響應(yīng)面法優(yōu)化QuEChERS提取凈化小麥中嘔吐毒素工藝

◎ 王媛媛

（安徽中青檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，安徽 合肥 230088）

嘔吐毒素（Vomitoxin），主要成分為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），屬于單端孢霉烯族毒素，是小麥中常見的一種真菌毒素，是人類食品和動(dòng)物飼料中檢出率、超標(biāo)率最高的真菌毒素。嘔吐毒素對(duì)人體可引起惡心嘔吐、免疫力降低等癥狀，具有潛在的致癌、致畸、致突變作用。我國(guó)傳統(tǒng)飲食習(xí)慣中，糧谷比例遠(yuǎn)大于西方國(guó)家，使得小麥中真菌毒素的危害性更加突出。

QuEChERS前處理技術(shù)涉及多項(xiàng)可變實(shí)驗(yàn)條件，且條件間存在很大程度的相互作用，使用傳統(tǒng)單因素優(yōu)化方法無法進(jìn)行有效優(yōu)化。本研究以小麥中嘔吐毒素回收率為指標(biāo)，基于響應(yīng)面法對(duì)QuEChERS前處理技術(shù)的相關(guān)參數(shù)建立擬合模型并進(jìn)行了優(yōu)化。通過方法驗(yàn)證，該方法可有效應(yīng)用于小麥中嘔吐毒素的提取凈化，供上機(jī)檢測(cè)，大幅度降低了前處理過程的經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本[1-4]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU LCMS-8045島津液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀；JK-500型超聲波清洗器，TGL-16M離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；G560E渦旋混勻器，上海佳能；十萬分之一、萬分之一電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；恒溫氮吹裝置。

小麥粉（市售）；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)自壇墨；甲醇、乙腈、乙酸為色譜純?cè)噭?，水為一?jí)水，其他試劑均為分析純；提取液：乙酸-乙腈溶液（1∶99）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

初始前處理方法基于QuEChERS技術(shù)[5]，前期已對(duì)其進(jìn)行修改。精密稱取5 g小麥粉置于50 mL離心管，按100 μg·kg-1嘔吐毒素含量加標(biāo)。加入提取液16 mL，超聲振蕩2 min至充分混勻。加入硫酸鎂6 g、醋酸鈉1.5 g，超聲振蕩1 min后10 000 r·min-1離心5 min。取上層清液6 mL轉(zhuǎn)移至15 mL凈化管（含有50 mg PSA、150 mg C18和900 mg MgSO4）中，渦旋2 min，以5 000 r·min-1的速度離心5 min，將全部上清液轉(zhuǎn)移到另一試管，50 ℃氮?dú)獯蹈?，用乙?0.1%甲酸溶液（5∶95）定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm膜過濾后，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。

1.2.2 色譜和質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。Shim-pack GISS-HP C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）色譜柱；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A），乙腈（B）。梯度洗脫：0～1.0 min，5% B；1.0～3.0 min，50% B；3.0～7.0 min，100% B；7.1～10 min，5% B。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧（ESI+）離子源；霧化氣（N2）流量：3.0 L·min-1；干燥氣（N2）流量：10.0 L·min-1；加熱氣（Air）流量：10.0 L·min-1；DL管溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。母離子為m/z297.0，檢測(cè)離子對(duì)為m/z249.0、m/z231.0，其中m/z249.0為定量離子，錐孔電壓20 V，碰撞能量10 eV、10 eV。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

使用Design-Expert 12軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

現(xiàn)配1 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)液，然后逐級(jí)稀釋成需要的質(zhì)量濃度，采用高效液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定，以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.5 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)及優(yōu)化

以小麥中最主要真菌毒素污染物DON為主要分析對(duì)象，采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分（加標(biāo)量100 μg·kg-1）的方法，以DON回收率為指標(biāo)，以前處理凈化階段的乙酸體積分?jǐn)?shù)、硫酸鎂質(zhì)量和醋酸鈉質(zhì)量為3個(gè)自變量，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面擬合優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

建立DON線性回歸方程為Y=454.22X+213.95，r=0.999 4，線性范圍為50～2 000 μg·L-1，檢出限為10 μg·kg-1，定量限為20 μg·kg-1。使用相對(duì)響應(yīng)值法計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，方法平均基質(zhì)效應(yīng)為92%，在可接受范圍內(nèi)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化和分析

Box-Behnken響應(yīng)面模型方差分析見表1。使用二次多項(xiàng)式回歸，擬合得到DON回收率Y對(duì)3個(gè)因素A乙酸體積分?jǐn)?shù)（%）、B硫酸鎂（g）、C醋酸鈉（g）的二次多項(xiàng)式方程為

該模型F=46.58，P＜0.000 1，表明該模型方程極顯著，失擬項(xiàng)F=0.110 9，P=0.949 2＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著。二次項(xiàng)中A2、B2、C2、AB影響極顯著（P＜0.01），BC影響顯著（P＜0.05），表明各因素對(duì)回收率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。修正后R2=0.962 5，說明該模型能反映96.25%響應(yīng)值的變化。

為考察各因素對(duì)萃取液吸光度的影響，將一個(gè)因素設(shè)為中心值，描繪對(duì)應(yīng)兩因素的三維響應(yīng)面圖，可知DON回收率在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)存在最大值。通過軟件分析得到Y(jié)取最大值時(shí)A=-0.792，B=0.310，C=-0.173，此時(shí)乙酸體積分?jǐn)?shù)（A）為1.04%，硫酸鎂質(zhì)量（B）為6.55 g，醋酸鈉質(zhì)量（C）為1.654 g，回收率（Y）預(yù)測(cè)值為92.974%?？紤]到實(shí)際可操作性，將其修正為乙酸體積分?jǐn)?shù)（A）為1%，硫酸鎂質(zhì)量（B）為6.6 g，醋酸鈉質(zhì)量（C）為1.7 g，此時(shí)回收率（Y）預(yù)測(cè)值為92.966%。以該方法進(jìn)行前處理，按照1.2方法測(cè)定目標(biāo)物DON回收率，并與優(yōu)化前方法驗(yàn)證結(jié)果比較，優(yōu)化后DON平均回收率從84.5%增加到了94.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為7.20%。選定最終QuEChERS前處理?xiàng)l件為乙酸體積分?jǐn)?shù)1%，硫酸鎂質(zhì)量6.6 g，醋酸鈉質(zhì)量1.7 g。

2.3 方法應(yīng)用和驗(yàn)證

使用建立的QuEChERS前處理-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法方法，對(duì)照GB 5009.111—2016同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)市售10種樣品進(jìn)行對(duì)比測(cè)試，結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)分析（不計(jì)未檢出）表明P=0.373，差異不顯著，說明本方法與國(guó)標(biāo)方法沒有顯著差異。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面模型方差分析表

表2 建立方法與國(guó)標(biāo)方法對(duì)比表

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面優(yōu)化，最終建立了基于QuEChERS前處理技術(shù)的小麥中嘔吐毒素前處理凈化方法。該方法相比于傳統(tǒng)方法處理簡(jiǎn)單、速度快、成本低廉。與國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行對(duì)比，不存在顯著性差異，可以滿足小麥中嘔吐毒素的定性和定量檢測(cè)要求。