HPLC法同時測定不同產地牛大力中3種化合物的含量

陳 明，施雪敏，周小平，石克鴻，張志鋒，張劍光*

(1.欽州市衛(wèi)生學校，廣西 欽州 535000；2.西南民族大學 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤的MillettiaSpeciosaChamp.的干燥根，主要分布于廣西、廣東、海南等地，為嶺南地區(qū)藥食兩用植物。牛大力性平味甘，具補虛潤肺、強筋活絡之功效，可用于治療腰肌勞損、肺虛咳嗽、風濕性關節(jié)炎等病癥。化學研究表明，牛大力的有效成分主要有黃酮類、生物堿、皂苷類等[1-3]。藥理研究發(fā)現(xiàn)，牛大力有較明顯的抗炎、免疫調節(jié)以及抗氧化屬性[4-6]。在我國，自古以來老百姓素有養(yǎng)生調理的飲食習慣，常以藥材煲湯作為藥膳首選。

目前，學者對牛大力的研究主要集中于栽培、化學成分提取分離鑒定、藥理活性等方面[7-12]，關于質量控制的報道較少。王春華等[13]采用RP-HPLC法測定牛大力中高麗槐素的含量；陳勇等[14]采用HPLC測定廣西牛大力中芒柄花素和高麗槐素的含量；彭富全等[15]采用HPLC法測定不同品種牛大力中刺桐堿、芒柄花素與高麗槐素的含量；但均是對栽培牛大力的含量測定，尚未見不同產地及野生與栽培牛大力含量差異研究的報道。鑒于此，本課題組采集兩廣不同地區(qū)30批野生和栽培牛大力(3年生)作為樣品，采用HPLC法測定野生與栽培牛大力中刺桐堿、芒柄花素及高麗槐素3個種化學成分的含量，旨在為栽培牛大力的質量控制、資源保護和可持續(xù)利用提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1220型高效液相色譜儀(二元梯度泵、手動進樣器、VWD紫外可見檢測器，美國安捷倫)，KH5200B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，METTLER AE240電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

乙腈(美國Fisher公司，色譜純)，乙醇(天津市大茂化學試劑廠，分析純)，冰醋酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純)，哇哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；刺桐堿(批號：19012210，四川維克奇生物科技有限公司)，芒柄花素(批號：wkq19013002，四川維克奇生物科技有限公司)，高麗槐素(批號：wkq19081905，成都曼思特生物科技有限公司)，30批次牛大力藥材分別采集于廣東、廣西等地，經筆者鑒定為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤的MillettiaspeciosaChamp.的根，采集時均為新鮮的藥材，切段后曬干，標本保存于欽州市衛(wèi)生學校藥劑實驗室。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%乙酸水溶液(B)；梯度條件：0～8 min，15%A；8～18 min，15%～32%A；18～28 min，32～42%；28～33 min，42%A；33～38 min，42%～50%A；38～40 min，50%A；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20μL。該色譜條件下，牛大力樣品的色譜峰分離效果好，HPLC圖譜見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取刺桐堿2.42 mg、芒柄花素1.98 mg、高麗槐素2.32 mg分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得刺桐堿、芒柄花素、高麗槐素的質量濃度分別為0.242 mg·mL-1、0.198 mg·mL-1、0.232 mg·mL-1的混合對照品溶液。

注：1.刺桐堿；2.芒柄花素；3.高麗槐素。圖1 混合對照品(A)和牛大力樣品(B)HPLC色譜

2.3 供試品溶液的制備

稱取牛大力粉末(過2號篩)約1 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，精密移取50%乙醇25 mL，稱定重量，超聲(超聲功率200 W，超聲頻率40 kHz)提取40 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補失重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品各對照品儲備液，再用甲醇稀釋后得到一系列混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，測定色譜峰面積，以對照品進樣量為橫坐標(X)，峰面積分之為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，結果表明各成分線性關系良好，結果見表1。

表1 3個對照品的回歸方程

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液20μL，按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，測定刺桐堿、芒柄花素、高麗槐素峰面積，計算其RSD分別為1.12%、0.76%、0.47%，試驗結果表明儀器精密性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取1號供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，分別在0、2、4、8、10、12、24 h進樣，測定刺桐堿、芒柄花素、高麗槐素峰面積，計算其RSD分別為1.71%、0.98%、1.75%，試驗結果表明供試品溶液在常溫下放置24 h內穩(wěn)定。

2.4.4 重復性試驗 稱取1號牛大力藥材粉末(過2號篩)，按照“2.3”項下方法平行制備得到供試品溶液6份，分別按“2.1”項下色譜條件進行測定，分別進樣，測定刺桐堿、芒柄花素、高麗槐素峰面積，計算平均質量分數(shù)的RSD分別為1.27%、1.58%、2.32%，試驗結果表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取1號牛大力粉末(過2號篩)各1.0 g，9份，精密稱定，分成3組，每組3份，各組分別加入對照品溶液適量(分別相當于藥材中各個對照品含量的80%、100%、120%)，按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備，按 “2.1”項下色譜條件進樣，計算各被測成分的加樣回收率和RSD。實驗結果見表2，刺桐堿、芒柄花素、高麗槐素的平均加樣回收率分別為 98.84%、99.11%、98.44%，RSD分別1.03%、1.21%、1.37%，表明加樣回收率良好。

表2 加樣回收率實驗結果

2.5 樣品的測定

稱取所收集的30批次待測樣品粉末(過2號篩)各1.0 g，精密稱定，每個樣品平行3份，按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備，按“2.1”項下色譜條件進行含量測定，結果見表3。表3結果顯示，刺桐堿的含量為0.384～2.631 mg·g-1；芒柄花素的含量為0.003 14～0.199 mg·g-1；高麗槐素的含量為0.008 83～0.302 mg·g-1。從測定結果分析，30批次牛大力樣品中，3種化學成分平均含量之間的差異較大，刺桐堿>高麗槐素>芒柄花素，其中刺桐堿含量遠高于其他兩種成分；不同生長方式(栽培和野生)中的3種化學成分平均含量，野生樣品中刺桐堿、高麗槐素的含量>栽培樣品，栽培樣品芒柄花素的含量>野生樣品，但同一化合物在野生與栽培的含量相差并不很大，說明不同栽培方式對牛大力藥材有效成分含量的影響不大，在一定程度上反映栽培是可行的；廣西產地栽培牛大力所測3個化合物的平均含量均高于廣東產地的牛大力，表明不同產地樣品含量存在一定差異，這種結果的出現(xiàn)可能與不同產地的環(huán)境、生長年份、氣候條件、栽培技術等因素有關，具體機理還有待進一步研究。

表3 30批次樣品含量測定結果

續(xù)表3

3 討論

本實驗通過單因素優(yōu)化，考察了不同提取方法、提取溶劑、料液比和提取時間等因素對3種成分含量的影響，最終選擇50%乙醇作為溶劑，料液比為1∶25，超聲提取40 min為樣品溶液的最佳制備方法。

此外還考察了乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸、甲醇-水、甲醇-0.1%乙酸等多種流動相體系，選擇了色譜峰分離度及峰形較好，且分析時間短的乙腈-0.1%乙酸溶液作為流動性；同時考察了20 ℃、25 ℃、30 ℃、40 ℃等不同柱溫對各色譜峰分離效果的影響，結果30 ℃時色譜峰分離效果最佳?？疾炝?40 nm、260 nm、280 nm、290 nm、300 nm、320 nm等不同吸收波長對各色譜峰的影響，綜合考慮最終選擇280 nm作為吸收波長。

藥用植物有效成分多為植物的次生代謝物，其在植物體內的積累很大程度上受產地、生長年限、生長環(huán)境等因素的影響[16]。本實驗中野生牛大力采集于廣西境內，而栽培牛大力采集于廣西、廣東地區(qū)，30批牛大力藥材中3種主要化學成分的含量，野生牛大力平均含量略高于栽培牛大力平均含量，表明植物體內有效成分的積累很大程度上與生長年限、生長環(huán)境等因素有關，生長年限越長，有效成分含量的積累就越高。野生與栽培樣品中，同一化合物含量相差不大，表明人工栽培的牛大力其有效成分含量也可以達到較高的水平，說明在兩廣地區(qū)開展人工種植牛大力是可行的。即使是相同的廣西產地，野生與栽培的各有效成分的平均含量也存在差異，說明引種栽培后生長環(huán)境的改變對藥用植物有效成分的積累有影響。根據(jù)相關報道[15]，牛大力的種植時間一般為4～6年，而本次收集栽培牛大力生長年限均只有3年，還需進一步對牛大力有效成分含量與產量變化情況進行跟蹤研究，這對提高牛大力栽培品的質量及質量控制具有重要實際意義。

本研究所建的含量測定方法可用于測定牛大力中刺桐堿、芒柄花素及高麗槐素的含量，方法靈敏度高，操作簡便、易行、結果可靠，可為牛大力藥材的質量控制提供參考。