果王素通過下調轉化生長因子-β1表達抑制大鼠肺纖維化①

魏文婕 賀立洋 尹 勤 劉理靜 周美玲 賀兼斌

（南華大學附屬懷化醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，懷化418000）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種慢性、進行性、間質性肺疾病，具有一定的破壞性，屬于纖維增殖性疾病范疇，其在影像學及病理學上的表現與普通型間質性肺炎相同或相似，預后極差，平均存活期只有3～5年，五年存活率僅為20%，而病死率接近50%［1］。PF 的致病因素有很多，包括吸煙、感染、藥物不良反應、毒物、自身免疫等，其發(fā)病機制主要與肺泡上皮細胞反復的損傷及修復有關，并有多種細胞因子及多條信號通路參與，其中轉化生長因子-β1（transform growth factor，TGF-β1）被認為是PF 發(fā)生過程中作用最重要的細胞因子之一［2］。果王素（中華獼猴桃果仁非飽和脂肪酸）為獼猴桃果仁提取的果仁油，主要成分為α亞麻酸，還含有維生素E及硒，既往研究顯示，果王素有抗炎、抗氧化、抗癌等作用，對多種疾病的防治具有極高的價值［3-4］。但其對PF的防治作用報道極少，本研究通過不同濃度果王素干預博萊霉素所致PF大鼠，在不同時間點觀察大鼠PF的病變程度，并測定羥脯氨酸（hydroxy?proline，HYP）、TGF-β1 蛋白及mRNA 含量，探索果王素是否通過調節(jié)TGF-β1 發(fā)揮抗大鼠PF 的作用，并探討其給藥濃度對大鼠PF的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡雄性SD 大鼠128只，體質量（210±15）g，清潔級，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2019-0014。

1.1.2 藥物和試劑 果王素（中華獼猴桃果仁非飽和脂肪酸含量600 g/L）購自湘西老爹生物有限公司，批號：XH20200921；博萊霉素A5 購自天津太河制藥有限公司；醋酸潑尼松片購自山東魯抗醫(yī)藥集團有限公司；HYP 含量檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HRP 標記的山羊抗兔、兔抗山羊、山羊抗大鼠抗體購自美國Jackson公司；β-actin購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；DAB 顯色劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 實驗儀器 電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；脫水機、包埋機購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司；載玻片、蓋玻片均購自江蘇世泰實驗器材有限公司；移液槍購自Dragon 公司；電泳儀購自北京六一儀器廠；感光膠片購自美國Kodak公司；掃描儀購自日本EPSON 公司；顯微鏡購自日本尼康公司；qRT-PCR 儀購自美國Roche 公司；凝膠圖像分析系統(tǒng)采用美國自然基因公司提供的Alpha軟件。

1.2 方法

1.2.1 PF 模型的制備和分組處理 將128 只8 周齡的SD 大鼠隨機分為空白組（對照組）、模型組、潑尼松組（5 mg/kg）、果王素低劑量組（60 mg/kg）、果王素中劑量組（120 mg/kg）、果王素高劑量組（180 mg/kg）（劑量根據本課題組前期研究及相關文獻擬定［3，5］），其中空白組8 只，其余各組24 只。在SPF 實驗條件下適應性飼養(yǎng)1周后，用20 g/L戊巴比妥鈉按45 mg/kg經腹腔注入大鼠體內進行麻醉，隨后無菌操作下行氣管正中切開，使大鼠氣管充分暴露，向除空白組外各組大鼠氣管內注入5 mg/kg 博萊霉素A5（溶解于0.2 ml 0.9%氯化鈉溶液中），并直立及旋轉大鼠，使藥物在其肺內均勻分布，構建PF模型，空白組則氣管內注入0.2 ml 0.9%氯化鈉溶液，其余操作同其他各組。于注入博萊霉素A5 后的第2 天開始進行藥物干預，空白組及模型組每天以0.9%氯化鈉2 ml 灌胃，潑尼松組用醋酸潑尼松5 mg/kg 溶入0.9%氯化鈉2 ml 中進行灌胃，果王素低、中、高劑量組分別以果王素60、120、180 mg/kg 加入2 ml 0.9%氯化鈉中進行灌胃，各組均每天灌胃1 次，共用藥28 d。除空白對照組外，各組大鼠于構建PF 模型后第7、14、28 天分別處死8 只，空白組于28 d 全部處死。所有大鼠均采用斷頭法處死，并于無菌條件下開胸，分離留取肺組織，隨后將左肺組織凍存，用于HYP 含量和TGF-β1 mRNA 及蛋白表達的檢測，右肺組織經主支氣管注入10%中性甲醛溶液充分擴展，并于10%中性甲醛溶液中固定，用于肺組織病理學檢查。

1.2.2 HE 和Masson 染色觀察肺組織病理變化右肺組織行石蠟包埋后，以5 μm 厚度切片，再行常規(guī)HE 和Masson 染色，在光鏡下使用圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0）行肺泡炎及PF評分［6］。肺泡炎評分：0 分為肺組織無炎癥細胞浸潤、間質水腫及出血；1 分為肺組織炎癥浸潤＜20%；2 分為浸潤面積20%～50%；3分為浸潤面積＞50%并伴有嚴重肺組織結構破壞。纖維化評分［7］：0 分為肺組織無纖維化；1分為擴大的肺泡及輕度增寬的間質（≤正常3倍）面積＜20%；2 分為間質輕度增厚但無肺組織結構破壞；3分為間質增寬（＞正常3倍）并伴纖維組織增多；4 分為肺組織輕度破壞及纖維化面積＜10%；5 分為纖維化面積占鏡下視野10%～50%；6分為肺組織嚴重破壞且纖維化面積＞50%；7 分為肺毀損及蜂窩肺；8分為大片彌漫性PF。

1.2.3 肺組織HYP 含量檢測 取適量左肺組織，于冰面上稱重、剪碎，按堿水法制備成10%肺組織勻漿，4 000 r/min 離心10 min 并提取上清液，將樣品pH調節(jié)至6.0～6.8。隨后取雙蒸水稀釋至10 ml，并取其中3 ml加入25 mg活性炭，混勻后以3 500 r/min離心10 min，取上清液1 ml。隨后向空白管、標準管、測定管中分次加入所需的雙蒸水、標準液、檢測液、試劑等，混勻后于60 ℃水浴15 min，冷卻后于3 500 r/min離心10 min，最后取上清液于波長550 nm處測定各管吸光度，并計算HYP含量。

1.2.4 免疫組化法檢測大鼠肺組織TGF-β1 取肺組織包埋于石蠟切片中，經脫水、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶后，用血清室溫封閉切片30 min，隨后加入一抗，并于濕盒內4 ℃孵育過夜，次日滴加二抗，并于室溫孵育50 min，隨后通過DAB 顯色、蘇木精復染、脫水封片后，采用數字切片掃描儀獲取圖像，觀察染色結果，每個樣本分別取5 個不同視野，用Image-Pro Plus 6.0 進行半定量分析。

1.2.5 Western blot 法檢測肺組織TGF-β1 蛋白水平 取適量左肺組織，用RIPA 裂解液提取蛋白質、BCA 法測蛋白濃度，通過SDS-PAGE 電泳、轉PVDF膜及脫脂牛奶封閉后，將HRP 標記的山羊抗大鼠（一抗）稀釋1 000 倍，并于4 ℃孵育過夜，再用TBST在室溫下脫色搖床上洗3 次，5 min/次，將HRP 標記的兔抗山羊（二抗）用TBST 稀釋3 000 倍，室溫下孵育30 min 后，用TBS 在室溫下于脫色搖床上洗3 次，5 min/次，將ECLA 和ECLB 兩種試劑在離心管中等體積混合，將PVDF 膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸，1～2 min 后，去盡殘液，包好，置于暗匣中曝光。最后進行顯影和定影，并將膠片掃描存檔，Photoshop 整理去色，Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標條帶的光密度值，得出TGF-β1蛋白相對表達量。

1.2.6 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測肺組織TGF-β1 mRNA 水平取50 mg 左肺組織，通過Trizol 試劑提取樣本RNA，隨后將RNA反轉錄為cDNA，并行PCR擴增，由武漢博爾夫生物科技有限公司依照表1 所示序列合成qRT-PCR 所用TGF-β1 引物（168 bp）。取10 μl cDNA 稀釋液于熒光定量PCR 儀中，在Bio-Rad CFX Manager 軟件上設定檢測，以GAPDH 為內參照，反應條件：預變性95 ℃5 min，變性95 ℃10 s，退火60 ℃30 s，延伸65～95 ℃，0.5 ℃/5 s，共40 個循環(huán)，計算2-ΔΔCt值，從而分析TGF-β1 mRNA表達。

表1 qRT-PCR所用TGF-β1 引物序列Tab.1 TGF-β1 primers sequences used in qRT-PCR

1.3 統(tǒng)計學分析 所有計量數據采用表示，多樣本均數間采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊時采用LSD 法，方差不齊時則采用Dunnett T3 進行兩兩比較。數據分析采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件完成，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad Prism 9.0軟件對實驗數據作圖。

2 結果

2.1 果王素可改善PF大鼠肺組織炎癥及纖維化程度 空白組大鼠肺組織結構清晰完整，未見炎癥細胞浸潤及纖維化。各時間點下可見空白組外各組大鼠7 d 時炎癥反應最為嚴重，14 d、28 d 時炎癥反應逐漸減輕，HE 染色下，模型組大鼠肺組織7 d 時可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增寬，14 d時炎癥細胞較前稍有減少，肺泡間隔繼續(xù)增寬，并可見部分肺泡融合，28 d時炎癥細胞明顯減少，肺泡間隔增寬明顯，并伴有大量肺泡融合，肺組織結構破壞。Masson 染色下，空白組僅見肺泡上皮細胞表面藍染，其余細胞及組織結構清晰，模型組于7 d 時可見肺泡間隔增寬及少量點片狀藍染的膠原纖維形成，其改變隨時間逐步加重，28 d 時肺泡間隔進一步增寬，其內可見藍染的團塊狀膠原纖維形成，并伴有肺組織破壞。各藥物干預組病理變化趨勢同模型組，但炎癥及纖維化程度較模型組均減低，以果王素高劑量組及潑尼松組最為顯著，見圖1、圖2。通過肺泡炎評分可得出，各藥物干預組評分均低于模型組（P＜0.01 或P＜0.05），其中果王素高劑量組評分低于中、低劑量組（P＜0.01 或P＜0.05），而稍高于潑尼松組，但二者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。PF評分及HYP 含量測定對比，各藥物干預組PF 程度及HYP 含量均低于模型組（P＜0.01 或P＜0.05），果王素各劑量組之間，高劑量組效果最為明顯（P＜0.01或P＜0.05），其與潑尼松組相比，略高于潑尼松組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組肺泡炎評分、PF評分及HYP含量見表2。

表2 各組肺泡炎、PF評分及HYP 含量比較（xˉ±s，n=8）Tab.2 Comparison of alveolitis，PF scores and HYP content in each group（xˉ±s，n=8）

圖1 各組大鼠肺組織HE染色（×200）Fig.1 HE staining of lung tissue of rats in each group（×200）

圖2 各組大鼠肺組織Masson染色（×200）Fig.2 Masson staining of lung tissue of rats in each group（×200）

2.2 果王素可減少大鼠肺組織TGF-β1 蛋白的表達 免疫組化TGF-β1 染色呈黃褐色或棕黃色顆粒分布于肺組織的各種細胞中，7 d時除對照組外各組肺組織TGF-β1 蛋白表達最高，其變化為隨時間推移逐漸減弱。各對應時間點，模型組TGF-β1 蛋白表達最高，果王素高劑量組TGF-β1 蛋白表達明顯低于果王素中、低劑量組，但較潑尼松組稍高，見圖3。各組光密度分析儀半定量分析結果見表3。Western blot 檢測各組大鼠肺組織TGF-β1 蛋白表達與免疫組化結果基本一致，見圖4。

圖4 各時間點各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達Fig.4 TGF-β1 protein expressions in lung tissue of rats in each group at each time point

表3 不同時間點各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白半定量分析（s，n=8）Tab.3 Semi-quantitative analysis of TGF-β1 protein in rat lung tissue at different time points（s，n=8）

表3 不同時間點各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白半定量分析（s，n=8）Tab.3 Semi-quantitative analysis of TGF-β1 protein in rat lung tissue at different time points（s，n=8）

Note：Compared with Blank group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.01；compared with Prednisone group，3）P＜0.01；compared with KFE-L group，4）P＜0.01；compared with KFE-M group，5）P＜0.01.

Groups Blank Model Prednisone KFE-L KFE-M KFE-H 7 d-0.47±0.031）0.27±0.022）0.44±0.022）3）0.33±0.032）3）4）0.29±0.022）4）5）14 d-0.45±0.031）0.23±0.022）0.41±0.032）3）0.30±0.032）3）4）0.25±0.022）4）5）28 d 0.14±0.03 0.41±0.041）0.19±0.032）0.37±0.032）3）0.29±0.042）3）4）0.21±0.042）4）5）

圖3 各組大鼠肺組織TGF-β1免疫組化（×200）Fig.3 TGF-β1 immunohistochemistry of rat lung tissue in each group（×200）

2.3 果王素減少TGF-β1 mRNA的表達 在模型組及各干預組中，大鼠肺組織TGF-β1 mRNA的表達在7 d 時最高，14 d 及28 d 逐步降低。各組中，空白組TGF-β1 mRNA表達最低，模型組表達最高，各藥物干預組中，潑尼松組及果王素高劑量組TGF-β1 mRNA表達明顯低于低劑量及中劑量組（P＜0.01），潑尼松組稍低于高劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其表達與蛋白表達具有一致性，見圖5、表4。

表4 不同時間點各組大鼠肺組織TGF-β1 mRNA 的表達（s，n=8）Tab.4 Expression of TGF-β1 mRNA in lung tissues of rats in different time points（，n=8）

表4 不同時間點各組大鼠肺組織TGF-β1 mRNA 的表達（s，n=8）Tab.4 Expression of TGF-β1 mRNA in lung tissues of rats in different time points（，n=8）

Note：Compared with Blank group，1）P＜0.01；compared with Model group，2）P＜0.01；compared with Prednisone group，3）P＜0.01；compared with KFE-L group，4）P＜0.01；compared with KFE-M group，5）P＜0.01.

Groups Blank Model Prednisone KFE-L KFE-M KFE-H 7 d-1.46±0.031）0.95±0.022）1.36±0.032）3）1.27±0.032）3）4）0.98±0.062）4）5）14 d-1.35±0.031）0.86±0.032）1.26±0.022）3）1.21±0.032）3）4）0.88±0.032）4）5）28 d 0.67±0.04 1.28±0.031）0.79±0.032）1.18±0.032）3）1.01±0.052）3）4）0.82±0.032）4）5）

3 討論

PF 不僅是多種呼吸系統(tǒng)疾病的終末病理表現，也可以是單獨的一種疾病，其具體機制至今尚未明確，現階段雖從TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、MAPK/ERK、NF-κB 等多條信號通路及Snail、ZEB、Twist、CTGF、Vimentin 等多種細胞因子對PF 進行研究，但用于臨床治療的卻只有少數［8-15］。TGF-β1被認為是PF 形成過程中作用最直接的細胞因子，多項研究表明，其可通過誘導成纖維細胞的增殖與分化、促進細胞外基質合成、增加膠原蛋白沉積等作用推動PF形成與發(fā)展［16-19］。

在PF的產生與發(fā)展過程中幾乎都有TGF-β1的參與，其機制主要有：①抑制炎癥反應［3］；②通過多條信號通路誘導上皮-間質轉化；③促進肺泡Ⅱ型上皮細胞向Ⅰ型上皮細胞轉變；④通過增加α-平滑肌肌動蛋白含量誘導肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化［20］；⑤通過刺激成纖維細胞合成ECM、抑制細胞外基質降解酶（MMPs）的活性、增強細胞外基質受體的表達，從而增加ECM 的形成并減少其降解。TGF-β1在被發(fā)現之初，便在體外試驗中被證實了其對哺乳動物損傷后的修復和膠原蛋白的沉積具有潛在作用，現在越來越多的研究表明，TGF-β1 在PF 發(fā)展過程中發(fā)揮樞紐作用，因此，通過TGF-β1 探索PF的形成機制至關重要。

既往研究表明，果王素具有降低血脂、減少炎癥細胞因子、減少肝臟丙二酰CoA 含量、增強機體免疫功能、抑制腫瘤細胞的增殖等作用［21］。但其能否通過調節(jié)TGF-β1起到抑制PF的作用暫未得到證實。本實驗結果顯示，通過博來霉素造模后，模型組在28 d中的病理變化符合PF的病理改變，表明造模成功。本研究中，除空白組外，其余各組大鼠肺組織在7 d、14 d、28 d 3 個時間點，可見其炎癥細胞浸潤在7 d 時到達高峰，但隨時間的推移逐漸減少，而肺泡的融合、間隔增厚及纖維化程度卻逐漸加重，可見大鼠肺組織炎癥浸潤隨著時間逐漸減輕，但其對肺組織的損害及纖維化卻呈進行性加重。通過肺泡炎及PF評分可見各干預組間，模型組大鼠肺組織損傷及纖維化程度最重，潑尼松組最輕，但與果王素高劑量組間差異無統(tǒng)計學意義，果王素各劑量組中，則是隨著劑量的增高，嚴重程度逐漸減低，且各組間差異有統(tǒng)計學意義，HYP 作為PF 的定量評估指標，與各組PF 的病理改變相一致，以上病理變化說明果王素對PF有治療作用，且使用高劑量時其治療作用在本研究中與激素作用相當，除對照組外各組大鼠肺組織中TGF-β1 蛋白及mRNA 在第7 天時表達最為顯著，為3 個時間點表達的最高峰，且其表達隨時間的推移逐漸下降。各組間比較，空白組大鼠肺組織TGF-β1蛋白及mRNA表達始終低于其他各組，而模型組的表達最高，果王素干預組中，果王素高劑量組TGF-β1蛋白及mRNA表達最低，且隨劑量的減少，其表達逐漸增高。潑尼松組TGF-β1 蛋白及mRNA 的表達均低于果王素高劑量組，但差異均無統(tǒng)計學意義。說明果王素可能通過下調TGF-β1蛋白及mRNA表達抑制PF。

綜上所述，果王素可能通過調節(jié)TGF-β1 發(fā)揮抑制PF 的作用，在本研究中其效果與激素相當，果王素為中華獼猴桃果仁提取物，無激素副作用，這一研究為PF的治療拓寬了道路，但其是否能用于臨床治療還需進一步深入研究。