金櫻根不同炮制品中沒(méi)食子兒茶素和兒茶素含量測(cè)定

黎海燕，陳 馨，田素英，3，4

(1.廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；3.廣東省化妝品工程技術(shù)中心，廣東 中山 528458；4.廣東藥科大學(xué) 大健康協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 中山 528458)

金櫻根為薔薇科植物金櫻子(RosalaevigataMichx.)的干燥根[1]，最早始見于《日華子本草》：“金櫻子根，平，無(wú)毒。治寸白蟲，銼二兩，入糯米三十粒。水二升，煎五合，空心服，須臾瀉下；金櫻子根皮，炒，止瀉血及崩中帶下。”[2]其根和根皮可固精澀腸，主治滑精、遺尿、痢疾泄瀉、月經(jīng)失調(diào)、崩漏帶下、子宮脫垂、痔瘡、燙傷、早泄性不育癥等多種病癥[3]。

沒(méi)食子兒茶素和兒茶素是金櫻根主要的活性成分[4]，兒茶素類化合物有明顯的清除體內(nèi)自由基、抗病毒、抗癌、抗心律失常、調(diào)節(jié)血脂血糖等活性[5]，Michalina等[6]研究表明，兒茶素在體外細(xì)胞培養(yǎng)中可抑制α-葡萄糖苷酶和組織糖原磷酸化酶，抑制胰高血糖素刺激的葡萄糖產(chǎn)生，從而改善Ⅱ型糖尿病。

黃慧等[7]研究結(jié)果表明，不同炮制方法對(duì)金櫻根中總鞣質(zhì)含量和總黃酮含量[8]都影響較大。而兒茶素類屬黃酮類化合物，也是鞣質(zhì)的前體。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RP-HPLC法[9]對(duì)金櫻根炮制前后的主要活性成分沒(méi)食子兒茶素與兒茶素進(jìn)行含量變化測(cè)定，為中藥臨方炮制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

數(shù)控超聲波清洗器(KH-3000E，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，uitimate 3000)；液相色譜柱(Diamonsil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，北京迪科馬科技有限公司)；十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯電子天平)。

1.2 材料

1.2.1 試劑 沒(méi)食子兒茶素對(duì)照品、兒茶素對(duì)照品(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：201110、201209)；色譜甲醇 (天津市百世化工有限公司，批號(hào)：20200308)；磷酸(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20200608)；甲醇(AR，江蘇強(qiáng)盛化工有限公司，批號(hào)：20080729)。

1.2.2 金櫻根及其炮制品 金櫻根生品(廣西省河池市，經(jīng)田素英副教授鑒定符合2020版中國(guó)藥典(一部)附錄標(biāo)準(zhǔn))。

醋炙：將凈制后的金櫻根10 g，加入定量的醋攪拌均勻，悶潤(rùn)，待醋被吸盡后，置炒制容器中，先預(yù)熱鍋底，用文火炒至一定程度(微黃)，取出晾涼，即得。每100 kg金櫻根，用米醋20 kg。

鹽炙：將食鹽0.2 g加適量清水溶解，與凈制后的金櫻根10 g攪拌均勻，放置悶潤(rùn)，等待鹽水被吸盡后，置炒制容器中，先預(yù)熱鍋底，用文火炒至一定程度(微黃)，取出晾涼，即得。每100 kg金櫻根，用食鹽2 kg。

黑豆汁制：取黑豆1 kg加適量水，煮約4 h，熬汁得黑色渾濁液體1.5 kg；黑豆渣再加水煮3 h，熬汁1.0 kg，合并得黑豆汁約2.5 kg。取凈制后的金櫻根10 g與黑豆汁按比例量攪拌均勻，隔水蒸1 h，使黑豆汁深入藥物內(nèi)部。60 ℃烘干藥材，取出晾涼，即得。每100 kg金櫻根，用黑豆10 kg。

蜜炙：將凈制后的金櫻根10 g，加入定量的煉蜜攪拌均勻，悶潤(rùn)，待煉蜜被吸盡后，置炒制容器中，先預(yù)熱鍋底，用文火炒至一定程度(微黃)，取出晾涼，即得。每100 kg金櫻根，用煉蜜30 kg。

炒炭：將凈制后的金櫻根10 g置熱鍋內(nèi)，用武火炒至藥材表面呈焦黑色，內(nèi)部呈焦黃色時(shí)，噴淋清水少許，熄滅火星，取出，晾干。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇∶水∶磷酸(17∶83∶0.1，v/v)，進(jìn)樣量10 μL，流速，1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫：室溫。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱取兒茶素對(duì)照品10.00 mg，以甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中搖勻，制成1.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密稱取沒(méi)食子兒茶素對(duì)照品2.50 mg，以甲醇定容于5 mL棕色容量瓶中搖勻，制成0.50 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取兒茶素和沒(méi)食子兒茶素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液600 μL用甲醇稀釋定容于5 mL棕色容量瓶中制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取藥材剪成段，粉碎，過(guò)5號(hào)篩，制成細(xì)粉密封保存。精密稱取藥材粉末置于30 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取40 min，放至室溫，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，理論塔板計(jì)算不低于4 000(沒(méi)食子兒茶素4 286，兒茶素4 315，樣品4 127)。2個(gè)色譜峰與相鄰峰之間分離度大于1.5(見圖1)。

2.4 方法學(xué)線性關(guān)系考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1 000 μL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋定容于10 mL容量瓶中，制成一系列濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；精密吸取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1 000 μL沒(méi)食子兒茶素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用甲醇稀釋定容于10 mL容量瓶中，制成一系列濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量液。充分搖勻后，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定，記錄色譜圖，以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)對(duì)照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得兒茶素和沒(méi)食子兒茶素的回歸方程。兒茶素的線性回歸方程為：y=3×107x+191 442，r=0.999 5，在0.200～1.000 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系好。沒(méi)食子兒茶素的線性回歸方程為：y=4×107x-4 647，r=0.999 6，在0.10～0.50 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

注：(a)對(duì)照品；(b)供試品；(a)2.沒(méi)食子兒茶素；3.兒茶素；(b)3.沒(méi)食子兒茶素；10.兒茶素。圖1 兒茶素和沒(méi)食子兒茶素圖譜

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取藥材6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算沒(méi)食子兒茶素和兒茶素的色譜峰峰面積RSD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：沒(méi)食子兒茶素和兒茶素峰面積RSD值分別為0.96%(n=6)和1.66%(n=6)。結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 將混合對(duì)照品溶液按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算沒(méi)食子兒茶素和兒茶素的色譜峰峰面積的RSD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：沒(méi)食子兒茶素和兒茶素峰面積的RSD值分別為1.02%(n=6)和0.88%(n=6)。結(jié)果表明，儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液。取同一供試品溶液，分別于室溫下在0、2、4、6、8、10 h內(nèi)，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算沒(méi)食子兒茶素和兒茶素的色譜峰峰面積的RSD值。沒(méi)食子兒茶素和兒茶素峰面積RSD值分別為1.47%和0.87%，結(jié)果表明，樣品溶液室溫放置10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密量取已知含量的同一批號(hào)樣品，共5份。分別精密加入沒(méi)食子兒茶素和兒茶素對(duì)照品儲(chǔ)備液300 μL和1 600 μL，充分混勻后按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，并按“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣方法依次進(jìn)樣，測(cè)定沒(méi)食子兒茶素和兒茶素峰面積，并計(jì)算沒(méi)食子兒茶素和兒茶素含量，測(cè)定值應(yīng)在線性范圍內(nèi)，用實(shí)測(cè)值與原樣品含被測(cè)成分量之差，除以加入純品量，計(jì)算回收率。沒(méi)食子兒茶素平均回收率100.63%，RSD值為3.96%(n=5)；兒茶素平均回收率102.43%，RSD值為1.34%(n=5)，表明沒(méi)食子兒茶素和兒茶素良好。見表1。

表1 沒(méi)食子兒茶素和兒茶素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品含量測(cè)定

取6份金櫻根不同炮制品剪成段，粉碎，過(guò)5號(hào)篩，制成細(xì)粉密封保存。精密稱取金櫻根粉末生品1.002 g、鹽制品1.002 g、蜜制品1.002 g、炒炭品1.002 g、醋制品1.001 g，以及黑豆汁制品1.002 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣方法測(cè)定，每個(gè)炮制樣品平行測(cè)定3組，并計(jì)算其RSD值。見表2。

表2 不同炮制品沒(méi)食子兒茶素和兒茶素的含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

由表2可知，沒(méi)食子兒茶素含量為：蜜炙品>鹽炙品>黑豆汁制品>醋炙品>生品>炒炭；兒茶素含量為：鹽炙品>醋炙品>黑豆汁制品>蜜炙品>生品>炒炭。根據(jù)上述結(jié)果可知，鹽炙、醋炙品、黑豆汁制品、蜜炙品四種炮制方法可顯著提高金櫻根中兒茶素和沒(méi)食子兒茶素的含量，而炒炭炮制方法則降低金櫻根中兒茶素和沒(méi)食子兒茶素的含量，因此炒炭在提高兒茶素類有效成分方面上不能很好地發(fā)揮作用。

3 討論

3.1 選擇金櫻根炮制方法思路

中藥材通過(guò)炮制可達(dá)到增加療效，減低毒性的作用。其中，醋味酸、苦，性溫，具有引藥入肝、散瘀止血、理氣止痛的功效。食鹽，味咸性寒，有清熱涼血的作用，而鹽炙藥物則有引藥下行，增強(qiáng)補(bǔ)腎固精、利尿、清熱、滋陰降火涼血等作用。煉蜜具有補(bǔ)益脾胃、潤(rùn)肺止咳、緩中止痛的作用。黑豆性味甘、平，能祛風(fēng)、滋補(bǔ)肝腎、解毒、活血，藥物經(jīng)黑豆汁制后可增強(qiáng)藥物療效，降低藥物毒性或副作用。炒炭既有增強(qiáng)止血的作用，又有緩和藥性、降低毒性的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合金櫻根的功效主治設(shè)計(jì)用醋炙、鹽炙、蜜炙、黑豆汁制、炒炭法進(jìn)行有效成分變化對(duì)比研究。

3.2 色譜條件優(yōu)化

采用文獻(xiàn)[10]方法測(cè)定沒(méi)食子兒茶素和兒茶素含量的流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸(28∶72∶0.1，v/v)。但沒(méi)食子兒茶素和兒茶素的分離度不佳，峰形對(duì)稱性亦不佳。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合參考文獻(xiàn)，對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行多次調(diào)整，最后本實(shí)驗(yàn)用甲醇-水-磷酸(17∶83∶0.1，v/v)洗脫時(shí)，沒(méi)食子兒茶素和兒茶素分離度好，雜質(zhì)干擾少，故采用甲醇-水-磷酸(17∶83∶0.1，v/v)作為流動(dòng)相。色譜柱有正相色譜柱和反相色譜柱之分，因沒(méi)食子兒茶素和兒茶素均為黃酮類化合物，而黃酮類化合物大多具有多個(gè)羥基，因此采用反相色譜柱較為合適[9]。本研究確定的色譜條件分離效果好，方法穩(wěn)定，且在該色譜條件下均可得到很好的分離測(cè)定，沒(méi)食子兒茶素和兒茶素的分離度均大于2。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)知，相關(guān)研究中采用200 nm及280 nm[11-12]作為測(cè)定兒茶素類的最大波長(zhǎng)居多，系列預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)最大波長(zhǎng)為210 nm時(shí)，峰形、峰高良好，因而確定210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取方法選擇

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者嘗試了超聲提取、冷浸提取、回流提取方法[11]，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)現(xiàn)，回流提取方法中沒(méi)食子兒茶素的含量較少，這是由于沒(méi)食子兒茶素在高溫條件下易分解成其他物質(zhì)，而冷浸提取和超聲提取中沒(méi)食子兒茶素和兒茶素的含量相近，冷浸提取需要24 h，超聲提取只需40 min，經(jīng)綜合考慮，超聲提取更符合實(shí)際情況，因而選用超聲提取法。

3.4 結(jié)果和意義

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，不同炮制方法對(duì)金櫻根中有效成分含量影響較大，蜜炙品(0.849 5 mg/g)>鹽炙品(0.831 7 mg/g)>黑豆汁制品(0.733 0 mg/g)>醋炙品(0.685 3 mg/g)>生品(0.652 0 mg/g)>炒炭(0.503 2 mg/g)；兒茶素含量為：鹽炙品(10.697 mg/g)>醋炙品(10.449 mg/g)>黑豆汁制品(9.486 mg/g)>蜜炙品(8.394 mg/g)>生品(6.116 mg/g)>炒炭(4.235 mg/g)。其中，鹽炙、醋炙品、黑豆汁制品、蜜炙品4種炮制方法可顯著提高金櫻根中沒(méi)食子兒茶素和兒茶素的含量，結(jié)合金櫻根功效“祛瘀止痛、固精澀腸”，建議臨床應(yīng)用金櫻根時(shí)應(yīng)結(jié)合臨床主證進(jìn)行不同的炮制，以提高其臨床療效。

金櫻根臨床應(yīng)用廣泛，如湖南株洲千金藥業(yè)婦科千金片、廣東中智藥業(yè)金雞膠囊、廣東省羅浮山白鶴制藥廠等多家生產(chǎn)的廣東涼茶、桂林三金藥業(yè)三金片等，但均未見其對(duì)金櫻根進(jìn)行炮制研究，故針對(duì)金櫻根的炮制研究較少，本研究團(tuán)隊(duì)的前期成果僅對(duì)金櫻根炮制前后總鞣質(zhì)、總黃酮的含量改變進(jìn)行了探討，而未對(duì)單一成分進(jìn)行研究，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)金櫻根臨床炮制應(yīng)用具有參考價(jià)值。