訶子對川楝子所致肝毒性的減毒作用機制初探

烏日漢，陳玉花，肖田梅，畢力格，麗麗，孟香花，寶樂爾，韓曉靜，白梅榮?

（1. 內(nèi)蒙古民族大學，蒙醫(yī)藥研發(fā)工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2. 蒙醫(yī)藥研發(fā)工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

訶子在蒙藥藥性理論指導下具有“浩日音·達日拉嘎”（鎮(zhèn)毒之王）之美名，也有調(diào)元之功效。兩千多年來，在臨床實踐中逐漸形成的含有毒藥味的常用蒙藥復方中，98%以上均有訶子參與。研究證實，訶子能對抗長期用藥導致的毒性反應，并對氧化應激所致的肝毒性損傷具有一定的減毒作用［1-2］。訶子與含劇毒的藥物泵阿配伍使用，能起到減毒存效作用［3］。那么訶子在復方組成中是否起到減毒作用呢？以符合《中華人民共和國藥典》和地方標準的代表性蒙藥三子湯為例，三子湯由訶子25 g、川楝子15 g、梔子30 g 組成，具有清血熱、解毒、分離“惡血”和“正血”的功能［4］。主治新舊血熱癥、希拉熱、“惡血”與“正血”混合等，同時還具有緩解膠原誘導性關(guān)節(jié)炎（CIA）關(guān)節(jié)炎癥、促進免疫功能、抗菌、抗凝血的作用［5］，是蒙醫(yī)臨床療效顯著的地域性知名復方制劑。研究表明，三子湯中的川楝子具有肝臟毒性，然而訶子在此方中的應用是否起到配伍減毒作用，目前尚未見相關(guān)現(xiàn)代毒理學研究報道?；诖耍狙芯繀⒄彰舍t(yī)臨床用藥原則，采用亞急性毒性試驗方法，以訶子和川楝子為研究核心，根據(jù)三子湯藥物組成，將其拆分為川楝子組、訶子組、梔子組、川楝子加訶子組、川楝子加梔子組及訶子加梔子組，通過對SD 大鼠給予相應的藥物溶液連續(xù)灌胃21 d，觀察大鼠血清生化指標和病理組織學的改變情況，同時基于UPLC-MS 技術(shù)重點考察并比較訶子和川楝子共有代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，探討訶子是否具有配伍減毒作用，進而評價三子湯安全性及復方組成的科學性和合理性。

1 實驗材料

1.1 動物

SD 雄性大鼠64 只，SPF 級，體質(zhì)量為（200±20）g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供［SCXK（遼）2015-0001］。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±1）℃，12 h 光照，大鼠自由飲水、進食。

1.2 藥品與試劑

所有中藥由內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總蛋白（TP）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHO）試劑盒［羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司］；純化水（屈臣氏集團有限公司）；質(zhì)譜乙腈（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；甲酸（Sigma-Aldrich公司）。

1.3 儀器設(shè)備

質(zhì)譜儀MASS（TripleTOF5600+，AB SCIEX?）；臺式高速冷凍離心機（Mikro 220R，Hettich）；羅氏全自動生化分析儀（cobas c 311）；移液器（Eppendorf N13462C，德國Eppendorf 公司）；粉碎研磨儀（TL-48R，上海萬柏生物科技有限公司）；漩渦振蕩器（QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；色譜UHPLC（Nexera UHPLC LC-30A，島津SHIMADZU）。

2 實驗方法

2.1 給藥劑量選擇

為了評價訶子對三子湯是否有配伍減毒作用，篩選大鼠對三子湯散最大耐受量即臨床等效量3 倍（3.857 1 g/kg）進行了實驗研究，但通過預實驗發(fā)現(xiàn)，臨床等效量3 倍時，拆方后的川楝子組大鼠在染毒1 周內(nèi)死亡60%以上，無法繼續(xù)染毒，而臨床等效量2 倍（2.571 4 g/kg）時川楝子既有肝毒性且無動物死亡；三子湯及其他各給藥組在最大耐受量時均無大鼠死亡。因此，為了便于分析三子湯肝毒性機制是否與川楝子肝毒性一致，并分析訶子是否有配伍減毒作用，在實驗中川楝子組采用了臨床等效量2 倍劑量，其他給藥組均采用了臨床等效量3 倍劑量。

2.2 動物分組及取材

取SD 大鼠64 只，隨機分為正常組、三子湯組、川楝子組、梔子組、訶子組、川楝子加訶子組、川楝子加梔子組和訶子加梔子組，每組8 只。從實驗第1 天開始，各給藥組均給予相應藥物溶液灌胃，每日1 次，連續(xù)灌胃21 d，正常組灌胃等容量生理鹽水。末次給藥后，麻醉各組動物，取血，3 500 r/min 離心10 min 分離血清，部分血清用于檢測AST、ALT、TG、CHO 和TP含量，部分血清置于-80 ℃用于檢測代謝組學指標。采集肝組織固定于10%甲醛中，對肝組織進行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片和HE 染色，以檢查肝組織病理組織學變化。

2.3 代謝物提取

血清樣本于4 ℃解凍后，取100 μL 加入300 μL 甲醇，震蕩提取于12 000 rpm，4 ℃下離心10 min，取上清液進樣10 μL，用UPLC-MS檢測。

2.4 UPLC-MS檢測

本研究采用Waters BEH HILIC 色譜柱（100 mm× 2.1 mm，1.7 μm）。流動相A（0.1%甲酸水，乙酸銨）和B（乙腈），柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量10 μL。洗脫梯度：95%～50%B，0～16 min；50%B，16～20 min；50%～95%B，20～21 min；95%B，21～22.5 min。

質(zhì)譜參數(shù)條件：分別采用電噴霧電離（ESI）正離子和負離子模式進行檢測。ESI 源條件如下：離子源Gas1∶50，離子源Gas 2∶50；氣簾氣壓力（CUR）∶25；界面加熱溫度：500 ℃（正離子）和450 ℃（負離子），離子噴霧電壓浮動（ISVF）5 500 V（正離子）和4 400 V（負離子）；TOF 質(zhì)量掃描范圍：100～1 200 Da，產(chǎn)物離子掃描范圍：50～1 000 Da，TOF MS 掃描累積時間0.2 s，產(chǎn)物離子掃描累積時間0.01 s；二級質(zhì)譜采用information dependent acquisition（IDA）獲得，并采用high sensitivity 模式，去簇電壓（DP）為± 60 V；碰撞能量為（35±15）eV。

2.5 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學分析。采用t檢驗、秩和檢驗、單因素方差分析分別進行組間比較。以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

利用Analysis Base File Converter 軟件將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ABF 格式，再導入MS-DIAL 4.10 軟件進行預處理。使用Mass Bank，Respect，GNPS 數(shù)據(jù)庫進行比對。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析法（OPLS-DA）分析各組樣本。篩選VIP ≥1 及FC ＞1.5（或＜0.5）和P＜0.05 作為差異代謝物。再使用Metabo Analyst 4.0 分析代謝通路。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝功能生化指標檢測比較

與正常組比較，川楝子組大鼠血清ALT、AST 水平顯著升高（P＜0.05），CHO、TP 水平顯著降低（P＜0.05）；川楝子加梔子組TG 顯著升高（P＜0.05）；訶子加梔子組、梔子組的ALT、AST顯著下降（P＜0.05）；訶子組AST、TG 顯著下降（P＜0.05）；三子湯組和川楝子加訶子組的AST、ALT、TG、CHO 和TP 水平均無顯著變化（P＜0.05）。結(jié)果提示川楝子組大鼠出現(xiàn)了明顯的肝損傷，其他組大鼠未見明顯肝損傷。見表1。

表1 各給藥組大鼠肝功能生化指標比較（±s，n=8）

表1 各給藥組大鼠肝功能生化指標比較（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別正常組川楝子組三子湯組川楝子加訶子組川楝子加梔子組訶子加梔子組梔子組訶子組TP（g/L）61.25±7.31 49.07±8.12**57.36±5.50 59.80±1.66 58.37±2.97 64.41±4.28 60.20±1.49 64.46±2.89 ALT（U/L）37.43±7.90 60.46±16.57**34.02±5.87 39.80±8.03 42.48±13.75 28.50±2.92**29.87±4.69*35.02±2.59 AST（U/L）109.90±13.22 149.58±48.42*105.33±25.45 110.06±14.02 120.71±24.57 69.78±12.15**79.01±10.54**92.81±12.67**TG（U/L）0.43±0.17 0.39±0.24 0.36±0.12*0.30±0.10 0.66±0.19*0.35±0.08 0.44±0.13 0.28±0.09*CHO（mmoL/L）1.64±0.30 1.25±0.27*1.52±0.27 1.38±0.30 1.42±0.23 1.80±0.30 1.79±0.19 1.75±0.17

3.2 各組大鼠肝組織病理學檢測結(jié)果比較

肝組織病理檢測結(jié)果顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，中央為中央靜脈，肝細胞索和肝血竇大致呈放射狀排列，肝細胞圓潤、飽滿，肝板排列規(guī)則、整齊。川楝子組大鼠可見少量肝細胞腫脹；川楝子加訶子組、訶子組和訶子加梔子組肝細胞胞質(zhì)疏松淡染；川楝子加梔子組胞質(zhì)疏松淡染，可見大小不一的水泡；梔子組胞質(zhì)疏松，可見大小不一的水泡；三子湯和訶子組肝組織未見明顯異常。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理切片圖（HE，×200）

3.3 各組大鼠血清代謝物PCA結(jié)果比較

PCA 通過主要新變量對各組數(shù)據(jù)進行歸類，去除重復性差和異常樣本，可觀察樣品的聚集、離散程度。如圖2 所示，正常組（8）與三子湯組（2）、川楝子加訶子組（4）有小部分重合，說明代謝物差異小。正常組與川楝子組（1）呈明顯分離，說明代謝物有顯著差異。正常組與川楝子加梔子組（3）、訶子加梔子組（5）、梔子組（6）呈明顯分離，說明血清代謝物具有一定的差異性。正常組與訶子組（7）樣品分布點靠近，表明訶子有回調(diào)潛在差異代謝物的趨勢。

圖2 各組大鼠血清代謝物PCA圖

3.4 各組大鼠血清代謝物OPLS－DA結(jié)果比較

OPLS-DA 作為一種有監(jiān)督的分析方法，能夠篩選出差異代謝物。如圖3 所示，正常組（8）與川楝子組（1）、三子湯組（2）、川楝子加梔子組（3）、川楝子加訶子組（4）、訶子加梔子組（5）、梔子組（6）的大鼠血清代謝物呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，說明代謝物譜存在顯著差異，與訶子組（7）差異小。隨后通過參數(shù)檢驗進行OPLS-DA 模型驗證，模型具有良好的準確率和預測率（參數(shù)R2Y 和Q2均＞0.5）。

圖3 各組大鼠血清OPLS?DA得分圖（S?plot圖）

3.5 差異代謝物的篩選

為篩選潛在差異代謝物，采用OPLS-DA 中VIP ≥1，且fold change ＞1.5（或＜0.5）和P＜0.05 的標準篩選，通過MassBank，Respect，GNPS 數(shù)據(jù)庫進行檢索分析，血清樣本中共鑒定出12 個差異代謝物，其中包括代謝物種類、VIP 值、對應的分子式、保留時間及相對分子質(zhì)量等信息。與正常組比較，川楝子組吡咯-2-羧酸、纈氨酸、膽紅素、LPC 18∶2、LPC 16∶0、LPC 18∶1 顯著升高，肉堿、sn-甘油-3-磷酸膽堿、胸腺嘧啶-β-D-葡萄糖苷、［5-乙酰氧基-3-（羥甲基）-2-氧基-6-丙烷-2-基環(huán)己-3-烯-1-烯基］3-甲基戊酸酯顯著下降；三子湯組LPC16∶0、LPC 18∶2、LPC 18∶1 明顯升高；川楝子加訶子組和川楝子加梔子組LPC 18∶2、LPC 18∶1、賴氨酸明顯升高；訶子加梔子組LPC 18∶2、LPC 16∶0、谷氨酰胺（D）、葡萄糖、?；酋Ｃ撗跄懰帷⒛蜞奏ず塑?、反式?；撬?、糊精酸、二十二碳六烯酸、L-α-磷脂酰乙醇胺（大豆）升高；梔子組LPC 18∶2、LPC 16∶0、谷氨酰胺（D）、葡萄糖、?；酋Ｃ撗跄懰?、尿嘧啶核苷、反式?；撬帷⒑?、二十二碳六烯酸、肌苷升高，sn-甘油-3-磷酸膽堿下降；訶子組LPC 18∶2、谷氨酰胺（D）升高。 見表2、表3。

表2 基于UHPLC?MS 的血清差異代謝物鑒定

表3 血清差異代謝物的篩選

3.6 差異代謝物通路分析

將篩選出的差異代謝物導入MBRole 2.0 進行通路富集分析。結(jié)果顯示，這些血清代謝物主要與ABC轉(zhuǎn)運蛋白、氨基酸的生物合成、蛋白質(zhì)消化吸收、嘧啶代謝、癌癥的中心碳代謝、精氨酸生物合成、氨酰-tRNA 合成代謝、嘌呤代謝、FoxO 信號通路，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等10 條代謝通路密切相關(guān)。其中，與代謝物相關(guān)性最強的是ABC 轉(zhuǎn)運蛋白，其次為氨基酸的生物合成代謝通路。見圖4。

圖4 血清樣品代謝通路氣泡圖

4 討論

4.1 訶子在血清生化和病理組織學層面緩解川楝子肝毒性作用評價

血清ALT、AST 可以敏感地反映肝細胞的完整程度。生化指標顯示，與正常組比較，川楝子組大鼠血清ALT、AST水平明顯升高，提示川楝子導致大鼠出現(xiàn)了肝臟損傷和功能障礙。而訶子加梔子組、梔子組的ALT、AST 水平顯著下降（P＜0.05），訶子組AST 水平下降（P＜0.05），三子湯組、川楝子加訶子組的血清ALT、AST水平則無明顯變化。病理組織學結(jié)果顯示，川楝子組大鼠肝細胞腫脹，而三子湯組和訶子組肝細胞未見異常，其余各組肝細胞也僅可見胞質(zhì)疏松淡染，這提示除川楝子組外，其余各組大鼠均未見明顯肝損傷。以上實驗結(jié)果說明，訶子與川楝子配伍能夠降低川楝子的肝毒性，即推測訶子對三子湯復方有配伍減毒作用。

4.2 訶子在脂質(zhì)代謝層面緩解川楝子肝毒性作用評價

溶血磷脂酰膽堿（LPC）是磷脂的一種，與動脈粥樣硬化、血脂異常等代謝性疾病和心血管疾病密切相關(guān)。LPC 主要在肝臟代謝，在肝臟疾病和藥物引起的肝毒性血清中，LPC 16∶0、LPC 18∶0、LPC 18∶2、LPC 18∶3和LPC 18∶1等多種LPCs的濃度均明顯升高［6-10］。大量研究推測，LPC 將會成為肝臟疾病和肝毒性損傷的生物標志物，將在肝臟疾病和藥物肝毒性的診斷與治療中發(fā)揮重要作用。另外，較高水平的LPC 能夠反映機體血漿脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運能力。LPC 含量升高可抑制外周游離膽固醇的酯化，使之被載脂蛋白攜帶最終轉(zhuǎn)運回肝臟代謝等脂質(zhì)轉(zhuǎn)運過程受限，增加血漿膽固醇含量，使肝臟功能受損進而發(fā)生脂肪變性［11-14］。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，川楝子組血清LPC 16∶0、LPC 18∶1、LPC 18∶2 含量明顯升高；與川楝子組比較，三子湯組血清LPC 16∶0、LPC 18∶2、LPC 18∶1 含量，川楝子加訶子組和川楝子加梔子組血清LPC 18∶2、LPC 18∶1 含量，訶子加梔子組和梔子組血清LPC 18∶2、LPC 16∶0含量，以及訶子組血清LPC 18∶2含量均顯著降低?；诖?，推測LPC 就是川楝子產(chǎn)生肝毒性和訶子緩解川楝子肝毒性的共有生物標志物之一。

4.3 訶子在氧化層面緩解川楝子肝毒性作用評價

肝臟是機體進行氨基酸代謝的關(guān)鍵場所，當其發(fā)生損傷時會影響氨基酸的代謝，使肝細胞內(nèi)的氨基酸合成減少［15-16］。纈氨酸屬于支鏈氨基酸，是人體必需的氨基酸和生糖氨基酸。纈氨酸水平的升高能影響肝臟和血清中ALT、AST 含量及部分非特異免疫指標［17］。本研究結(jié)果顯示，川楝子組血清纈氨酸含量顯著升高，提示川楝子使體內(nèi)支鏈氨基酸含量上升，引起肝功能受損。吡咯-2-羧酸是羥脯氨酸代謝氧化主要產(chǎn)物，也是α-酮戊二酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用的產(chǎn)物［18］。吡咯-2-羧酸顯著升高會影響氧化應激反應，可用于癌癥的早期預測［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，川楝子干預后血清吡咯-2-羧酸水平顯著升高，可能通過加強氧化應激反應，進而影響氨基酸代謝來加重肝損傷。而訶子與川楝子配伍后，可回調(diào)纈氨酸和吡咯-2-羧酸含量。這一結(jié)果提示，川楝子肝毒性也與纈氨酸和吡咯-2-羧酸含量升高有關(guān)；訶子降低血清中纈氨酸和吡咯-2-羧酸含量可能是其緩解川楝子肝臟毒性的機制之一。

綜上所述，訶子降低血清LPC 含量可能是其緩解川楝子所引發(fā)的肝細胞腫脹及升高血清AST、ALT 含量的主要機制之一；訶子與川楝子配伍后能夠明顯降低川楝子的肝臟毒性，大大提高三子湯安全性，訶子在該方中具有配伍減毒作用?？梢?，傳統(tǒng)蒙藥方劑三子湯復方組成具有高度的合理性和科學性。