操作簡單、成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)勢，可以為其它植物蛋白質(zhì)或天然產(chǎn)物提取提供技術(shù)支持.