基于Wnt信號(hào)通路研究表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的作用及機(jī)制

石明亮，王曉磊，李江琳，段文飛

基于Wnt信號(hào)通路研究表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的作用及機(jī)制

石明亮，王曉磊，李江琳，段文飛

河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 普外一科，河南 開(kāi)封 475000

基于Wnt信號(hào)通路探究表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）對(duì)人肝星狀細(xì)胞LX-2活化的影響及其作用機(jī)制。體外培養(yǎng)LX-2細(xì)胞，CCK-8法篩選EGCG的實(shí)驗(yàn)濃度；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組（正常培養(yǎng)）、模型組[10 ng/mL 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）]、EGCG低劑量組（12.5 μmol/L EGCG＋10 ng/mL TGF-β1）、EGCG高劑量組（25.0 μmol/L EGCG＋10 ng/mL TGF-β1）、EGCG＋siRNA-NC組[小窩蛋白-1（Caveolin-1，）-siRNA陰性對(duì)照＋25.0 μmol/L EGCG＋TGF-β1]和EGCG＋-siRNA組（-siRNA＋25.0 μmol/L EGCG＋TGF-β1），CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布情況；吖啶橙/溴乙錠（AO/EB）染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)；qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，）、I型膠原蛋白（）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitors of matrix metalloproteinase-1，）mRNA表達(dá)情況；Western blotting檢測(cè)細(xì)胞Cav-1和Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。EGCG降低LX-2細(xì)胞存活率，呈劑量相關(guān)性。與對(duì)照組相比，模型組LX-2細(xì)胞存活率、S期和G2/M期的細(xì)胞比例、細(xì)胞、、mRNA表達(dá)和Wnt1、Wnt5a、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、原癌基因c-Myc蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05），細(xì)胞凋亡率、G0/G1期的細(xì)胞比例、凋亡細(xì)胞比例、Cav-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05）；與模型組相比，EGCG低、高劑量組LX-2細(xì)胞存活率、S期和G2/M期的細(xì)胞比例、細(xì)胞‐、、mRNA表達(dá)和Wnt1、Wnt5a、β-catenin、Cyclin D1、c-Myc蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05），細(xì)胞凋亡率、G0/G1期的細(xì)胞比例、凋亡細(xì)胞比例、Cav-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05）；且在EGCG干預(yù)的基礎(chǔ)上，沉默的表達(dá)可顯著上調(diào)Wnt1、Wnt5a蛋白表達(dá)，減弱EGCG對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用。EGCG可能通過(guò)上調(diào)Cav-1表達(dá)，抑制Wnt信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制LX-2細(xì)胞活化。

表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯；肝星狀細(xì)胞；凋亡；Wnt信號(hào)通路；小窩蛋白-1

肝纖維化（liver fibrosis，LF）是肝損傷的組織學(xué)標(biāo)志，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過(guò)度沉積，可發(fā)展為肝硬化、肝癌和（或）肝功能衰竭[1]。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）是LF的主要來(lái)源[2]。在生理?xiàng)l件下，HSC保持靜止；當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，受損的細(xì)胞和免疫細(xì)胞會(huì)釋放出炎性細(xì)胞因子和趨化因子，包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），TGF-β1激活HSC，導(dǎo)致大量ECM的合成和分泌，啟動(dòng)纖維化發(fā)生[3-4]。目前治療方法主要集中在抑制HSC活化和（或）促進(jìn)ECM降解。許多藥物治療效果有限，并且可能加劇肝損傷[5]。因此，迫切需要延遲或預(yù)防LF進(jìn)展的新策略。

LF屬于中醫(yī)“肋痛”“積聚”范疇，病因病機(jī)復(fù)雜，多因外感毒邪、痰瘀阻絡(luò)、濕熱蘊(yùn)結(jié)所致。中醫(yī)藥因其辨證論治和多渠道、多層次、多靶點(diǎn)的綜合藥理作用，在治療LF方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前，中醫(yī)藥抗LF的機(jī)制主要包括抑制HSC的激活、抑制ECM合成、抗氧化、抑制炎癥等。兒茶素是一類(lèi)植物多酚，存在于食品和藥用植物中，在體內(nèi)外均具有抗氧化、抗炎和抗增殖的作用，表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是兒茶素的主要成分，具有廣泛的生物學(xué)特性，包括抗纖維化活性[6]。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可抑制大鼠HSC中I型膠原（Collagen I）的生成和膠原酶的活性[7]，還可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制人HSC株LX-2細(xì)胞的增殖和活化[8]，表明EGCG可能具有治療LF的潛力，但其作用機(jī)制尚不明確。

Wnt途徑是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的重要調(diào)節(jié)劑，對(duì)正常的肝臟發(fā)育非常重要。研究表明，該途徑與HSC的活化和LF密切相關(guān)[9]。小窩蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1）是質(zhì)膜小窩的主要成分，負(fù)調(diào)控許多細(xì)胞信號(hào)事件，包括經(jīng)典的Wnt信號(hào)[10]。Cav-1在纖維化肝組織和激活的HSC中呈低表達(dá)，且在活化的HSC中，沉默可上調(diào)纖維化基因如平滑肌肌動(dòng)蛋白α2（smooth muscle actin α2，ACTα2）和Collagen I表達(dá)，并伴有抗纖維化基因基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitors of matrix metalloproteinase-1，TIMP-1）的增加，表明Cav-1在HSC活化和膠原蛋白的產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用[11]。EGCG能刺激Cav-1位移，用Cav-1特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞沉默，可顯著降低細(xì)胞對(duì)EGCG的攝取[12]；在H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷中，Cav-1的激活參與EGCG介導(dǎo)的心臟保護(hù)；表明Cav-1在EGCG的攝取和運(yùn)輸以及機(jī)制中發(fā)揮作用[13]。EGCG能否通過(guò)影響Cav-1的表達(dá)介導(dǎo)HSC活化還未可知，因此本研究初步探究EGCG對(duì)LX-2細(xì)胞活化的影響及其作用機(jī)制，以期為L(zhǎng)F的診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

LX-2細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

EGCG（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%，批號(hào)200-659-6）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)L3000-015）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；重組人TGF-β1蛋白（批號(hào)TG1-H4212）購(gòu)自北京百普賽斯生物科技股份有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gbico公司，批號(hào)分別為10099141C、1676916、25300-054；- siRNA及其陰性對(duì)照（siRNA-NC）、qRT-PCR引物均由上海GenePharma合成；CCK-8試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液和BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技公司，批號(hào)分別為20200908、20201027、20201003、20201019；TRIzol試劑、PrimeScript? RT試劑盒、SYBR?Premix Ex Taq? II試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，批號(hào)分別為AI80436A、AJ60593、AJ91432A；Cav-1小鼠源抗體（批號(hào)GR435324-11）、Wnt1兔源抗體（批號(hào)GR312453-6）、Wnt5a兔源抗體（批號(hào)GR326874-5）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）兔源抗體（批號(hào)GR415239-13）、細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1兔源抗體（批號(hào)GR345242-4）、原癌基因c-Myc兔源抗體（批號(hào)GR298716-12）、β-actin兔源抗體（批號(hào)GR25827）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號(hào)GR31635）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)GR32354）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；ABI Prism?7300型qRT-PCR儀（美國(guó)ABI公司）；BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；IX73型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；iMark680型多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

LX-2細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次，3～4 d傳代1次，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8法篩選EGCG的實(shí)驗(yàn)濃度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以1×103/孔接種到96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入終濃度為0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的含EGCG的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后再換成含TGF-β1（終質(zhì)量濃度為10 ng/mL）的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，最后每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，測(cè)定450 nm處各孔吸光度（）值，以培養(yǎng)基為空白孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)－空白)/(對(duì)照－空白)

2.3 實(shí)驗(yàn)分組和處理

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞混懸液，以2×105/孔接種到24孔板中，設(shè)置對(duì)照組（正常培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞）、模型組（TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞）、EGCG低劑量組（LX-2細(xì)胞用濃度為12.5 μmol/L的EGCG處理12 h后再進(jìn)行TGF-β1誘導(dǎo)）、EGCG高劑量組（LX-2細(xì)胞用濃度為25.0 μmol/L的EGCG處理12 h后再進(jìn)行TGF-β1誘導(dǎo)）及EGCG＋siRNA-NC組（- siRNA陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞48 h，然后用濃度為25.0 μmol/L的EGCG處理12 h后再進(jìn)行TGF-β1誘導(dǎo)）和EGCG＋-siRNA組（-siRNA轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞48 h，濃度為25.0 μmol/L的EGCG處理LX-2細(xì)胞12 h后再進(jìn)行TGF-β1誘導(dǎo)）。TGF-β1誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后收集細(xì)胞。

2.4 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，以1×103/孔接種到96孔板中，將細(xì)胞按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及處理，培養(yǎng)48 h后，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定各孔值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

LX-2細(xì)胞以2×105/孔接種至6孔板中，按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及處理，培養(yǎng)48 h后，將各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化，PBS溶液洗滌后將其懸浮在400 μL 1×Annexin結(jié)合溶液中。取100 μL細(xì)胞懸浮液，將5 μL Annexin V-FITC染色溶液添加到懸浮液中，孵育15 min；加入5 μL碘化丙啶（PI），于4 ℃避光孵育5 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

2.6 吖啶橙/溴乙錠（AO/EB）染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞，按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及處理，培養(yǎng)48 h后，棄去上清液，用PBS溶液洗滌細(xì)胞2次，胰蛋白酶消化并重懸細(xì)胞，取25 μL懸浮液至載玻片上，將AO（100 μg/mL）和EB（100 μg/mL）按1∶1預(yù)混合，并將所得溶液添加到載玻片上，避光放置5 min，于熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)并拍照，使用Image J軟件處理照片并計(jì)數(shù)。正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈強(qiáng)綠色熒光，圓形細(xì)胞核均勻分布于細(xì)胞中心；早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈黃綠色熒光，集中分布于細(xì)胞一側(cè)，呈新月形或圓珠狀；晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈橙色熒光，集中聚集，偏向定位；壞死細(xì)胞的體積增加，呈不均勻的橙紅色熒光，輪廓不明顯，正在溶解或接近崩解。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布

按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組并處理細(xì)胞，通過(guò)離心收集TGF-β1處理后培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞，于4 ℃用冷乙醇固定過(guò)夜，然后離心并洗滌；再將細(xì)胞在37 ℃下于500 μL冷PBS溶液（含20 μL RNase A）中懸浮30 min，用400目網(wǎng)篩濾過(guò)后，將細(xì)胞重懸于400 μL PI中，并于4 ℃避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布情況。

2.8 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中α‐SMA、Collagen I和TIMP-1 mRNA的表達(dá)

按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組并處理細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

引物序列 (5’-3’)產(chǎn)物大小/bp α‐SMAF: ATCAAGGAGAAACTGTGTTATGTAGR: GATGAAGGATGGCTGGAACAGGGTC182 Collagen IF: TCTAGACATGTTCAGCTTTGTGGAC149 R: TCTGTACGCAGGTGATTGGTG TIMP-1F: CTTCTGCAATTCCGACCTCGT142 R: ACGCTGGTATAAGGTGGTCTG β-actinF: GCCAACACAGTGCTGTCTGG145 R: CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG

2.9 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中Cav-1和Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組并處理細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定上清液中的總蛋白質(zhì)量濃度。取等量蛋白樣品與SDS樣品緩沖液混合，加熱至95 ℃ 10 min變性，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉，分別加入Cav-1、Wnt1、Wnt5a、β-catenin、Cyclin D1、c-Myc和β-actin抗體（1∶1000），于4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG抗體（1∶2000），室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光試劑顯色，以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析結(jié)果。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。使用SPSS 22.0和Image-Pro Plus軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以表示，兩組間比較采用檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間有差異進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 EGCG對(duì)LX-2細(xì)胞存活率的影響

為確定EGCG對(duì)LX-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性，使用不同劑量的EGCG處理后，發(fā)現(xiàn)低濃度（12.5、25.0 μmol/L）的EGCG對(duì)LX-2細(xì)胞存活率未出現(xiàn)明顯影響，而當(dāng)EGCG濃度≥50.0 μmol/L時(shí)可顯著降低LX-2細(xì)胞存活率（＜0.05），其半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值為127.61 μmol/L（表2）。故選擇濃度為12.5、25.0 μmol/L的EGCG用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 EGCG對(duì)LX-2細(xì)胞存活率的影響(, n = 3)

Table 2 Effect of EGCG on survival rate of LX-2 cells (, n = 3)

組別劑量/(μmol·L?1)細(xì)胞存活率/% 對(duì)照—100.00±0.00 EGCG12.595.49±10.17 25.086.82±9.05 50.065.45±6.63* 100.051.71±7.58* 200.040.21±6.11*

與對(duì)照組比較：*＜0.05

*< 0.05control group

3.2 各組LX-2細(xì)胞存活率與凋亡率

如圖1和表3所示，與對(duì)照組相比，模型組LX-2細(xì)胞存活率顯著升高，凋亡率顯著降低（＜0.05）；與模型組相比，EGCG低、高劑量組細(xì)胞存活率顯著降低，凋亡率顯著升高（＜0.05）；與EGCG高劑量組相比，EGCG＋-siRNA組細(xì)胞存活率顯著升高，凋亡率顯著降低（＜0.05）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組LX-2細(xì)胞凋亡情況

表3 各組LX-2細(xì)胞存活率與凋亡率(, n = 3)

Table 3 Survival rate and apoptosis rate of LX-2 cells in each group(, n = 3)

組別劑量/(μmol·L?1)細(xì)胞存活率/%細(xì)胞凋亡率/% 對(duì)照—100.00±0.008.67±1.05 模型—124.37±14.56*3.49±0.41* EGCG12.592.65±10.74#10.26±1.68*# 25.081.24±9.86*#14.50±1.72*# EGCG＋siRNA-NC25.083.07±9.05*#13.81±1.56*# EGCG＋Cav-1-siRNA25.0105.43±11.23#&9.46±1.29#&

與對(duì)照組比較：*＜0.05；與模型組比較：#＜0.05；與EGCG高劑量組比較：&＜0.05

*< 0.05control group;#< 0.05model group;&< 0.05high-dose EGCG group

3.3 各組LX-2細(xì)胞周期分布

如圖2、3所示，與對(duì)照組相比，模型組LX-2細(xì)胞在G0/G1期的比例顯著減少，S期和G2/M期的細(xì)胞比例顯著增加（＜0.05）；與模型組相比，EGCG低、高劑量組細(xì)胞在G0/G1期的比例顯著增加，S期和G2/M期的細(xì)胞比例顯著減少（＜0.05）；與EGCG高劑量組相比，EGCG＋-siRNA組細(xì)胞在G0/G1期的比例顯著減少，S期的細(xì)胞比例顯著增加（＜0.05）。

3.4 各組LX-2細(xì)胞凋亡形態(tài)

如圖4、5所示，與對(duì)照組相比，模型組LX-2細(xì)胞生長(zhǎng)密度增加，未見(jiàn)明顯呈黃綠色和橙色熒光的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞比例顯著降低（＜0.05）；與模型組相比，EGCG低、高劑量組細(xì)胞生長(zhǎng)密度降低，呈黃綠色和橙色熒光的凋亡細(xì)胞增多，凋亡細(xì)胞比例顯著增加（＜0.05）；與EGCG高劑量組相比，EGCG＋-siRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)密度增加，凋亡細(xì)胞比例顯著降低（＜0.05）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析各組LX-2細(xì)胞周期分布情況

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與EGCG高劑量組比較：&P＜0.05，下圖同

對(duì)照模型EGCG低劑量EGCG高劑量EGCG＋siRNA-NCEGCG＋Cav-1-siRNA

圖5 各組LX-2細(xì)胞凋亡比例(, n = 3)

3.5 各組LX-2細(xì)胞α‐SMA、Collagen I和TIMP-1 mRNA的表達(dá)

如圖6所示，與對(duì)照組相比，模型組LX-2細(xì)胞、和mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）；與模型組相比，EGCG低、高劑量組細(xì)胞、和mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與EGCG高劑量組相比，EGCG＋-siRNA組細(xì)胞、和mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。

3.6 各組LX-2細(xì)胞Cav-1、Wnt1、Wnt5a、β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)

如圖7所示，與對(duì)照組相比，模型組LX-2細(xì)胞Cav-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，Wnt1、Wnt5a、β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）；與模型組相比，EGCG低、高劑量組細(xì)胞Cav-1蛋白表達(dá)水平顯著升高，Wnt1、Wnt5a、β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與EGCG高劑量組相比，EGCG＋-siRNA組細(xì)胞Cav-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，Wnt1、Wnt5a、β-catenin、Cyclin D1、c-Myc蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。

圖6 各組LX-2細(xì)胞α‐SMA、Collagen I和TIMP-1 mRNA表達(dá)情況(, n = 3)

4 討論

HSC是LF的主要靶標(biāo)，HSC可以通過(guò)病毒感染、非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、藥物毒素以及自身免疫性和膽道疾病等多種條件激活。活化后，靜止的HSC遷移至損傷部位，分化為成肌纖維細(xì)胞，并分泌大量的ECM以及促炎性細(xì)胞因子。TGF-β1是LF最關(guān)鍵的細(xì)胞因子，其與TGF-β1受體結(jié)合，調(diào)節(jié)Collagen I的合成[14]。Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞活化，并在LX-2細(xì)胞中顯著上調(diào)Collagen I、纖連蛋白和α-SMA的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，用TGF-β1處理LX-2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞、和mRNA表達(dá)水平顯著升高，與以往研究結(jié)果一致，表明成功建立了體外LF模型。

圖7 各組LX-2細(xì)胞Cav-1、Wnt1、Wnt5a、β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)情況(, n = 3)

EGCG是綠茶中提取的主要活性成分，已證明EGCG在疾病的治療和預(yù)防中具有重要作用，其作用主要?dú)w因于其抗氧化和抗炎活性[6]。EGCG對(duì)非酒精性脂肪肝[16]、肝癌[17]、化學(xué)藥物誘發(fā)的肝損傷[18]等各種肝臟相關(guān)疾病均具有顯著的保護(hù)作用。此外，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)EGCG可以抑制動(dòng)物模型中的肝臟炎癥和纖維化[19]。Sojoodi等[20]發(fā)現(xiàn)EGCG可抑制HSC活化；王琦等[8]發(fā)現(xiàn)EGCG可誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞凋亡，并抑制其增殖和活化。但由于實(shí)驗(yàn)條件、環(huán)境、細(xì)胞來(lái)源等因素的不同，不能將以往實(shí)驗(yàn)濃度直接用于本研究，因此，在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前，本研究在以往實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用含不同濃度EGCG（終濃度為0、12.5、25、50、100、200 μmol/L）的培養(yǎng)基處理LX-2細(xì)胞以篩選合適的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)EGCG濃度為12.5、25.0 μmol/L時(shí)對(duì)LX-2細(xì)胞存活率未出現(xiàn)明顯影響，而當(dāng)EGCG濃度≥50.0 μmol/L時(shí)可顯著抑制LX-2細(xì)胞存活率；故選擇EGCG（12.5、25.0 μmol/L）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后結(jié)果顯示，TGF-β1處理LX-2細(xì)胞48 h可增加LX-2細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞凋亡率，而經(jīng)25.0 μmol/L EGCG干預(yù)的LX-2細(xì)胞，其存活率降低，細(xì)胞凋亡率增加，且細(xì)胞、和mRNA表達(dá)水平降低；細(xì)胞周期結(jié)果顯示，EGCG干預(yù)的LX-2細(xì)胞停滯在G0/G1期，而S期細(xì)胞比例減少；AO/EB染色結(jié)果也顯示，EGCG干預(yù)后凋亡細(xì)胞比例增加。進(jìn)一步說(shuō)明EGCG具有顯著抑制LX-2細(xì)胞活化和增殖的作用，并促進(jìn)其凋亡。

β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑的主要下游效應(yīng)物，在胞質(zhì)中Wnt蛋白通過(guò)與細(xì)胞膜表面的跨膜受體結(jié)合，使β-catenin降解減少，導(dǎo)致β-catenin在胞質(zhì)積累，當(dāng)胞質(zhì)中達(dá)到一定濃度時(shí)可轉(zhuǎn)入胞核，與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，可激活與增殖和分化相關(guān)的靶基因（如c-Myc、cyclin、survivin）的表達(dá)[21]。Rong等[22]發(fā)現(xiàn)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)途徑可抑制HSC活化，降低Cyclin D1、α-SMA和Collagen Ⅰ的表達(dá)，減輕LF。而EGCG可抑制Wnt/β-catenin的激活[23]，下調(diào)CyclinD1、c-Myc的表達(dá)，抑制肝癌的發(fā)展[24]。因此推測(cè)EGCG對(duì)LX-2細(xì)胞活化的抑制作用可能與Wnt途徑有關(guān)。故在本研究中，通過(guò)Western blotting檢測(cè)了LX-2細(xì)胞Wnt途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，EGCG可顯著降低Wnt1、Wnt5a、β-catenin的表達(dá)，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中Wnt途徑的激活，證實(shí)EGCG可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin途徑，進(jìn)而抑制HSC的活化，參與LF。

Cav-1是胞膜上的一種整合膜蛋白，在許多細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，對(duì)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)皮的滲透和腫瘤的發(fā)生起重要的調(diào)節(jié)作用。Cav-1是肝臟功能的調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)幾種分子途徑，從而調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)蓄積、脂質(zhì)和葡萄糖代謝、線粒體生物學(xué)和肝細(xì)胞增殖；與膽汁瘀積、肝炎、肝硬化和肝癌的發(fā)生有關(guān)[25]。因此，Cav-1在維持肝生理功能中起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在纖維化肝組織和激活的HSC中，Cav-1呈低表達(dá)；沉默可上調(diào)Collagen I表達(dá)，升高TIMP-1表達(dá)[11]。此外，有研究顯示Cav-1可負(fù)調(diào)控經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路[10]。而本研究也檢測(cè)到，在TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中Cav-1的表達(dá)降低，并伴隨著和以及Wnt1、Wnt5a、β-catenin表達(dá)的升高。由此，猜測(cè)EGCG對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的調(diào)控機(jī)制可能與Cav-1有關(guān)。

研究表明，在激活的HSC中Wnt1和Wnt5a的表達(dá)上調(diào)[26]。Wnt1是經(jīng)典的依賴(lài)β-catenin的Wnt信號(hào)通路蛋白，在纖維化肝組織和TGF-β1刺激的LX-2細(xì)胞中Wnt1、β-catenin的表達(dá)顯著升高[27-28]。而Cav-1可通過(guò)調(diào)節(jié)β-catenin的細(xì)胞內(nèi)定位來(lái)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)[29]。Guan等[30]發(fā)現(xiàn)Cav-1可通過(guò)抑制Wnt1/β-catenin信號(hào)通路改善慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EGCG干預(yù)的LX-2細(xì)胞中，Cav-1的表達(dá)增加，而Wnt1、β-catenin的表達(dá)降低，且Wnt5a的表達(dá)也下調(diào)，Wnt5a是一種具有代表性的非經(jīng)典Wnt蛋白，Li等[31]發(fā)現(xiàn)Wnt5a可增強(qiáng)LX-2細(xì)胞中α-SMA和Collagen I的蛋白和mRNA表達(dá)，促進(jìn)HSC活化。本研究在EGCG干預(yù)的基礎(chǔ)上采用小分子干擾技術(shù)沉默的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Wnt1、Wnt5a的表達(dá)上調(diào)，表明EGCG對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用被減弱。提示，Cav-1不僅可負(fù)調(diào)控經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，還可負(fù)調(diào)控Wnt5a介導(dǎo)的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路；EGCG對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用可能與其上調(diào)Cav-1的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，EGCG可能通過(guò)上調(diào)Cav-1，抑制Wnt信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制HSC活化。本研究?jī)H從細(xì)胞水平初步探究了EGCG對(duì)HSC活化的分子機(jī)制，由于體內(nèi)環(huán)境存在較大差異，EGCG在體內(nèi)能否發(fā)揮相同的調(diào)控作用，進(jìn)而影響LF，有待深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of epigallocatechin gallate on activation of hepatic stellate cells based on Wnt signaling pathway

SHI Ming-liang, WANG Xiao-lei, LI Jiang-lin, DUAN Wen-fei

Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, China

To explore the effect and mechanism of epigallocatechin gallate (EGCG) on the activation of hepatic stellate cells LX-2 based on Wnt pathway.LX-2 cells were cultured, and the experimental concentration of EGCG was screened by CCK-8 method. LX-2 cells in the logarithmic growth phase were divided into control group (normally cultured), model group [10 ng/mL transforming growth factor-β1 (TGF-β1)], low-dose EGCG group (12.5 μmol/L EGCG + 10 ng/mL TGF-β1), high-dose EGCG group (25.0 μmol/L EGCG + 10 ng/mL TGF-β1), EGCG + siRNA-NC group [Caveolin-1 ()-siRNA negative control + 25.0 μmol/L EGCG + TGF-β1] and EGCG +-siRNA group (-siRNA + 25.0 μmol/L EGCG + TGF-β1), CCK-8 method was used to detect cell survival rate of each group; Flow cytometry was used to detect cell apoptosis and cell cycle distribution; Acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) staining method was used to observe the morphology of cell apoptosis; qRT-PCR was used to detect α-smooth muscle actin (),and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 () mRNA expressions of cells; Western blotting was used to detect the expressions of Cav-1 and Wnt signaling pathway related proteins of cells.EGCG reduced survival rate of LX-2 cells in a concentration-dependent manner. Compared with control group, LX-2 cells survival rate, ratios of S phase and G2/M phase cells, mRNA expressions of,and, and protein expressions of Wnt1, Wnt5a, β-catenin, Cyclin D1, c-Myc were significantly increased in model group (< 0.05), apoptosis rate, ratio of G0/G1phase cells, ratio of apoptotic cells, and Cav-1 protein expression were significantly reduced (< 0.05). Compared with model group, LX-2 cells survival rate, ratios of S phase and G2/M phase cells, mRNA expression of,,, and protein expressions of Wnt1, Wnt5a, β-catenin, Cyclin D1, c-Myc in low-, high-dose EGCG groups were significantly decreased (< 0.05), apoptosis rate, ratio of G0/G1phase cells, ratio of apoptotic cells, and Cav-1 protein expression were significantly increased (< 0.05); On the basis of EGCG intervention, silencing the expression ofsignificantly up-regulated Wnt1 and Wnt5a protein expressions, and weakened the inhibitory effect of EGCG on Wnt signaling pathway.EGCG may inhibit the activation of Wnt signaling pathway by up-regulating the expression of Cav-1, thereby inhibiting the activation of LX-2 cells.

epigallocatechin gallate; hepatic stellate cells; apoptosis; Wnt signaling pathway; Caveolin-1

R285.5

A

0253 - 2670(2022)03 - 0758 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.015

2021-10-27

河南省2017年科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（172102310284）

石明亮（1987—），男，碩士，主治醫(yī)師，從事肝膽胰腺疾病的基礎(chǔ)研究。E-mail: shiml87@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]