重金屬阻控菌劑的制備及其減少生菜吸收Cd和Pb的作用

寇鳳蓮，鄭金偉，鄭英敏，賀卓，盛下放，何琳燕*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點實驗室，南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

隨著工業(yè)的飛速發(fā)展和農(nóng)藥、化肥的濫用，我國耕地重金屬污染程度日益加深，我國農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全受到威脅。陳玉鵬等發(fā)現(xiàn)國內(nèi)多個省市地區(qū)設(shè)施蔬菜集散地Cd、Pb污染嚴重，近30年來有大量蔬菜產(chǎn)品受重金屬污染情況的報道。在重金屬污染的土壤中施加具有離子吸附特性的鈍化劑可實現(xiàn)重金屬鈍化解毒修復(fù)功效，其中石灰、黏土礦物、生物炭等材料因具有調(diào)節(jié)土壤pH、吸附鈍化重金屬等特性而成為重金屬污染農(nóng)田修復(fù)的主要材料，但其使用量通常較大，潛在二次污染風險也不容樂觀。

一些植物促生細菌被用于生物鈍化修復(fù)的研究和實踐。XU等發(fā)現(xiàn)菌株sp.X13顯著促進了白菜的生長，提高其生物量，并顯著降低了白菜地上部Cd含量。葛占標等應(yīng)用B9使小白菜地上部Cd和Pb含量比不接菌對照分別顯著降低了24%和33%，B25使長葉萵苣地上部Cd和Pb含量比不接菌對照分別顯著降低了33%和35%。為了提高微生物在土壤中的存活率和修復(fù)效果，可將鈍化劑與微生物聯(lián)合使用。XIONG等利用惡臭假單胞菌X4/pIME與生物炭、稻草灰、石灰等復(fù)合處理Cd污染土壤，發(fā)現(xiàn)最佳處理組合能使生菜地上部Cd含量降低到0.14 mg·kg。賀卓等在田間小區(qū)試驗中發(fā)現(xiàn)細菌聯(lián)合海泡石能夠顯著降低辣椒和茄子果實中Pb含量，提高蔬菜品質(zhì)。上述研究中采用的制劑多為實驗室豐富培養(yǎng)基制備的菌懸液，缺乏菌懸液的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化技術(shù)；且與固體菌劑相比，菌懸液在實際使用中運輸和保藏不方便。多數(shù)研究中菌懸液與固體鈍化劑聯(lián)合使用時，并沒有制備固體菌劑的過程，符合《農(nóng)用微生物菌劑》（GB 20287—2006）的產(chǎn)品還很少見。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Cd耐性細菌H3菌株顯著降低了蔬菜地上部Cd、Pb含量和根際土壤有效態(tài)Cd含量，并增加了蔬菜地上部生物量。因此開展菌株H3產(chǎn)孢培養(yǎng)基優(yōu)化，并配合常用重金屬鈍化劑研發(fā)重金屬阻控菌劑，通過田間小區(qū)試驗考察重金屬阻控菌劑減少蔬菜吸收Cd和Pb的效果和初步機制，為防控蔬菜積累重金屬、改善土壤生態(tài)環(huán)境提供科學(xué)理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌種：以本實驗室保藏的具有Pb、Cd抗性的芽孢桿菌H3（登錄號KP159386）為供試菌株。

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，包含酵母膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基，包含蔗糖2.5 g、蛋白胨5.0 g、MgSO5.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.5。

試劑：蔗糖、玉米粉（購于安徽燕之坊食品有限公司）、糖蜜（購于廣西省柳州市金黔灣糖蜜有限公司）、酵母粉、硫酸銨、大豆粉（購于安徽燕之坊食品有限公司）、CaCO、MgSO?7HO、NaCl。

供試載體：生物炭（購于壽光禾能生物科技有限公司）為限氧裂解法制備的稻殼生物炭，顆粒直徑為0.5~1.0 mm，pH為（7.8±0.1），有機質(zhì)含量（9.5±1.2）g?kg，C含量≥46.4%，N含量≥1.3%，O含量≥21.6%，表面積15.4 m?g，未檢測到Cd、Pb；海泡石（購于湘潭建聯(lián)豐禾生物科技有限責任公司）為天然海泡石，化學(xué)成分為Si和Mg，未檢測到Cd、Pb。供試載體均用80目試驗篩過篩備用。

供試蔬菜：意大利生菜（L.Hort.）購于江蘇農(nóng)科院種子站。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

用接種環(huán)從斜面上挑取3環(huán)菌苔，接到裝有40 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、160 r?min振蕩培養(yǎng)20 h。

1.2.2 芽孢計數(shù)法

將發(fā)酵液在80℃水浴槽中熱處理20 min，然后采用十倍梯度稀釋、涂布培養(yǎng)、計數(shù)，測定芽孢數(shù)量。

1.2.3 菌株H3產(chǎn)孢培養(yǎng)基優(yōu)化

采用單因子試驗、Plackett-Burman優(yōu)化試驗、最陡爬坡試驗和中心組合試驗對菌株H3產(chǎn)孢培養(yǎng)基進行優(yōu)化。單因子試驗：分別以玉米粉和糖蜜替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的蔗糖，其他成分同初始發(fā)酵培養(yǎng)基，篩選最佳碳源；分別以硫酸銨和大豆粉替代培養(yǎng)基中的蛋白胨，其他成分不變，配制培養(yǎng)基，篩選最佳氮源；分別以硫酸鎂和碳酸鈣替代發(fā)酵培養(yǎng)基的氯化鈉，其他成分不變，配制培養(yǎng)基，篩選最佳無機鹽。將種子液接入上述培養(yǎng)基中，接種量為2%，30℃、160 r?min振蕩培養(yǎng)，于24、36、48、60、72 h取樣，測定發(fā)酵液中芽孢數(shù)量，以發(fā)酵液中芽孢數(shù)量作為篩選指標。

根據(jù)單因子試驗結(jié)果，考察糖蜜、大豆粉和碳酸鈣的添加量對芽孢數(shù)量的影響。利用Minitab 17軟件進行Plackett-Burman試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理，每個因子取高、低兩個水平，以發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含量為低水平，初始含量的1.5倍作為高水平，試驗設(shè)計因素水平見表1。根據(jù)試驗結(jié)果，確定添加量影響顯著。以最陡爬坡試驗逼近最優(yōu)點的一組數(shù)據(jù)為中心點，設(shè)計2因素5水平中心組合試驗，具體設(shè)計見表2。按試驗所得數(shù)據(jù)進行二次多項回歸，擬合預(yù)測發(fā)酵芽孢數(shù)量最大值所對應(yīng)的關(guān)鍵因子范圍。用所得到的最佳培養(yǎng)基進行3次平行試驗，取平均值，以驗證模型是否可靠，進而得出最終優(yōu)化結(jié)果。

表1 培養(yǎng)基成分Plackett-Burman設(shè)計因素水平（g?L-1）Table 1 Plackett-Burman design factor level of strain H3 medium composition（g?L-1）

表2 中心組合設(shè)計各因素水平（g?L-1）Table 2 Factor level of central composite design（g?L-1）

1.2.4 固體菌劑的制備

選用海泡石和生物炭作為載體，設(shè)置C1（海泡石）、C2（生物炭）、C3（生物炭50%+海泡石50%）3種處理。分別稱取載體10 g裝于搖瓶中，混合均勻后121℃間歇滅菌兩次。將種子液按2%接種量接種于上述優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160 r?min，振蕩培養(yǎng)48 h，獲得菌株H3發(fā)酵菌液。將發(fā)酵菌液按載體與發(fā)酵菌液比例1∶2（∶）加入載體中，160 r?min、30℃振蕩混合均勻，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h，再在50℃下恒溫干燥，制得固體菌劑，常溫保存6個月。參照《農(nóng)用微生物菌劑》（GB 20287—2006）中測定方法檢測菌劑中有效活菌數(shù)、雜菌數(shù)、水分、細度和pH。

1.2.5 固體菌劑阻控生菜吸收Pb、Cd試驗

在江蘇省南京市棲霞區(qū)某農(nóng)田進行田間小區(qū)試驗，評價固體菌劑減少生菜Pb、Cd含量的作用。土壤基本理化性質(zhì)如下：pH（6.92±0.03），有機質(zhì)含量（22.50±1.20）g?kg，總Cd含量（1.83±0.10）mg?kg，總Pb含量（256.12±12.30）mg?kg。經(jīng)過人工除草、翻地、晾干、碎土和平整土地等處理后，用卷尺將區(qū)域分成12個試驗小區(qū)，每個小區(qū)面積為4 m（2 m×2 m），小區(qū)之間間隔20 cm。試驗設(shè)對照CK、H3發(fā)酵菌液（用量15 mL?m）、生物炭（用量15 g?m）、生物炭+菌株H3發(fā)酵菌液制成的固體菌劑C2（用量15 g?m）4個處理，每個處理重復(fù)3次，小區(qū)隨機排列。提前15 d將不同處理的材料均勻撒在小區(qū)土地上，與耕作層的土壤混勻。生菜種子經(jīng)75%酒精表面消毒5 min后，播種至裝有營養(yǎng)土的穴盤，置于光照溫室培養(yǎng)，定期間苗補水。15 d后移栽至各小區(qū)，常規(guī)田間管理。

收集長至成熟期的生菜植株，將植株連根帶土放入滅菌袋中，帶回實驗室。收集附著在根系表面的土壤，即根際土壤。土壤樣品放于室外自然風干，過80目試驗篩，篩出細度為20 mm的土壤樣品。按照WANG等的方法，用DTPA提取劑提取土壤樣品中有效態(tài)重金屬，并用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）測定。土壤脲酶和蔗糖酶活性的測定參考關(guān)松蔭的方法。植物樣品經(jīng)0.01 mol?LEDTA-2Na溶液浸泡10 min和去離子水清洗后，分為地上部與根部，測定鮮質(zhì)量，烘干、粉碎，用5%HNO消煮定容，用ICP-OES測定Cd、Pb含量。將新鮮生菜地上部研磨成勻漿，稀釋后離心并去除沉淀，上清液中Vc濃度用鉬藍比色法測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法

試驗中圖表繪制采用Excel和Graphpad Prism。利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，差異顯著性分析利用單因素ANOVA，<0.05表示差異顯著。Plackett-Burman優(yōu)化試驗和中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果分析采用Minitab 17軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株H3產(chǎn)孢培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 影響發(fā)酵液中芽孢數(shù)量的單因子試驗

碳源是細胞生長和新陳代謝必需的營養(yǎng)物質(zhì)，其種類和濃度直接影響芽孢的形成速率和產(chǎn)量。選擇玉米粉和糖蜜作為蔗糖的替代碳源，其他成分保持不變，通過H3菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的芽孢數(shù)量曲線，篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源，結(jié)果見圖1（A）。3種碳源下H3芽孢產(chǎn)量的大小順序為：糖蜜>蔗糖>玉米粉，糖蜜明顯優(yōu)于其他碳源。以糖蜜為碳源的培養(yǎng)基中菌株H3在48 h達到最大芽孢數(shù)4.0×10CFU?mL。

氮源主要作用是構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)和合成含氮代謝物，在形成芽孢上也發(fā)揮著重要的作用。選擇大豆粉、硫酸銨作為蛋白胨的替代氮源，其他成分保持不變，結(jié)果見圖1（B）。3種氮源下H3芽孢產(chǎn)量的大小順序為：大豆粉>硫酸銨>蛋白胨，以大豆粉為氮源的培養(yǎng)基中菌株H3最大芽孢數(shù)達到3.8×10CFU?mL。

無機鹽是菌體細胞中組成酶的激活劑或抑制劑的成分之一，可以用來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓、pH等。選擇碳酸鈣、硫酸鎂作為氯化鈉的替代無機鹽，其他成分保持不變。由圖1（C）可知，碳酸鈣作為無機鹽時，發(fā)酵液中H3芽孢數(shù)量遠大于硫酸鎂和氯化鈉培養(yǎng)基，且在48 h達到最大芽孢數(shù)4.9×10CFU?mL。

圖1 不同碳源、氮源和無機鹽對菌株H3芽孢數(shù)量的影響Figure 1 Effectsof different carbon sources，nitrogen sources and inorganic ions on the spores number of strain H3

2.1.2 Plackett-Burman優(yōu)化試驗分析

單因子試驗篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳碳源為糖蜜，氮源為大豆粉，無機鹽為碳酸鈣。通過Minitab 17軟件設(shè)計Plackett-Burman試驗，初步優(yōu)化菌株H3發(fā)酵培養(yǎng)基的3種成分，不同組合的發(fā)酵液中芽孢數(shù)量結(jié)果見表3，各因素水平及效應(yīng)評價見表4。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)回歸分析可以得到擬合回歸方程：=4.308+0.508+0.608+0.942（為芽孢數(shù)量，為糖蜜，為大豆粉，為碳酸鈣）?；貧w模型的<0.01，說明模型所建立的回歸方程能很好地表達糖蜜、大豆粉及碳酸鈣3個因素之間的關(guān)系?；貧w方程中效應(yīng)值的絕對值大小決定各因素對H3芽孢數(shù)量影響程度，即碳酸鈣>大豆粉>糖蜜，而且各因素對H3芽孢數(shù)量的影響均為正效應(yīng)，因此糖蜜應(yīng)取高水平值（3.80 g?L）。大豆粉和碳酸鈣值均小于0.05，即大豆粉和碳酸鈣對H3芽孢數(shù)量具有顯著影響。選定對響應(yīng)值具有顯著效應(yīng)且為正效應(yīng)的大豆粉和碳酸鈣進行下一階段最陡爬坡試驗，調(diào)整水平范圍。

表3 Plackett－Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design matrix and experimental resultsof Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis by Plackett-Burman test design

2.1.3 最陡爬坡試驗和中心組合試驗分析

根據(jù)Plackett-Burman優(yōu)化試驗結(jié)果可知，大豆粉及碳酸鈣是影響發(fā)酵液芽孢數(shù)量的關(guān)鍵因素，且是正效應(yīng)，應(yīng)依次增大，進行爬坡試驗，結(jié)果見表5。隨著爬坡試驗步長增加，芽孢數(shù)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當培養(yǎng)基中大豆粉為9.5 g?L、碳酸鈣為9.5 g?L時，對應(yīng)的發(fā)酵液芽孢數(shù)量達到最大值，將其作為中心組合試驗的響應(yīng)面區(qū)域中心點。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計和結(jié)果Table 5 Test design and results of steepest ascent path

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，采用Minitab 17軟件進行二次回歸的中心組合設(shè)計，進一步優(yōu)化顯著因素的含量。回歸分析結(jié)果見表6。依據(jù)中心組合試驗結(jié)果，得到二次擬合回歸方程為：=6.140-0.485-0.012-1.907-1.157-0.000（為芽孢數(shù)量，為大豆粉，為碳酸鈣）。對二次模型進行方差分析，結(jié)果見表6。模型的值為13.97，多元決定系數(shù)=0.908 9，模型擬合度較高。回歸模型的=0.002，模型的擬合極顯著，所建立的回歸方程能很好地表達大豆粉和碳酸鈣2個因素之間的關(guān)系。采用Minitab 17軟件對中心組合試驗配方優(yōu)化（圖2），結(jié)果顯示大豆粉9.25 g?L、碳酸鈣9.50 g?L時，響應(yīng)值達到最大值。

圖2 中心組合試驗響應(yīng)面優(yōu)化圖Figure 2 Response surface optimization diagram of central composite design

表6 中心組合試驗設(shè)計回歸分析結(jié)果Table 6 Regression analysis based on central composite design

經(jīng)過5次驗證試驗，H3在最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基中形成芽孢數(shù)平均值為5.9×10CFU?mL，與預(yù)測值較為吻合，表明芽孢形成數(shù)目模型的準確性較高。較優(yōu)化前（2.3×10CFU?mL）提高156%，相應(yīng)的H3最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為糖蜜3.80 g?L，大豆粉9.25 g?L，碳酸鈣9.50 g?L。

2.2 固體菌劑指標測定結(jié)果

《農(nóng)用微生物菌劑》（GB 20287—2006）產(chǎn)品技術(shù)指標中指出，粉劑微生物菌劑在保藏第6個月后，有效活菌數(shù)要求達到2.0×10CFU?g，雜菌率≤20%，水分≤35%，細度高于80%，pH控制在5.5~8.5范圍內(nèi)。考慮到有機鈍化劑類的有機肥可能存在的重金屬、抗生素等二次污染風險，顆粒狀有機肥與菌懸液不容易混勻，以及本試驗場地的土壤有機質(zhì)含量較高[（22.50±1.20）g?kg]等原因，本研究選取海泡石和生物炭兩種無機鈍化劑作為載體，與菌懸液制備固體菌劑。表7為兩種無機載體與菌株H3發(fā)酵液復(fù)配制成的固體菌劑C1（海泡石）、C2（生物炭）、C3（生物炭50%+海泡石50%）在保藏6個月后相關(guān)指標檢測結(jié)果。供試菌劑C1、C2和C3的細度都符合要求，C2和C3的有效活菌數(shù)、pH、雜菌率和水分均達到標準，且C2有效活菌數(shù)高于C3，雜菌率顯著低于C3。有效活菌數(shù)為微生物菌劑檢測的重要指標，根據(jù)農(nóng)用微生物菌劑的相關(guān)指標，選擇C2作為后續(xù)田間試驗施用的固體菌劑。

表7 微生物菌劑指標測定Table 7 Determination of microbial agent index

2.3 固體菌劑減少蔬菜吸收Pb、Cd的田間試驗效果

2.3.1 不同處理對生菜生物量和Vc含量的影響

在田間小區(qū)試驗中，與對照相比，3種處理均能促進生菜可食用部分干質(zhì)量和Vc含量增加，其中固體菌劑C2和H3菌液分別顯著增加了生菜可食用部分干質(zhì)量89.9%和44.9%[圖3（A）]，菌株H3與生物炭協(xié)同促生作用明顯。3種處理的生菜Vc含量比對照顯著增加19.1%~39.5%，H3菌液對生菜Vc含量增加效果好于生物炭和固體菌劑C2[圖3（B）]（0.05）。

圖3 H3發(fā)酵菌液、生物炭、固體菌劑C2處理對生菜可食用部分干質(zhì)量和Vc含量的影響Figure 3 Effects of H3 fermentation broth，biochar，solid bacteria agent C2 treatment on the biomassand Vc content in fresh edible tissue of lettuce

2.3.2 不同處理對生菜可食用部分Cd和Pb含量的影響

從圖4看出，不同處理均能降低生菜可食用部分Cd、Pb含量。4種處理的生菜可食用部分Cd含量表現(xiàn)為C2<生物炭

圖4 H3發(fā)酵菌液、生物炭、固體菌劑C2處理對生菜可食用部分Cd和Pb含量的影響Figure 4 Effects of H3 fermentation broth，biochar，solid bacteria agent C2 treatment on Cd and Pb content in fresh edible tissue of lettuce

2.3.3 不同處理對土壤有效態(tài)Cd、Pb含量和酶活性的影響

從圖5（A）、圖5（B）看出，與對照相比，3種處理均能顯著降低生菜根際土壤有效態(tài)Cd和Pb含量，分別降低了14.2%~32.7%和10.4%~11.1%。其中，固體菌劑C2降低根際土重金屬生物有效性的效果較好，與對照相比，根際土有效態(tài)Cd和Pb含量分別顯著降低32.7%和11.1%。與對照相比，生物炭、菌株H3以及固體菌劑C2均能顯著增加生菜根際土壤脲酶和蔗糖酶活性[圖5（C）、圖5（D）]，其中固體菌劑C2處理的生菜根際土壤脲酶和蔗糖酶活性比對照顯著增加60.8%和143.7%。

圖5 H3發(fā)酵菌液、生物炭、固體菌劑C2處理對生菜根際土壤DTPA提取態(tài)Cd和Pb含量、脲酶和蔗糖酶活性的影響Figure 5 Effects of H3 fermentation broth，biochar，solid bacteria agent C2 treatment on the DTPA extractable of Cd and Pb，urease activity and invertase activity in lettuce rhizosphere soils

3 討論

3.1 產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基優(yōu)化

芽孢的形成與菌種有關(guān)，同時還受到營養(yǎng)物質(zhì)及環(huán)境因素的影響。因此，培養(yǎng)基成分、含量以及發(fā)酵條件的選擇對促進芽孢的生成至關(guān)重要。響應(yīng)面分析法以回歸方法作為函數(shù)估算的工具，將多因子與試驗結(jié)果（響應(yīng)值）的關(guān)系函數(shù)化，研究因子與響應(yīng)值、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進行優(yōu)化。近年來運用響應(yīng)面分析法來優(yōu)化芽孢桿菌產(chǎn)胞培養(yǎng)基的報道較多，均取得了比較好的結(jié)果。劉清術(shù)等對巨大芽孢桿菌1013培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵，優(yōu)化后發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)為（89.34±3.87）×10CFU?mL，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了3.35倍。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株H3產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基，將發(fā)酵芽孢數(shù)提高到5.9×10CFU?mL，較初始培養(yǎng)基芽胞數(shù)提高了156%。優(yōu)化后培養(yǎng)基采用糖蜜、大豆粉作為碳、氮源，原材料廉價易得，生產(chǎn)成本降低，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

3.2 土壤修復(fù)菌劑降低蔬菜重金屬含量、修復(fù)污染農(nóng)田效果

近年來，受污染農(nóng)田的安全利用得到多方重視，重金屬污染農(nóng)田修復(fù)材料和蔬菜安全生產(chǎn)技術(shù)成為研究熱點之一。以微生物菌劑為核心的農(nóng)田土壤調(diào)理劑、修復(fù)劑等產(chǎn)品的研發(fā)和應(yīng)用報道較多，但以在實驗室水平上開展為主。能夠分泌IAA、鐵載體和精氨酸脫羧酶的Cd抗性細菌H3在盆栽試驗中能夠促進小白菜生長，且定殖在小白菜根際土壤后能顯著降低根際土壤有效態(tài)Cd/Pb含量，提高土壤蔗糖酶活性，從而顯著降低小白菜地上部Cd、Pb含量。本研究田間試驗中，菌株H3和固體菌劑C2均能增強土壤脲酶和蔗糖酶活性，顯著降低根際土壤DTPA提取態(tài)Cd和Pb含量，減少生菜吸收重金屬，說明菌株H3具有穩(wěn)定的修復(fù)作用。固體菌劑C2的有效活菌數(shù)、pH、雜菌率和水分均達到農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品技術(shù)指標標準，后續(xù)研究中需擴大應(yīng)用范圍和使用面積，開展生態(tài)風險和安全使用管理研究，以適應(yīng)修復(fù)菌劑產(chǎn)品大幅增長需求。

本研究中各處理均減少了蔬菜中Cd、Pb含量，效果表現(xiàn)為固體菌劑C2>H3菌液>生物炭，可見固體菌劑C2協(xié)同了H3菌液和生物炭的作用，可能與土壤脲酶活性增強、有效態(tài)Pb、Cd含量降低有關(guān)。土壤脲酶對土壤和肥料的氮素轉(zhuǎn)化起著重要作用，能夠使尿素轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮，從而使土壤氨含量增加。FISHER等的研究表明，脲酶產(chǎn)生菌和脲酶基因豐度的提高可以提高土壤pH值，YANG等的研究表明，具有脲酶活性的細菌與土壤氮代謝密切相關(guān)，能夠提高土壤銨離子含量和pH值。此外，HAN等發(fā)現(xiàn)菌株CL-1能夠提高根際土壤中精氨酸脫羧酶產(chǎn)生菌相對豐度和多胺含量，從而提高土壤pH、降低土壤有效態(tài)Cd含量。因此，固體菌劑C2和H3菌液降低土壤有效態(tài)Cd、Pb含量還可能與其分泌精氨酸脫羧酶有關(guān)。

生物炭作為土壤改良劑被廣泛應(yīng)用，其不僅能夠通過提高土壤的pH值來降低重金屬的生物有效性，還可以通過陽離子吸附作用降低其在土壤中的遷移，同時生物炭能夠通過改善和提高土壤肥力降低重金屬對植物的毒害。考慮到生物炭多孔性和營養(yǎng)作用，可以將其作為載體材料制備固體菌劑。王瀟敏等通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)中性小麥秸稈炭可作為膠凍樣芽孢桿菌較理想的載體。CHEN等利用熱重分析、XRD、SEM和XPS等物理化學(xué)手段研究發(fā)現(xiàn)，堿性富磷生物炭可以保護細菌sp.免受高Cd危害，生物炭多孔性能夠保護細胞，同時堿性有利于碳酸鎘和磷酸鎘礦物形成，降低Cd毒害。本研究制備的固體菌劑C2中，菌株H3在生物炭中存活率高于海泡石中，且生物炭雜菌率低于海泡石，可見生物炭可以起到保護細胞的作用。在田間試驗中，固體菌劑C2也表現(xiàn)出良好的降低土壤Cd、Pb生物有效性效果，并增強根際土壤脲酶和蔗糖酶活性。多位研究者也發(fā)現(xiàn)此效應(yīng)，TU等發(fā)現(xiàn)生物炭負載sp.NT-2比單一生物炭使用更能提高土壤pH值，降低交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cd、Cu含量，提高土壤脲酶和蔗糖酶活性，提升土壤微生物多樣性指數(shù)，且多糖能強化sp.NT-2與玉米秸稈生物炭的黏附。CHENG等在田間試驗中發(fā)現(xiàn)CL-1和生物炭復(fù)合處理可以降低小麥籽粒Cd和Pb含量，主要原因是單菌處理、生物炭與菌株復(fù)合處理可以增加小麥根際腐胺含量和基因A拷貝數(shù)，提高土壤pH值，降低小麥根際土壤Cd生物有效性以及根-籽粒轉(zhuǎn)移系數(shù)。今后應(yīng)深入研究生物炭-微生物-重金屬的相互作用，長期定位監(jiān)測和評估生物修復(fù)效果，以期為揭示生物炭負載細菌修復(fù)劑鈍化重金屬的機理提供更多依據(jù)。

4 結(jié)論

（1）菌株H3產(chǎn)胞培養(yǎng)基優(yōu)化后，菌株H3在產(chǎn)胞培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后，芽孢數(shù)量可達5.9×10CFU?mL，芽孢數(shù)較原始培養(yǎng)基顯著提高了156%，生產(chǎn)成本降低，原材料廉價易得，配合常用重金屬鈍化劑研發(fā)重金屬阻控菌劑，能夠適于大規(guī)模應(yīng)用。

（2）生物炭與H3菌液制成的固體菌劑C2保藏6個月后，有效活菌數(shù)仍能保持在2×10CFU?g以上，雜菌率低于20%，各項指標均達到國家農(nóng)用微生物菌劑要求，為以微生物菌劑為核心的農(nóng)田土壤調(diào)理劑、修復(fù)劑等產(chǎn)品的研發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)支持。

（3）固體菌劑C2處理后生菜根際土有效態(tài)Cd和Pb含量分別顯著降低32.7%和11.1%，生菜可食用部分Cd和Pb含量分別顯著降低35.2%和50.1%，且根際土壤脲酶和蔗糖酶活性比對照顯著增加60.8%和143.7%，菌劑在保障蔬菜安全生產(chǎn)方面具有廣闊的應(yīng)用前景，為防控蔬菜積累重金屬、改善土壤生態(tài)環(huán)境提供技術(shù)支持。