青天葵提取液清除螺螄粉中亞硝酸鹽的研究

◎ 謝云峰，陳 瑤，陳麗燕，謝集照，邱卓妍，張 偉，鄭艷燕

（1.廣西醫(yī)科大學 藥學院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，廣西 南寧 530021）

亞硝酸鹽是一類無機化合物的總稱，其具有良好的防腐、呈色保鮮作用。亞硝酸鹽也是國家食品衛(wèi)生標準中嚴格控制使用量的食品添加劑，常用于臘味、腌菜、涼菜等食品中[1]。但是過量攝入亞硝酸鹽會引起機體血液中血紅蛋白與氧結(jié)合能力降低，導(dǎo)致組織缺氧，同時還會使血管擴張，血壓降低[2]，此外，機體胃腸道在消化肉制品的過程中會產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，其含氮產(chǎn)物與亞硝酸鹽發(fā)生作用轉(zhuǎn)化成的亞硝胺可能致癌[3]。如果人體過量或長期攝入亞硝酸鹽對健康極為不利。螺螄粉是起源于廣西柳州的特色小吃，深受廣大消費者的喜愛。螺螄粉湯汁濃郁、酸辣可口，配菜豐富，包括酸筍、酸豆角、蘿卜干、腐竹、油豆腐、黑木耳以及油炸花生等。但是，由于其配菜中有腌制酸菜食品，存在亞硝酸鹽含量超標[4]的潛在隱患。

青天葵[Nervilia fordii(Hance) Schltr.]為蘭科芋蘭屬植物，盛產(chǎn)于廣東、廣西，不僅具有清熱解毒、清肺止咳的效用，還具有明顯的抑菌作用[5]。青天葵的主要有效成分為黃酮類，此外還存在甾醇類、生物堿類和氨基酸類等[6]。黃酮類物質(zhì)可防治心血管疾病，具有抗腫瘤、抗炎癥、抗衰老氧化[7]的作用。據(jù)報道，含有黃酮的水果蔬菜能降低或清除亞硝酸鹽[8]。黃酮類物質(zhì)能有效阻斷亞硝胺的合成，且亞硝酸鹽清除活性與黃酮種類及含量存在相關(guān)性[9]。目前，能代替亞硝酸鹽的天然無公害類食品添加劑較少，基于此，本文通過檢測螺螄粉中亞硝酸鹽的含量，探討青天葵提取液對螺螄粉及腌制品中亞硝酸鹽的清除作用，以期開發(fā)青天葵中有效成分的新用途，進一步保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青天葵，廣西一心醫(yī)藥有限公司，由廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所韋家福主任中藥師鑒定為青天葵[Nevilia fordii(Hance) Schltr.]的全草，藥材標本保存于廣西醫(yī)科大學藥物化學實驗室。螺螄粉樣本，采用隨機抽樣法，采樣于南寧市內(nèi)的青秀區(qū)、西鄉(xiāng)塘區(qū)、邕寧區(qū)、江南區(qū)和興寧區(qū)5個城區(qū)的螺螄粉店，每個城區(qū)采5～6份樣，共采集31份樣品；柴火煙熏臘肉、珍珠臘腸，購于南寧市青秀區(qū)超市。

60%乙酸、氯化銨緩沖液、95%乙醇、5 μg·mL-1亞硝酸鈉標準溶液、0.4%對氨基苯磺酸溶液、0.2%鹽酸萘乙二胺、6 mol·L-1鹽酸溶液、硫酸鋅溶液、0.5 mol·L-1氫氧化鈉溶液、蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號100080-200306）、甲醇、石油醚（60～90 ℃）、AlCl3、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3NaAc、冰醋酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ1000型電子天平（d=0.01 g、Max=1 000 g、e=10 d），常熟市雙杰測試儀器廠；臺式離心機，上海棱光技術(shù)有限公司；722sp型可見分光光度計，上海棱光儀器公司；美的多功能電磁爐；2608DM型多用電熱套，山東省鄄城永興儀器廠；DZF-300真空干燥箱，武漢亨泰達儀器設(shè)備有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 青天葵提取液的制備

按物料比1∶15稱取青天葵，用15倍量的95%乙醇在85 ℃水浴回流提取2次，每次提取1 h，過濾，脫色，合并濾液。濾液減壓回收溶劑至無醇味，濃縮得膏狀物，臨用時用蒸餾水配制成所需濃度。

1.3.2 螺螄粉樣品處理

用攪拌機將整碗螺螄粉、米粉、配菜樣品分別攪拌打碎，分別取10 g已粉碎的整碗螺螄粉、米粉、配菜樣品于燒杯中（湯汁樣品取10 mL），加70 mL水和12 mL氫氧化鈉溶液（20 g·L-1），混勻，過濾，用氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）調(diào)樣品pH至8，定量轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，加10 mL硫酸鋅溶液，混勻。如不產(chǎn)生白色沉淀，可再補加2～5 mL氫氧化鈉溶液，攪拌混勻。置于60 ℃水浴中加熱10 min，取出后冷至室溫，加水至刻度，混勻。放置0.5 h，用濾紙過濾，棄去初濾液20 mL，收集濾液備用。

1.3.3 亞硝酸鈉標準曲線的繪制方法

準確吸取0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.0 mL亞硝酸鈉標準使用液（相當于0.0 μg、2.5 μg、5.0 μg、10.0 μg、15.0 μg、20.0 μg和25.0 μg的亞硝酸鈉），置于25 mL容量瓶中，加入氯化銨緩沖溶液4.5 mL，60%乙酸2.5 mL，2 g·L-1鹽酸奈乙二胺顯色劑5 mL，混合搖勻，定容，避光靜置25 min，于波長540 nm處測定吸光度。直線回歸方程為y=0.009 9x+0.000 7，R2=0.997 7，在2.5～25.0 μg·mL-1范 圍 內(nèi)NaNO2的吸光度與其含量呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

1.3.4 蘆丁標準曲線繪制

采用AlCl3-HAc-NaAc顯色法[10]，配制系列質(zhì)量濃度蘆丁對照品溶液（c=0.15 g·L-1）。精密量取適量標準溶液，置于25 mL容量瓶中，加入0.1 mol·L-1AlCl3溶液1.5 mL，HAc-NaAc緩沖溶液（pH 5.5）1 mL，加70%乙醇稀釋定容，搖勻。以相應(yīng)試劑為空白，在405 nm波長處測定其吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度（c）為橫坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為A=0.025 17c+0.005（r=0.998 2），蘆丁在7.35～29.60 mg·L-1呈線性關(guān)系。

1.3.5 對照品溶液的制備

稱取蘆丁對照品30.0 mg，用甲醇溶解后定容至20 mL容量瓶中，制得1.50 mg·mL-1對照品蘆丁貯備液。準確吸取對照品貯備液5 mL，加甲醇稀釋定容至50 mL，制備質(zhì)量濃度為0.15 g·L-1的對照品溶液。

1.3.6 供試品溶液的制備

取經(jīng)60 ℃干燥4 h后的青天葵，粉碎，過篩，精密稱取1 g，加入石油醚（60～90 ℃）50 mL，600 W超聲30 min，過濾，重復(fù)2次，揮干，加入70%乙醇100 mL，稱重，超聲30 min，靜置，過濾，得10 mg·mL-1樣品溶液。

1.3.7 青天葵藥材總黃酮含量測定

精密稱取青天葵1 g，按1.3.6的方法制備供試液，按1.3.4項操作測定吸光度，平行測量3次，計算樣品總黃酮含量為2.13%。

1.3.8 亞硝酸鹽清除率的測定

亞硝酸鹽含量檢測按國標GB 5009.33—2016鹽酸萘乙二胺法測定[11]。精密量取1 mL亞硝酸鹽應(yīng)用液，分別置于25 mL比色管中，一支用作空白對照，另一支加入一定量青天葵提取液，搖勻，反應(yīng)一定時間。兩份各加入1 mL的0.4%對氨基苯磺酸溶液，搖勻靜置4 min之后，再加入0.5 mL的0.2%鹽酸萘乙二胺，加入氯化銨緩沖液1 mL，加水定容至刻度線處；靜置15 min之后，用1 cm比色皿，空白管調(diào)零，測定波長在540 nm處的測吸光度，分別標記A1（添加青天葵提取液的吸光度）、A2（未添加青天葵提取液的吸光度）。

按照公式（1）計算青天葵提取液對亞硝酸鹽的清除率[12]。

1.3.9 對肉制品中亞硝酸鹽清除率的測定

取3份1 mL的肉制品的上清液在溫度為90 ℃的條件下水浴3 min，一份用作空白管；另兩份加入4 mL的青天葵提取液，調(diào)節(jié)pH為9，反應(yīng)15 min，按照體外測定亞硝酸鹽含量的方法，測定其清除率。

1.3.10 對螺螄粉中亞硝酸鹽清除率的測定

分別平行取3份按1.3.2方法處理的螺螄粉湯汁、粉、配菜及整碗螺螄粉樣品的上清液各1 mL在溫度為90 ℃的條件下水浴3 min，1份做樣品對照管；另2份分別加入4 mL的青天葵提取液，并且調(diào)節(jié)pH為9，反應(yīng)15 min后測定清除率。

1.4 青天葵提取液清除亞硝酸鹽的反應(yīng)條件的優(yōu)化試驗

1.4.1 單因素試驗

本試驗設(shè)青天葵提取液與亞硝酸鹽反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH以及青天葵提取液用量3個單因素試驗，并采用正交試驗確定青天葵提取液清除亞硝酸鹽的最佳反應(yīng)條件。

1.4.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH、青天葵用量3個因素，選擇不同水平進行L9(34)正交試驗，因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 影響青天葵提取液清除亞硝酸鹽的主要因素

2.1.1 反應(yīng)溫度對亞硝酸鹽清除率的影響

取5份5 mL青天葵提取液，將pH調(diào)至8，于70 ℃水浴保溫3 min后各加入1 mL標準亞硝酸鹽溶液。分別于50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃水浴保溫，15 min后測定清除率。試驗重復(fù)3次，結(jié)果如圖1所示，反應(yīng)溫度介于50～80 ℃時，溫度越高，青天葵對亞硝酸鹽的清除率越高，當反應(yīng)溫度為80 ℃時清除率為25.89%。溫度高于80 ℃青天葵對亞硝酸鹽的清除率反而降低。其原因可能與溫度升高青天葵提取液中活性成分如多酚類黃酮類化合物分解有關(guān)[12]。

圖1 反應(yīng)溫度對亞硝酸鹽的清除率的影響圖

2.1.2 反應(yīng)pH對亞硝酸鹽清除率的影響

取5份5 mL青天葵提取液，于70 ℃水浴保溫3 min，各加入1 mL標準亞硝酸鈉溶液并將pH分別調(diào)至5、6、7、8和9，15 min后測定清除率。試驗重復(fù)3次，結(jié)果如圖2所示，pH在5～8，反應(yīng)的pH越高，青天葵對亞硝酸鹽的清除率越高，當反應(yīng)pH為8時清除率最大，為34.31%。

圖2 反應(yīng)pH對亞硝酸鹽的清除率的影響圖

2.1.3 青天葵提取液用量對亞硝酸鹽清除率的影響

取5份1 mL標準亞硝酸鹽溶液，于70 ℃水浴保溫3 min后各加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL的青天葵提取液，并將pH調(diào)至8，15 min后測定清除率。試驗重復(fù)3次，結(jié)果如圖3所示，青天葵對亞硝酸鹽的清除率在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，青天葵提取液用量為3 mL時清除率最大為37.62%。

2.2 青天葵對亞硝酸鹽清除率的正交試驗結(jié)果

青天葵對亞硝酸鹽的清除率的最佳反應(yīng)條件的正交試驗結(jié)果及方差分析見表2和表3。由正交試驗結(jié)果可知，試驗結(jié)果的影響因素大小為反應(yīng)溫度＞反應(yīng)pH＞青天葵提取液用量。結(jié)合正交試驗K值分析與方差分析結(jié)果，其最優(yōu)反應(yīng)條件為A2B2C1，而根據(jù)清除率得出的最佳反應(yīng)條件為A3B3C3。即反應(yīng)液溫度90 ℃、反應(yīng)液pH為9、青天葵提取液用量5 mL。將兩組反應(yīng)條件A2B2C1與A3B3C3進行對照實驗，測定清除率，其結(jié)果如表4。由表4可知，最佳反應(yīng)條件為A2B2C1，即反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)pH為8，青天葵提取用量為3 mL。

圖3 青天葵提取液用量對亞硝酸鹽的清除率的影響圖

表2 正交試驗結(jié)果表

表3 方差分析表

表4 兩種最佳反應(yīng)條件的清除率比較表

2.3 青天葵在最佳條件清除亞硝酸鹽的試驗結(jié)果

如表5所示，在最佳反應(yīng)條件下，青天葵提取液對整碗粉及腌制品臘腸和臘肉的亞硝酸鹽的清除率分別為39.27%及30.31%和35.25%，提示青天葵提取液對螺螄粉及腌制品臘腸和臘肉的亞硝酸鹽清除效果較好。

表5 最優(yōu)條件下青天葵提取液清除亞硝酸鹽的效果表

3 結(jié)論

廣西壯族自治區(qū)地方標準《食品安全地方標準 柳州螺螄粉》（DBS 45/034—2016）[13]規(guī)定其螺螄粉亞硝酸鹽的含量＜20 mg·kg-1，但研究顯示，過多地食用螺螄粉存在亞硝酸鹽超標的隱患。本研究結(jié)果表明青天葵提取液對螺螄粉中亞硝酸鹽具有一定的清除作用，其原因可能與青天葵中含有的黃酮類有關(guān)。目前，由于尚未發(fā)現(xiàn)清除亞硝酸鹽的專屬性酶類化合物，從豐富的中藥資源中探索開發(fā)外源性的亞硝酸鹽清除劑非常有必要[14]。本研究所選用的青天葵提取液的制備方法簡單，可應(yīng)用于食品加工過程中，從而有效降低人們在日常飲食中對亞硝酸鹽的攝入量。