離體血液中乙醇單因素穩(wěn)定性模型構(gòu)建及分析

張自偉，汪鴻鵬，朱泓冰，馮筱霂，殷若可

(皖南醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

血液中乙醇濃度的測定是法醫(yī)毒物分析的重要研究內(nèi)容，在交通肇事，醫(yī)療糾紛，酒后死亡等案件中有著重要意義。國內(nèi)外學(xué)者長期致力于發(fā)展血液中乙醇濃度測定方法，目前的方法主要有生物傳感器法[1]、化學(xué)法[2]、氣相色譜法[3-4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]。此外，血液的采樣方式、儲存容器中有無抗凝劑等也會影響血液中乙醇濃度的測定，特別是血液的保存方式對乙醇濃度的結(jié)果有著至關(guān)重要的影響。針對這個問題，國內(nèi)外學(xué)者就血液樣品中乙醇穩(wěn)定性問題開展了一系列研究[6-7]。然而，目前的乙醇穩(wěn)定性模型主要探討了多個影響因素的共同作用。然而，多因素之間可能存在的交互作用使得研究模型在實際運用中要做修正。本工作結(jié)合法醫(yī)毒物司法鑒定工作需要，首先建立并優(yōu)化血液中乙醇濃度測定方法。其次，考察離體血液樣品在單因素即4 ℃冷藏保存條件下乙醇濃度的穩(wěn)定性。更為重要的是，運用文中的方法對構(gòu)建的離體血液中乙醇單因素穩(wěn)定性模型進行精準分析，以期為血液中乙醇濃度測定法醫(yī)司法鑒定項目提供理論參考和經(jīng)驗指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑氣相色譜儀(Agilent 7890B)，配有火焰離子化檢測器；自動進樣系統(tǒng)(Agilent 7697A)頂空進樣器；頂空瓶(20 mL)；定量環(huán)(1 mL)；精密移液器(20～200 μL，100～1 000 μL)；封口鉗；硅橡膠墊、鋁帽。ELGApurelab flex2超純水儀(18.2 MΩ·cm，英國)。乙醇標準溶液(sigma公司，濃度分別為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、0.8 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL)；叔丁醇標準溶液(天津市光復(fù)精細化工研究所，GCS 5 mL/支)；混合醇標準溶液A-061(4 mg/mL，美國Cerrilliant公司)，組成為甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 實驗條件

1.2.1 Agilent 7890B氣相色譜儀條件 色譜柱：HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；DB-ALC2(30 m×0.32 mm×1.20 μm)；柱溫：40 ℃；檢測器：火焰離子化檢測器(FID)；檢測器溫度：300 ℃；進樣口溫度：200 ℃；載氣流速：1.8 mL/min；隔墊吹掃速度：3 mL/min。

1.2.2 Agilent 7697A頂空自動進樣器條件 傳輸線溫度：100 ℃；樣品瓶加熱平衡時間：10 min。程序升溫程序為：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至110 ℃。

1.3 研究方法

1.3.1 離體血液中乙醇單因素穩(wěn)定性模型構(gòu)建 模型構(gòu)建時選擇了兩個已知濃度分別為1.31 mg/mL(sample1)和0.61 mg/mL(sample2)的離體血液樣品和一個已知濃度為0.1 mg/mL(control sample)乙醇標準溶液作為質(zhì)量控制樣品。離體血液乙醇單因素穩(wěn)定性研究模型的構(gòu)建是在空白全血中加入一定量的乙醇標準溶液制得，且空白全血中無凝血并不含傳染病菌及干擾乙醇測定的揮發(fā)性物質(zhì)。乙醇標準溶液是5 g乙醇標樣加超純水稀釋至50 mL制得。血液體積5 mL，密閉在抗凝管中，置于冰箱4 ℃冷藏。

1.3.2 內(nèi)標工作溶液的配制 稱取0.5 g叔丁醇標準溶液置于100 mL容量瓶中，超純水稀釋至刻度，所得母液濃度為5 mg/mL。移取0.8 mL母液置于100 mL容量瓶中，超純水稀釋至刻度，所得內(nèi)標工作溶液濃度為0.04 mg/mL。

1.3.3 實驗操作 取已知濃度的乙醇樣品100 μL及叔丁醇內(nèi)標工作溶液(0.04 mg/mL)500 μL加入頂空瓶內(nèi)，封口鉗將其迅速密封，混勻后置于頂空進樣器內(nèi)加熱待檢。已知濃度質(zhì)量控制樣品(0.1 mg/mL)的處理方式同乙醇樣品。

1.3.4 HS-GC-IS方法的驗證 對檢出限、線性范圍、日內(nèi)精密度、日間精密度進行驗證。以信噪比S/N≥3時的濃度作為檢出限，回歸分析采用線性模型，用最小二乘法進行擬合。日內(nèi)精密度的計算方法為同一份樣品一天內(nèi)平行測定7次，計算相對標準偏差(RSD)；日間精密度的計算方法為同一份樣品連續(xù)測定三天，計算相對標準偏差(RSD)。

1.3.5 穩(wěn)定性研究 實驗中對1.3.1穩(wěn)定模型進行研究，每隔一個月測定樣品sample1和sample2的BEC-IV，連續(xù)測定七個月。測試過程中實驗環(huán)境保持在25 ℃，相對濕度保持在小于等于80%。每次離體血液樣品取樣結(jié)束后立即塞上密封塞并用封口膜封口，置于4 ℃冰箱中冷藏保存。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，由“均數(shù)±標準差”表示處理后的數(shù)據(jù)，并對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P<0.05則差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HS-GC-IS方法的建立和優(yōu)化實驗中優(yōu)化了進樣量、升溫程序、色譜柱等一系列色譜條件，從而確定了1.2.1部分的實驗條件。優(yōu)化條件時重點探討了不同型號色譜柱對血液中乙醇定性分析的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DB-ALC2柱和HP-5柱相比，同樣的柱長和內(nèi)徑，DB-ALC2柱的分離能力更強，色譜峰更對稱(見圖1和圖2)。在該柱上乙醇的出峰時間(3.697 min)和叔丁醇內(nèi)標的出峰時間(4.704 min)時間間隔為1.007 min，然而，在HP-5柱上乙醇的出峰時間(1.918 min)和叔丁醇內(nèi)標的出峰時間(2.045 min)時間間隔僅為0.127 min。

圖1 血液樣品在不同型號色譜柱下的流出圖

圖2 混合醇標準品在不同型號色譜柱下的流出圖

因此，實驗最終選擇了DB-ALC2色譜柱。有文獻報道血液在腐敗過程中會產(chǎn)生甲醇、丙酮、正丙醇、異丙醇等[7]，為避免血液腐敗生成物對測定的干擾，最終選擇叔丁醇作為血液中乙醇濃度測定的內(nèi)標物。本研究的實驗結(jié)果也表明4 ℃保存條件下離體血液樣品在保存期間的第二月即開始產(chǎn)生新的物質(zhì)(見圖3)，有研究表明血液樣品在存放半個月或者更長的時間后會產(chǎn)生正丙醇，但是由于樣品的差異性還可能產(chǎn)生其他成分[7]。

圖3 HS-GC-IS下血液樣品和乙醇標準品色譜流出圖

2.2 HS-GC-IS方法的驗證結(jié)果從檢出限、線性范圍、日內(nèi)精密度、日間精密度等方面對HS-GC-IS進行了驗證。檢出限為5 ng/mL，線性范圍為0.01～3 mg/mL，回歸分析采用線性模型，線性方程為Y=1.139 8X+0.004 9(r=0.999 9，其中Y是乙醇峰面積和叔丁醇峰面積的比值，X是乙醇標準溶液的濃度；r是相關(guān)系數(shù))。日內(nèi)和日間精密度結(jié)果見表1，日內(nèi)精密度的范圍是1.43%～4.21%，日間精密度為3.48%。

表1 日內(nèi)精密度和日間精密度

2.3 穩(wěn)定性研究結(jié)果及意義分析BEC-IV穩(wěn)定性結(jié)果見圖4。圖4顯示BEC-IV為1.31 mg/mL的sample1(紅線)在4 ℃冷藏條件下首先快速下降，隨后緩慢上升到接近初始值后再快速下降。4 ℃冷藏放置一定時間后血液中乙醇濃度上升的原因是血液腐敗過程中也會產(chǎn)生乙醇，這提示我們對于腐敗血液樣品不僅要測定乙醇濃度還應(yīng)同時測定生成物如正丙醇的濃度以期得出乙醇的精準濃度，從而保證分析結(jié)果的準確性。BEC-IV為0.61 mg/mL的sample2(藍線)變化趨勢和sample1基本保持一致。已知濃度為0.1 mg/mL的control sample(綠線)乙醇濃度變化在測試的7個月內(nèi)基本保持穩(wěn)定。在給定顯著性水平P=0.05的前提下，通過方差齊協(xié)性檢驗評價sample1、sample2和control sample檢測結(jié)果有無顯著性差異。Sample1的濃度為(1.267±0.058)mg/mL，sample2的濃度為(0.554±0.021)mg/mL，control sample的濃度為(0.094±0.005)mg/mL。同時，進一步通過方差分析評價sample組和control組的檢測結(jié)果有無顯著性差異。統(tǒng)計結(jié)果顯示F=2 594.400，P(sig)=0.000<0.05，說明不同組間的血液中乙醇濃度具有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，進一步進行兩兩多重性比較，結(jié)果顯示不同組間分析具有統(tǒng)計學(xué)意義。BEC-IV的穩(wěn)定性結(jié)果顯示在一個月內(nèi)sample1乙醇濃度減少的相對值為9.8%，sample2乙醇濃度減少的相對值為1.7%。同時，我們進一步考察了血液樣品生成物(見圖3)在研究時間范圍內(nèi)濃度變化趨勢。實驗中觀察到無論穩(wěn)定性模型的樣品起始濃度是1.31 mg/mL還是0.61 mg/mL，生成物的絕對濃度隨著時間都呈上升趨勢；并且，血液中乙醇起始濃度對其絕對濃度影響不大(見圖5)，因此我們推測該物質(zhì)并不是由乙醇變化產(chǎn)生的，極有可能是血液的腐敗產(chǎn)生的。

圖4 BEC-IV隨時間變化的結(jié)果

圖5 離體血液中生成物濃度隨時間變化的結(jié)果

3 討論

乙醇(ethanol)，分子量46，沸點78.4 ℃，屬揮發(fā)性毒物。頂空進樣法別適用于分析檢測揮發(fā)性毒物。這是因為該方法只將揮發(fā)性組分引入分離系統(tǒng)，排除了生物樣品基質(zhì)的干擾，避免了冗長繁雜的樣品前處理過程。此外，乙醇分子量小、沸點低，適用于氣相色譜法(Gas chromatography,GC)。綜上，頂空-氣相色譜法(Headspace-Gas chromatography,HS-GC)能夠應(yīng)用到血液中乙醇濃度的測定，且具有樣品前處理簡單和分析時間快的優(yōu)點。定量乙醇的方法有外標法和內(nèi)標法。內(nèi)標(internal standard,IS)法和外標法相比，由于該法定量時標準樣品和待測樣品中同等加入了內(nèi)標物，排除了系統(tǒng)誤差，所測定的結(jié)果更加準確。實驗中通過一系列色譜條件優(yōu)化和方法學(xué)驗證，建立了一種BEC-IV測定方法即HS-GC-IS法，并用于BEC-IV單因素4 ℃下的穩(wěn)定型研究。學(xué)者Kosecki P.A等研究結(jié)果表明乙醇濃度的變化和起始濃度無關(guān)[8]，因而模型構(gòu)建時選擇了已知濃度分別為1.31 mg/mL(sample1)和0.61 mg/mL(sample2)的離體血液樣品。結(jié)果表明建立的HS-GC-IS法準確性高、靈敏度高、線性范圍寬。BEC-IV穩(wěn)定性結(jié)果表明對于血液樣品尤其是乙醇濃度高的血液樣品在第一月內(nèi)乙醇濃度降低速率最快；且隨著血液樣品保存時間的延長，濃度由于血液的腐敗會產(chǎn)生新的物質(zhì)濃度。然而，本論文并沒有對新產(chǎn)生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行確證，后期我們將運用質(zhì)譜手段對該物質(zhì)進行定性和定量分析，以期確定它是何種物質(zhì)并進一步探究它和血液樣品中乙醇濃度的相關(guān)性。

綜上所述，本文發(fā)展了一種BEC-IV測定方法即HS-GC-IS法，并運用它對構(gòu)建的BEC-IV單因素穩(wěn)定型研究模型進行分析。結(jié)果表明對于血液樣品尤其是乙醇高的血液樣品應(yīng)盡早檢測，若不能及時檢測應(yīng)冷凍保存以確保樣品復(fù)查結(jié)果的有效性。此外，本工作也提示法醫(yī)毒物司法鑒定人員在分析BEC-IV時還應(yīng)考慮血液腐敗的問題，以期得到準確客觀的數(shù)據(jù)為法醫(yī)毒物司法鑒定項目提供理論參考和經(jīng)驗指導(dǎo)。