巨噬細(xì)胞遷移抑制因子介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的保護(hù)性自噬對(duì)肝癌細(xì)胞化療敏感性的影響及機(jī)制研究①

許羚雁 黃子京 劉玉波 覃 西 韓 誠(chéng) （海南省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，?？?70000）

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤之一，在我國(guó)發(fā)病率及病死率均居惡性腫瘤前列［1］。盡管近年HCC臨床診療取得了較大進(jìn)展，但復(fù)發(fā)率高，且極易對(duì)常規(guī)化療藥物耐藥，患者預(yù)后仍不理想。而低氧作為實(shí)體腫瘤微環(huán)境的共同特征，大量研究證實(shí)其能夠誘發(fā)HCC 細(xì)胞對(duì)周圍不利環(huán)境的適應(yīng)性應(yīng)答，為HCC 生存提供巨大的選擇壓力，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生更強(qiáng)的耐藥性［2-3］。但缺氧誘導(dǎo)HCC 耐藥的具體機(jī)制尚不清楚。研究表明，自噬是低氧條件下參與HCC 化療的一種保護(hù)性方式，且化療誘導(dǎo)的低氧細(xì)胞死亡率明顯低于常氧細(xì)胞［4-5］。提示自噬參與了低氧誘導(dǎo)化療耐藥性的過程。

巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）最初被認(rèn)為是一種T 細(xì)胞來源的淋巴因子，但近年研究表明MIF具有多種功能，不僅能夠抑制巨噬細(xì)胞的遷移抑制作用，還具有強(qiáng)大的免疫刺激和促炎活性［6］。同時(shí)，MIF 在多種腫瘤中表達(dá)顯著增加，而炎癥對(duì)腫瘤形成發(fā)揮重要促進(jìn)作用，如包括HCC 在內(nèi)的多種癌癥均起源于感染、慢性刺激或炎癥［7-8］。MIF 具有廣泛的促腫瘤活性，不僅能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)新生血管形成，還能抑制腫瘤細(xì)胞死亡［7］。進(jìn)一步分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，MIF能夠激活腫瘤細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、存活和轉(zhuǎn)移［9］。此外，MIF 還能在低氧或饑餓條件下誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而抑制不利環(huán)境介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［10］。提示MIF能夠在低氧環(huán)境中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存及進(jìn)展，推測(cè)MIF 可能同樣促進(jìn)低氧條件下HCC 細(xì)胞化療耐藥性產(chǎn)生。本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明HCC 化療耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制，以期為臨床更好地改善HCC 患者預(yù)后提供治療靶點(diǎn)和新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料 人HCC 細(xì)胞系Huh7、HepG2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；DMEM、胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco公司）；5-氟尿嘧啶（5-flu?orouracil，5-FU）、CCK-8 試劑、青霉素（100 U/ml）與鏈霉素（100 μg/ml，美國(guó)Sigma 公司）；靶向敲低MIF表達(dá)的siRNA（si-MIF）及隨機(jī)對(duì)照siRNA（si-NC）和表達(dá)上述si-MIF與si-NC序列的慢病毒載體（蘇州吉瑪基因有限公司）；Ki67 免疫組織化學(xué)染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；TUNEL 凋亡試劑盒（瑞士Roche公司）；大鼠抗HIF-1α、MIF、LC3-Ⅰ/-Ⅱ單克隆抗體（美國(guó)Pierce Biotechnology 公司）；大鼠抗Atg5、GAPDH 單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗大鼠IgG（美國(guó)Abcam 公司）；LipofectaminTM2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Themo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、處理及轉(zhuǎn)染 Huh7 和HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS 與1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。低氧處理的Huh7 和HepG2 細(xì)胞采用上述相同培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2、1%O2、94%N2的恒溫低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取正常培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Huh7 和HepG2 細(xì)胞，常規(guī)消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，接種至12 孔板，培養(yǎng)24 h 后，按LipofectaminTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書將si-MIF 與si-NC 轉(zhuǎn)染至Huh7 和HepG2 細(xì)胞，正常孵育6 h 后更換為含10%FBS、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，取轉(zhuǎn)染24 h 的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將Huh7 和HepG2 細(xì)胞分為4 組：正常對(duì)照組（Con?trol，正常培養(yǎng)）、低氧處理組（HYP，低氧條件培養(yǎng)）、HYP+si-NC 組（低氧條件下轉(zhuǎn)染si-NC）、HYP+si-MIF組（低氧條件下轉(zhuǎn)染si-MIF）。

1.2.2 CCK-8 檢 測(cè)HCC 細(xì) 胞 對(duì)5-FU 的 敏 感 性取轉(zhuǎn)染后的Huh7 和HepG2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5 000 個(gè)/孔，接種至96 孔板，按1.2.1 分組處理，常氧或低氧條件培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)基中加入一定濃度5-FU（0、10、25、50、100、200、400 μg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)終止后每孔加入10 μl CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度。各藥物濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，計(jì)算5-FU 對(duì)各組Huh7 與HepG2 細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 32只4周齡（體質(zhì)量約15 g）BALB/c 雄性裸鼠購(gòu)自海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為4 組（n=8）：Control 組、5-FU 組、5-FU+si-NC 組和5-FU+si-MIF 組。取約5×106個(gè)感染si-MIF 或si-NC 慢病毒的Huh7 細(xì)胞重懸于200 μl PBS溶液，注射于5-FU+si-NC 組和5-FU+si-MIF 組裸鼠右上肢腋下。Control 組與5-FU 組注射等數(shù)量Huh7細(xì)胞。5-FU 組、5-FU+si-NC 組和5-FU+si-MIF 組裸鼠腹腔注射5-FU（50 mg/kg），1 次/d，持續(xù)7 d。每3 d測(cè)量腫瘤體積（腫瘤體積=0.5×長(zhǎng)×寬2），觀察30 d后處死小鼠，摘取腫瘤組織，測(cè)量后固定，切片，按Ki67 免疫組化及TUNEL 染色試劑盒說明進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)海南省腫瘤醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有操作嚴(yán)格按照國(guó)際動(dòng)物研究指導(dǎo)原則進(jìn)行。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)HCC 細(xì)胞中HIF-1α、MIF及凋亡相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ/-Ⅱ、Atg5 表達(dá) 取待測(cè)細(xì)胞或經(jīng)液氮研磨的腫瘤組織，加入RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑提取總蛋白，上述操作均在冰上完成。4 ℃、1 200 r/min 離心10 min，取底層沉淀，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取約35 μg 總蛋白進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入HIF-1α（1：800）、MIF（1：800）、LC3-Ⅰ/-Ⅱ（1：1 000）、Atg5（1：1 000）、GAPDH（1：2 000）一抗，4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1：5 000）。ECL凝膠成像，觀察蛋白條帶。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件進(jìn)行量化分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0和GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用LSD-t分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧誘導(dǎo)HCC細(xì)胞HIF-1α與MIF蛋白表達(dá)Western blot 結(jié)果顯示，隨著低氧處理時(shí)間增加，Huh7 與HepG2 細(xì)胞HIF-1α 與MIF 蛋白表達(dá)逐漸升高。與Control 組相比，低氧處理6 h、12 h、24 h 的HCC 細(xì)胞中HIF-1α 與MIF 蛋白顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），HYP 24 h組升高最為顯著（P＜0.01，圖1）。

圖1 低氧促進(jìn)HCC細(xì)胞HIF-1α與MIF蛋白表達(dá)Fig.1 Hypoxia promotes protein expressions of HIF-1α and MIF in HCC cells

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA后HCC細(xì)胞MIF蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，轉(zhuǎn)染si-MIF的Huh7與HepG2 細(xì)胞MIF 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染si-NC 的細(xì)胞MIF 蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05，圖2）。

圖2 Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA 后HCC 細(xì) 胞MIF 蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot to detect protein expression of MIF in HCC cells transfected with siRNA

2.3 敲低MIF促進(jìn)低氧條件下HCC細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性 CCK-8 結(jié)果顯示，隨5-FU 濃度增加，Huh7與HepG2 細(xì)胞增殖活性均呈降低趨勢(shì)。與Control組相比，HYP 組與HYP+si-NC 組5-FU IC50明顯升高（P＜0.05），而HYP+si-MIF 組顯著降低（P＜0.05）；與HYP 組相比，HYP+si-MIF 組5-FU IC50顯著降低（P＜0.05），HYP+si-NC組無明顯差異（P＞0.05，圖3）。

圖3 敲低MIF促進(jìn)低氧條件下HCC細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性Fig.3 Knockdown of MIF promotes 5-FU sensitivity of HCC cells under hypoxic condition

2.4 敲低MIF 抑制低氧介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬Western blot 結(jié)果顯示，與Control 組相比，HYP 組與HYP+si-NC 組HIF-1α 和Atg5 蛋 白 表 達(dá) 及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯升高（P＜0.05），HYP+si-MIF組顯著降低（P＜0.05）；與HYP組相比，HYP+si-MIF組HIF-1α和Atg5 蛋 白 表 達(dá) 及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明 顯 降 低（P＜0.05），HYP+si-NC 組上述蛋白無明顯變化（P＞0.05，圖4）。

圖4 敲低MIF抑制低氧介導(dǎo)的HCC細(xì)胞自噬Fig.4 Knockdown of MIF inhibits hypoxia mediated autophagy in HCC cells

2.5 敲低MIF 表達(dá)促進(jìn)5-FU 對(duì)裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用 肝癌細(xì)胞Huh7 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，5-FU 組、5-FU+si-NC 組和5-FU+si-MIF 組腫瘤體積顯著減?。≒＜0.05），而與5-FU 組相比，5-FU+si-MIF 組腫瘤體積明顯減?。≒＜0.05），5-FU+si-NC 組無明顯變化（P＞0.05）。各組裸鼠腫瘤組織Ki67 免疫組化及TUNEL 染色結(jié)果顯示，與Control組相比，5-FU組、5-FU+si-NC組和5-FU+si-MIF 組Ki67 表達(dá)陽(yáng)性率顯著降低（P＜0.05），而TUNEL 陽(yáng)性率明顯提高（P＜0.05），5-FU+si-MIF 組Ki67 陽(yáng)性表達(dá)和TUNEL 降低趨勢(shì)更為明顯（P＜0.05），5-FU+si-NC組無明顯變化（P＞0.05，圖5）。

圖5 敲低MIF 表達(dá)促進(jìn)5-FU 對(duì)裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用Fig.5 Knockdown of MIF promotes inhibitory effect of 5-FU on tumor growth in nude mice

2.6 敲低MIF表達(dá)抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤自噬 Western blot 檢測(cè)各組裸鼠腫瘤組織MIF、HIF-1α、LC3 和Atg5 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與Control 組相比，5-FU組、5-FU+si-NC 組和5-FU+si-MIF 組腫瘤組織MIF、HIF-1α 和Atg5 蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯降低（P＜0.05），5-FU+si-MIF 組中上述蛋白降低趨勢(shì)更為顯著（P＜0.05），5-FU+si-NC 組無明顯變化（P＞0.05，圖6）。

圖6 敲低MIF表達(dá)抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤自噬Fig.6 Knockdown of MIF inhibits autophagy in nude mice

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，MIF 作為一種多功能細(xì)胞因子能夠參與腫瘤發(fā)生的多個(gè)方面，包括保護(hù)低氧或血清饑餓誘導(dǎo)凋亡促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和遷移等［7，10］。既往研究證實(shí)，MIF 在HCC 組織及細(xì)胞株中表達(dá)異常升高，且能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及血管生成因子表達(dá)［11-12］。但能否調(diào)控HCC化療敏感性尚不清楚。本研究檢測(cè)了低氧條件下MIF 表達(dá)，并進(jìn)一步敲低MIF 觀察其是否影響HCC 細(xì)胞對(duì)5-FU的化療敏感性，結(jié)果表明，低氧能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞中MIF 表達(dá)，而敲低MIF 表達(dá)能夠在體內(nèi)外通過抑制低氧介導(dǎo)的自噬改善HCC 細(xì)胞對(duì)5-FU 的化療抵抗。

腫瘤中的低氧環(huán)境是包括HCC 在內(nèi)多種實(shí)體瘤不良預(yù)后和化療不理想的重要原因。低氧能夠通過改變基因表達(dá)誘導(dǎo)和/或選擇腫瘤細(xì)胞某些特性，如復(fù)制潛能、干細(xì)胞屬性、保護(hù)性自噬和化療及放療耐藥性［13］。HIF-1 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控缺氧相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)性改變。HIF-1主要由缺氧敏感亞基HIF-1α和固定表達(dá)亞基HIF-1β組成。常氧條件下，胞質(zhì)中泛素-蛋白連接酶能夠識(shí)別并羥基化HIF-1α 的脯氨酸殘基，使HIF-1α 失活。但缺氧情況下，HIF-1α 脯氨酸殘基羥基化被抑制，導(dǎo)致HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)［14］。既往研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)MIF 或細(xì)胞外給予人工合成的MIF 均能增加HIF-1α 及相關(guān)基因表達(dá)，可能與MIF 通過抑制p53 轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促進(jìn)泛素-蛋白連接酶對(duì)HIF-1α 的作用降低有關(guān)，故低氧條件下MIF 通過p53依賴途徑促進(jìn)HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)［9］。但另有研究表明MIF 主要與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)中間體Jab1/CSN5 相互作用，而Jab1/CSN5 能夠促進(jìn)HIF-1α 穩(wěn)定［15-16］。提示低氧環(huán)境下MIF 能夠促進(jìn)細(xì)胞HIF-1α 穩(wěn)定表達(dá)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)缺氧條件下HCC 細(xì)胞HIF-1α與MIF 表達(dá)同時(shí)被激活，且敲低MIF 表達(dá)能夠?qū)е翲IF-1α 表達(dá)降低，與既往文獻(xiàn)結(jié)果一致，提示MIF可能通過調(diào)控HIF-1α影響HCC細(xì)胞相關(guān)特性。

機(jī)體多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)了HIF-1α 過表達(dá)現(xiàn)象，而高表達(dá)的HIF-1α能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上述缺氧特性相關(guān)基因激活。大量數(shù)據(jù)證實(shí)，低氧能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低［3-5］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)缺氧條件下的HCC 細(xì)胞對(duì)5-FU 的敏感性顯著降低。雖然這種現(xiàn)象發(fā)生的潛在機(jī)制提出了多種觀點(diǎn)，結(jié)果仍存在爭(zhēng)議，其中低氧誘導(dǎo)的保護(hù)性自噬是目前學(xué)者廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。自噬是一種高度保守的溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞自我降解過程，在細(xì)胞存活中發(fā)揮雙重作用。但在腫瘤中，主流觀點(diǎn)認(rèn)為自噬激活是腫瘤細(xì)胞在外界不利環(huán)境選擇的壓力下向自身提供營(yíng)養(yǎng)與必需物質(zhì)以維持生存和發(fā)展的重要途徑。因此，抑制自噬能夠降低腫瘤細(xì)胞在應(yīng)激條件下的存活率。最新研究表明，MIF 在多種疾病中能通過上調(diào)自噬水平促進(jìn)疾病發(fā)展。如在老年性心臟病研究中，敲除MIF 的小鼠因自噬水平降低加重了衰老誘導(dǎo)的心臟結(jié)構(gòu)與功能不良改變。而阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞早衰卻能被外源性MIF 逆轉(zhuǎn)［17］。而在幽門螺桿菌相關(guān)胃癌中，MIF 能通過促進(jìn)腸化生組織自噬標(biāo)志蛋白LC3 與Atg5 表達(dá)加速細(xì)胞惡化［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低HCC 中MIF表達(dá)能在體內(nèi)外抑制細(xì)胞或腫瘤組織自噬，還可能通過這一作用促進(jìn)5-FU對(duì)HCC的殺傷抑制能力。

綜上，HCC 的低氧環(huán)境能夠促進(jìn)MIF 表達(dá)上調(diào)，而敲低MIF 表達(dá)可能通過抑制腫瘤細(xì)胞及組織HIF-1α 介導(dǎo)的保護(hù)性自噬促進(jìn)HCC 化療敏感性。提示MIF 可能在HCC 的化療耐藥性形成中發(fā)揮潛在促進(jìn)作用，而MIF/HIF-1α/自噬軸有望成為改善HCC預(yù)后的治療靶點(diǎn)。