神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1對脊髓損傷大鼠運動功能的影響及其機(jī)制

符禹玄，武 庚，侯廣玉，朱 梅，石莉莉，趙富生

(牡丹江醫(yī)學(xué)院1.第一臨床醫(yī)學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，臨床上患者表現(xiàn)為脊髓受損平面以下感覺、運動以及自主神經(jīng)功能暫時或永久性喪失，甚至?xí)＜吧黐1]。SCI的治療一直是世界性難題，目前仍缺乏有效的治療方案。SCI發(fā)生后，在脊柱骨折或脫位等原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上，繼發(fā)局部組織出血、水腫、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等一系列病理變化，加重神經(jīng)功能障礙[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有免疫細(xì)胞，越來越多研究者認(rèn)為，小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎性反應(yīng)的發(fā)動者和調(diào)控者[3]。研究表明，SCI后小膠質(zhì)細(xì)胞活化、極化釋放腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等致炎因子和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡和組織損傷[4]。因此，如何調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)運動功能的恢復(fù)，被認(rèn)為是改善SCI的有效干預(yù)手段。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(neureglin1，NRG-1)是一種含表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)結(jié)構(gòu)域的跨膜信號蛋白，表達(dá)于心肌、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種組織，在突觸塑型、髓鞘形成以及心肌發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[5]。研究表明，NRG-1含有α和β兩種EGF樣結(jié)構(gòu)域，NRG-1β在神經(jīng)系統(tǒng)和心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較高，而NRG-1α主要表達(dá)于乳腺組織[5]。研究發(fā)現(xiàn)，NRG-1通過與其受體ErbB酪氨酸激酶結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，如NRG-1/ErbB結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生異常，可誘發(fā)阿爾茨海默癥等多種神經(jīng)退行性疾病[6]。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，NRG-1能夠促進(jìn)施萬細(xì)胞增殖、遷移和分化，參與神經(jīng)損傷的再生和修復(fù)過程[7]。然而，NRG-1是否能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞極化及炎癥反應(yīng)，改善SCI后運動功能，目前尚不清楚。本研究通過建立大鼠SCI半橫切損傷模型，探討NRG-1對SCI的修復(fù)作用及相關(guān)機(jī)制，以期為臨床SCI治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡健康雄性SD大鼠36只，由牡丹江醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號SYXK(黑)2019-006。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24 ℃，濕度42%～46%，晝夜12 h交替光照，自由攝食飲水。實驗過程符合國家及單位實驗動物管理和使用規(guī)定。

1.1.2 主要試劑與儀器 ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；兔抗鼠IBA1抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、PVDF膜(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TNF-α、IL-1β和IL-6試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)；激光共聚焦顯微鏡(Zeiss公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；Image-Pro PLUS圖像分析軟件(MeyerInstruments公司)。

1.2 方法

1.2.1 脊髓半橫切模型制備 參照文獻(xiàn)[8]，建立脊髓半橫切模型。戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取俯臥位，背部正中縱行切口鈍性分離筋膜及雙側(cè)椎旁肌，暴露T7-T9棘突、雙側(cè)椎板以及橫突，剪除T8棘突及棘突下椎板暴露脊髓，虹膜刀避開血管垂直刺入右側(cè)脊髓至椎管底部，刀鋒向右劃動至脊髓半橫斷。大鼠出現(xiàn)連續(xù)性鼠尾擺動，后肢痙攣性回彈，右后肢癱軟、肌張力消失、針刺無反應(yīng)，提示造模成功。逐層縫合硬脊膜、肌肉、筋膜和皮膚，注青霉素(20萬U/kg)，2 次/d，連續(xù)3 d，將飼料和飲水置于動物可及范圍，保持墊料干燥。

1.2.2 動物分組及處理 將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、脊髓半橫切模型組(SCI)和治療組(NRG-1)，每組12只。sham組:僅行椎板切除術(shù)，不損傷脊髓；NRG-1組:脊髓右側(cè)半橫切后，尾靜脈注射100 μL NRG-1 β(10 μg/kg)，1次/d，連續(xù)注射4周；SCI組:脊髓右側(cè)半橫切后，尾靜脈注射等量PBS溶液。

1.2.3 BBB運動功能評分 術(shù)后第1、7、14、21、28天，各組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行BBB評分。BBB運動功能評分范圍為0～21分，0分表示大鼠后肢癱瘓，21分為大鼠后肢運動功能正常。BBB評分采用雙盲、雙人獨立完成評分，結(jié)果取平均值。

1.2.4 Nissl染色 術(shù)后第28天，取各組大鼠用戊巴比妥鈉過量麻醉后，剖胸左心室灌注4%多聚甲醛，切取0.5 cm損傷節(jié)段脊髓，制備石蠟切片，經(jīng)脫蠟和水化后，將切片置Nissl染液染色。光學(xué)顯微鏡觀察脊髓組織神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化以及尼氏體密度。

1.2.5 免疫熒光染色 術(shù)后第28天，采用戊巴比妥鈉過量麻醉處死大鼠，取損傷節(jié)段脊髓，制備冰凍切片，行免疫熒光染色。切片經(jīng)固定、打孔、封閉后，加兔抗大鼠IBA1一抗(稀釋度1∶200)，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，次日加Cy3標(biāo)記的二抗，DAPI染核，采集圖像并采用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.2.6 Western blot蛋白檢測 取各組大鼠損傷節(jié)段脊髓提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白含量。通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)模及封閉后，加iNOS(1∶1000)和β-actin(1∶2000)一抗，4 ℃孵育過夜，次日加二抗，37 ℃孵育2 h，滴加ECL發(fā)光試劑成像，應(yīng)用ImageJ軟件分析目的蛋白條帶相對灰度值。

1.2.7 ELISA實驗 按照試劑盒說明書操作,檢測脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，樣品孔中加入待測樣品及稀釋液，37 ℃孵育，加顯色劑和終止液，酶標(biāo)儀在450 nm波長處測各孔光密度(OD)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。BBB實驗數(shù)據(jù)采用多因素方差分析，組間不同時間點的多重比較采用LSD法；其余實驗組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NRG-1對SCI大鼠運動功能影響術(shù)前各組大鼠BBB評分均為21分。術(shù)后第7天和第14天，SCI組和NRG-1組BBB評分均逐漸增高，但兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。術(shù)后第21天和第28天，NRG-1組BBB評分顯著高于SCI組(P<0.05)，見圖1。

圖1 ConA誘導(dǎo)肝損傷模型小鼠血清ALT和AST變化

2.2 NRG-1對神經(jīng)元損傷的影響各組大鼠脊髓組織Nissl染色及尼氏體密度分析如圖2所示。SCI組脊髓組織空洞較多，神經(jīng)元破壞、溶解，尼氏體密度降低；經(jīng)NRG-1治療后，脊髓組織中空洞減少，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，尼氏體密度明顯增加。

圖2 大鼠脊髓組織Nissl染色

2.3 NRG-1對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響各組大鼠脊髓組織IBA1免疫熒光染色以及熒光強(qiáng)度分析如圖3所示,與sham組相比，SCI組IBA1熒光強(qiáng)度值顯著增高(P<0.05);與SCI組相比，NRG-1組熒光強(qiáng)度值顯著降低(P<0.05)，但仍高于sham組(P<0.05)。

圖3 NRG-1對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

2.4 NRG-1對小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化的影響各組大鼠脊髓組織M1型小膠質(zhì)標(biāo)志蛋白iNOS分析如圖4示,與sham組相比,SCI組iNOS蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與SCI組相比,NRG-1組iNOS蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),但仍高于sham組(P<0.05)。

圖4 各組大鼠脊髓組織iNOS蛋白表達(dá)比較

2.5 NRG-1對炎癥因子表達(dá)的影響各組大鼠脊髓組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量如圖5所示。與sham組相比，SCI組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著增加(P<0.05)；與SCI組相比，NRG-1組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)，但仍高于sham組(P<0.05)。

圖5 NRG-1對大鼠脊髓組織炎癥因子表達(dá)的影響

3 討論

SCI是由交通事故、高空墜落、自然災(zāi)害等因素引起的一類致殘率很高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病。目前，SCI治療多通過藥物或手術(shù)等方式緩解癥狀，延緩并發(fā)癥發(fā)生，難以從根本上恢復(fù)受損神經(jīng)功能，給患者身心造成極大傷害，同時也給社會和家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)研究報道，我國每年遭受SCI困擾的患者約3～5萬人，且呈現(xiàn)逐年增加趨勢[9]。研究表明，NRG-1具有促進(jìn)軸突再生以及髓鞘形成的作用，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過尾靜脈注射NRG-1能夠減輕SCI導(dǎo)致的運動功能障礙，促進(jìn)大鼠后肢運動功能的恢復(fù)。有研究報道，鞘內(nèi)注射NRG-1蛋白可以抑制損傷區(qū)脊髓組織膠質(zhì)瘢痕形成，減輕局部炎癥反應(yīng)，改善SCI后大鼠肢體運動功能[11]。在本研究中，尼氏染色結(jié)果顯示，NRG-1能夠減輕大鼠損傷區(qū)脊髓組織神經(jīng)元核固縮，恢復(fù)神經(jīng)元尼氏體密度。我們推測，NRG-1可能通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用。生理條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息態(tài)，發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。在病理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化轉(zhuǎn)化成為具有遞呈抗原和釋放促炎癥細(xì)胞因子的經(jīng)典激活型(M1)小膠質(zhì)細(xì)胞，吞噬異常蛋白、核酸和死亡細(xì)胞，增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)對病理性刺激的防御能力。然而，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞也具有誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡、加重神經(jīng)炎性反應(yīng)以及神經(jīng)組織損傷等神經(jīng)毒性作用。選擇性激活型(M2)小膠質(zhì)細(xì)胞具有釋放營養(yǎng)因子和抗炎細(xì)胞因子，吞噬死亡細(xì)胞和異常蛋白，促進(jìn)神經(jīng)元存活和組織修復(fù)，支持和保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能完整性的作用[12]。本研究結(jié)果表明，NRG-1能夠抑制SCI誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，并能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化標(biāo)志蛋白iNOS的表達(dá)，提示NRG-1具有調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化的功能。研究發(fā)現(xiàn)，SCI可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，這些炎癥細(xì)胞因子可刺激誘導(dǎo)其它炎癥介質(zhì)產(chǎn)生。同時，這些炎癥細(xì)胞因子也可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，加重SCI后神經(jīng)組織的炎癥損傷[13]。本研究表明，損傷脊髓組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均出現(xiàn)不同程度升高，經(jīng)NRG-1處理后IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著降低。這些變化表明，SCI可導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，加重脊髓損傷局部炎癥反應(yīng)，NRG-1能夠抑制IL-1β、IL-6、TNF-α產(chǎn)生，從而減輕SCI引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，發(fā)揮脊髓保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實NRG-1能夠促進(jìn)SCI大鼠運動功能恢復(fù)，其作用機(jī)制可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化，減輕炎性反應(yīng)和改善神經(jīng)元損傷有關(guān)。本研究結(jié)果為SCI治療提供了一定的實驗依據(jù)。但NRG-1的神經(jīng)保護(hù)分子機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。