中醫(yī)藥調(diào)控MAPK信號通路治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進展

奧·烏力吉，高飛，包書茵，付強?

（1. 內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫性疾病，多見于中年女性，我國患病率約為0.32%～0.36%［1］。主要累及關(guān)節(jié)，以慢性滑膜炎癥為特征。病因可能與免疫細胞、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、遺傳等因素有關(guān)［2］。因其病機復(fù)雜，目前尚無特效治療方案，主要以減輕癥狀，延緩病情為主。常用藥物主要有非甾體抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs），如阿司匹林、沙利度胺、糖皮質(zhì)激素類藥（glucocorticoids，GCs）、甲氨蝶呤等改善病情抗風(fēng)濕藥（disease modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs），以及生物制劑。但往往伴隨肝腎不良反應(yīng)、過敏、物質(zhì)代謝紊亂等副作用［3］。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展，其整體調(diào)節(jié)、多靶點、低毒副作用的優(yōu)勢被逐漸認可，臨床中與西藥聯(lián)合應(yīng)用可減毒增效。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是RA 進展中重要的炎癥因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與MMP合成及促炎因子的產(chǎn)生等關(guān)系密切。本文從中藥提取物及有效部位、中藥復(fù)方、中醫(yī)物理治療方面詳細闡述中醫(yī)藥通過調(diào)控MAPK信號通路治療RA的研究進展。

1 MAPK信號通路概述

MAPK 是絲氨酸-蘇氨酸激酶家族，是信號從細胞膜到細胞核傳導(dǎo)的重要通路［4］。MAPK 有三個主要家族——細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK 1/2）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPKα、β、γ、和δ）、c-Jun 氨基末端激酶1/2/3（JNK 1/2/3）。MAPK的激活途徑為典型的三級酶促級聯(lián)反應(yīng)。在上游生長因子與特定受體結(jié)合后，通過MAPKKK-MAPKK-MAPK 的逐級磷酸化，調(diào)控其下游轉(zhuǎn)錄因子，進而對細胞的增殖、凋亡、遷移及分化等功能進行調(diào)節(jié)［5］。

1.1 ERK信號通路

表皮生長因子（EGF）通過受體（EGFR）（受體酪氨酸激酶）啟動細胞表面的信號后，GTP取代GDP與小G蛋白Ras結(jié)合，Ras被激活，并召集細胞質(zhì)內(nèi)Raf絲蘇氨酸蛋白激酶至細胞膜上，Raf激酶磷酸化激酶絲裂原蛋白激酶激酶1 和2（MEK1/2）上的兩個絲氨酸殘基，進而再通過磷酸化激活ERK1/2。ERK1/2 通過多種機制調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡等，因其能夠誘導(dǎo)細胞周期的正調(diào)節(jié)因子，所以對細胞增殖方面起著關(guān)鍵作用［6］。

1.2 p38MAPK信號通路

多種細胞外信號，如細胞應(yīng)激和促炎細胞因子，都可以激活p38MAPK 通路，其中MAPKKKs 磷酸化p38 MAPK特異性MAPKKs（MKK3、MKK4或MKK6），繼而磷酸化p38MAPK 的4種同工型（α、β、δ和γ）以及p38α和p38β 的3 個可變剪接變體。磷酸化底物繼而引發(fā)各種生物反應(yīng)，包括炎癥、細胞凋亡、增殖、細胞周期調(diào)節(jié)和分化等，特別是與炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)有關(guān)［7］。

1.3 JNK信號通路

JNK 可以受多種的細胞外刺激而激活，如腫瘤壞死因子（TNF）、表皮生長因子（EGF）、紫外線照射和缺血/再灌注損傷等［8］。其上游激酶目前確認的有MKK7和MKK4，通過雙磷酸化JNK 的Thr、Tvr 位點進行傳導(dǎo)，JNK 能夠磷酸化并激活許多核蛋白和非核蛋白，包括c-Myc、p53、細胞死亡調(diào)節(jié)因子線粒體中的Bcl-2家族等。這些蛋白質(zhì)控制著多種細胞反應(yīng)，如增殖、分化、凋亡［9］。

細胞內(nèi)每條MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有相對獨立的功能，并在受到不同的外界刺激后以級聯(lián)放大的方式傳導(dǎo)，但這3 條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并不是簡單的線性關(guān)系，上游分子及下游底物均存在“串話（crosstalk）”［10］。這使得3 條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間相互影響，進而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。

2 MAPK通路與RA

MAPK 信號通路在與RA 發(fā)病機制相關(guān)的細胞因子的轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮重要作用［11］。在受損關(guān)節(jié)組織中，MAPK 不僅調(diào)節(jié)促炎細胞因子的產(chǎn)生，而且在白介素（interleukin，IL）-1、IL-17 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 受體下游的信號級聯(lián)中發(fā)揮重要作用［9］?；りP(guān)節(jié)慢性炎癥是RA 的主要特征。成纖維細胞樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）中促炎細胞因子和MMP呈上調(diào)表達，能夠促進滑膜細胞肥厚、增生并引起炎癥細胞浸潤。ERK 信號傳導(dǎo)通路活化可促進T 細胞的增殖，使多種細胞因子的分泌水平顯著提升，并導(dǎo)致單核細胞和巨噬細胞聚集激活，進而使滑膜組織分泌TNF-α、IL-1、IL-6、MMP及黏附分子等，這些生物小分子促進RA-FLS過度增殖并抑制凋亡，形成惡性循環(huán)。同時，ERK 信號通路主要調(diào)節(jié)細胞增殖和分化，這兩個過程直接影響RA 的滑膜組織重塑［12］。軟骨細胞的功能正常是維持關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)穩(wěn)定的關(guān)鍵因素，軟骨破壞是RA 關(guān)節(jié)損傷的一個重要病理環(huán)節(jié)。WADA 等［13］研究表明，經(jīng)p38MAPK 抑制劑干預(yù)后，IL-1β 介導(dǎo)的人軟骨細胞MMP 和環(huán)氧化酶（epoxidase，COX）-2 表達顯著降低，膠原降解受到抑制，具有一定的軟骨保護作用。HASHIMOTO 等［14］研究證實p38MAPK 的活化與RA 軟骨細胞凋亡密切相關(guān)。IL-6 通過激活ERK 和JNK 信號傳導(dǎo)通路，從而引起MMP-1、MMP-3 和MMP-13表達上調(diào)，促使關(guān)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)降解［15］。在RA 骨破壞進程中，破骨細胞的過度活化是主要因素。ZWERINA 等［16］研究表明，p38MAPK 抑制劑能抑制體外培養(yǎng)的破骨細胞的增殖，并在體內(nèi)實驗中抑制骨破壞。LEE 等［17］研究也發(fā)現(xiàn)，ERK 活性突變體能夠延長破骨細胞存活時間。

此外，MAPK 信號通路還與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、核因子κB（nuclear factor，NFκB）等通路存在交叉聯(lián)系，協(xié)同影響基因轉(zhuǎn)錄。綜上，MAPK 在RA 關(guān)節(jié)的炎癥和組織破壞進程中起到關(guān)鍵作用，并與RA 病理狀態(tài)的進展密切相關(guān)。因此，可將調(diào)控MAPK 作為新的思路和途徑，探究中醫(yī)藥治療RA的作用機制。

3 中醫(yī)藥調(diào)控MAPK信號通路治療RA研究進展

中醫(yī)學(xué)認為RA 屬“痹癥”范疇，與中醫(yī)古籍中所記載的“歷節(jié)病”“頑痹”“鶴膝風(fēng)”等相似?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”，指出風(fēng)、寒、濕是引起痹證的主因，其基本病機為邪氣痹阻經(jīng)脈，不通則痛。中醫(yī)藥治療RA 依據(jù)辨證論治合理配伍藥物，用藥層次豐富、療效穩(wěn)定，可有效延緩疾病進展，在減輕癥狀方面有極大的優(yōu)勢。

3.1 中藥提取物及有效部位

RA 的病理基礎(chǔ)為滑膜炎，異常增生的RA-FLS能夠產(chǎn)生大量炎性細胞因子和趨化因子，從而導(dǎo)致RA的炎癥狀態(tài)，并對軟骨細胞進行侵蝕和破壞。因此，RA-FLS 成為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一種至關(guān)重要的靶細胞。

大黃素是中藥大黃中最主要的藥理活性成分之一，通過抑制炎癥細胞活化及炎癥介質(zhì)分泌從而發(fā)揮抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠降低TNF-α 誘導(dǎo)的RA-FLS 中ERK1/2、p38MAPK 蛋白及mRNA 的表達，進而減少炎癥因子釋放，有效延緩RA 病情進展［18］。黃連清熱燥濕、瀉火解毒，其主要成分黃連素能夠下調(diào)血清中的TNF-α 和IL-1 水平，具有較強的抗炎作用。蛋白質(zhì)印跡（Western bloting，WB）和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式擴增反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）實驗證實，調(diào)節(jié)溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）介導(dǎo)的RA-FLS經(jīng)黃連素干預(yù)后，顯著抑制RA-FLS中IL-6和TNF-α的過度增殖，同時下調(diào)K-ras、c-Raf 、P-p38MAPK 和PERK1/2的表達，以抗關(guān)節(jié)炎并抑制滑膜增生［19］。漢黃芩素為黃芩的主要活性單體成分，具有抗炎、抗腫瘤等藥理作用。王慧蓮等［20］發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素能夠誘導(dǎo)RAFLS 細胞凋亡，降低MMP 水平，可能與其調(diào)控ROS/p38MAPK 信號通路有關(guān)。苦參清熱燥濕，為臨床治療熱痹常用藥，提取物苦參堿被我國批準用作免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗炎等藥理作用。其衍生物MASM 可明顯抑制IL-1β 介導(dǎo)的RA-FLS 中炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-8）以及MMPs（MMP-1、MMP-3、MMP-13）的表達，抑制RA-FLS 細胞增殖并上調(diào)自噬與凋亡水平，其可能通過抑制ERK1/2、JNK 和p38MAPK 的磷酸化發(fā)揮作用［21］。穿心蓮內(nèi)酯被譽為天然抗生素藥物，有研究指出穿心蓮內(nèi)酯降低了TNF-α 誘導(dǎo)的RA-FLS 中p38MAPK 和ERK1/2 磷酸化，通過抑制MAPK 通路對自身免疫性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生保護作用［22］。益母草堿除了用于治療傳統(tǒng)婦產(chǎn)科疾病外，還具有降脂、降低血黏度、改善微循環(huán)等生物學(xué)功能。具有抗細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等生物活性。李楠［23］通過實驗證實，益母草堿是通過干預(yù)p38MAPK 介導(dǎo)的NF-κB 信號通路及JNK 信號通路，抑制RA-FLS 炎癥因子、MMPs 的表達及其遷移侵襲的功能。白藜蘆醇具有良好的抗風(fēng)濕作用，能夠多途徑調(diào)控RA 相關(guān)的免疫細胞及信號通路發(fā)揮抗炎、抗骨侵蝕作用。有研究證實白藜蘆醇阻斷了IL-1β 介導(dǎo)的RSC-364 細胞中JNK 和p38MAPK 的磷酸化，抑制滑膜組織的炎癥反應(yīng)和細胞增殖，并促進細胞凋亡［24］。土貝母苷甲具有較強的抗炎、抗腫瘤和抗病毒的活性，劉振州［25］發(fā)現(xiàn)其可能通過抑制p38MAPK 和JNK 的磷酸化水平，進而減少RA-FLS 的IL-1β、IL-6 和IL-8 的分泌，減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療RA 的作用。紫草的主要活性成分紫草素具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，能夠降低TNF-α 誘導(dǎo)的MH7A 細胞增殖、遷移、黏附和侵襲能力，其機制可能與下調(diào)P-p38MAPK，PERK，P-JNK 的蛋白表達水平，從而抑制MAPK 信號通路的活化相關(guān)［26］。

3.2 中藥復(fù)方

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠作為經(jīng)典的RA 模型，其臨床表現(xiàn)及病理學(xué)特質(zhì)與RA 高度類似，被廣泛運用于RA 的體內(nèi)實驗研究，大多數(shù)研究者通過對CIA 大鼠關(guān)節(jié)、滑膜的觀察評估及HE 染色等實驗方法，結(jié)合體外研究，以評估中藥復(fù)方的療效。根據(jù)RA 活動期的濕、熱、毒、瘀病機所擬的痹腫消湯臨床應(yīng)用多年，肖玉美［27］及徐則林［28］通過實驗證實其能夠顯著抑制CIA 大鼠p38MAPK、JNK、ERK1/2 及ERK5 的磷酸化水平，從而阻抑關(guān)節(jié)滑膜增殖和骨質(zhì)侵蝕。清代醫(yī)家程松齡的《醫(yī)學(xué)心悟》中記載的蠲痹湯，具有祛風(fēng)除濕、蠲痹止痛的療效，研究表明其可有效抑制TNF-α 誘導(dǎo)的MH7A 細胞炎癥因子及MMPs 基因和蛋白水平的表達，其發(fā)揮作用的機制可能和抑制p38MAPK、JNK 磷酸化相關(guān)［29］。以“補益肝腎、祛風(fēng)除濕、化瘀通絡(luò)”的基本治法擬定的斷藤益母湯，通過研究發(fā)現(xiàn)，RA-FLS 經(jīng)斷藤益母湯干預(yù)后，MEKK2 蛋白及mRNA 表達水平下降，炎癥因子MMP-1，TNF-α，IL-6表達水平顯著降低，可能是其緩解RA炎癥反應(yīng)的重要機制之一［30］。二妙散出自《丹溪心法》，是中醫(yī)治療RA的經(jīng)典方劑，王澤等［31］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)二妙散干預(yù)后，CIA 大鼠關(guān)節(jié)中NF-κB、p50、ERK1/2蛋白及mRNA 的表達水平低于模型組，在信號機制上論證了二妙散治療RA 的作用靶點。以二妙散為基礎(chǔ)方研制的風(fēng)濕祛痛膠囊，能明顯下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A 細胞、VEGF 誘導(dǎo)的HUVEC 細胞以及CIA 大鼠炎癥關(guān)節(jié)滑膜組織中p38MAPK、ERK 和JNK的磷酸化表達水平，從體內(nèi)和體外兩個方面證實其可能通過抑制MAPK信號通路發(fā)揮治療作用［32］。國醫(yī)大師周仲瑛根據(jù)RA“陰虛絡(luò)熱證”的病機特點，采用養(yǎng)陰清熱、宣痹通絡(luò)法治療，立清絡(luò)通痹方。清絡(luò)通痹顆粒通過WB 檢測證實能夠抑制RA 破骨細胞TRAF6、ERK1/2、p38MAPK、JNK 信號通路的活化［33］。民族醫(yī)藥對RA 的治療有著豐富經(jīng)驗，壯醫(yī)主張“毒虛致百病”，治療上重視祛毒，輔以補虛，由飛龍掌血、大鉆、八角楓、兩面針、青風(fēng)藤、九龍?zhí)?、五指毛桃和雞血藤等壯藥組成的龍鉆通痹顆粒，能通過下調(diào)RA 模型大鼠滑膜中MEK1/2、ERK1/2mRNA 及蛋白表達水平，以減輕滑膜病變，延緩軟骨和骨破壞［34］。從朱丹溪的痛風(fēng)方中精簡而來的新痹痛靈，能夠下調(diào)EAM 大鼠滑膜組織中TLR4、NF-κB/p-p65 及P-p38MAPK 的蛋白表達，提示新痹痛靈可能是通過抑制TLR4/MAPK/NFκB 通路的異常活化來發(fā)揮治療作用［35］。《傷寒論》中記載：“發(fā)汗，病不解，反惡寒者，虛故也，芍藥甘草附子湯主之”?，F(xiàn)代臨床實踐研究發(fā)現(xiàn)芍藥甘草附子湯對RA療效明確，石璐［36］通過實驗證實，芍甘附子湯可下調(diào)CIA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜ERK 和p38MAPK的磷酸化水平，證實其可能是通過抑制MAPK信號通路的異?；罨?，以發(fā)揮非特異性抗炎、鎮(zhèn)痛作用?！夺t(yī)林改錯》中記載身痛逐瘀湯可治療痹癥有瘀血者。HAN等［37］發(fā)現(xiàn)身痛逐瘀湯顯著抑制RA-FLS中P-p38MAPK和結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）蛋白及mRNA水平，促進過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）γ蛋白及mRNA表達，以干預(yù)p38/PPARγ/CTGF 信號通路，并能抑制RA-FLS 增殖，誘導(dǎo)G1/S 期細胞阻滯并增加細胞凋亡率，從而改善RA病情。

3.3 中醫(yī)物理治療

中醫(yī)物理治療通過對特定部位、穴位的刺激，直接針對病灶，在治療過程中具有靶向性高，起效快的獨特優(yōu)勢。藏藥浴療法是藏醫(yī)治療RA 的常用手段，五味甘露顆粒對寒濕痹阻型RA 療效顯著。研究發(fā)現(xiàn)，五味甘露藥浴散加減方在控制RA 的關(guān)節(jié)炎癥狀，緩解關(guān)節(jié)腫脹方面療效確切，其機制可能為通過降低p38MAPK，ERK1/2 的蛋白表達以及JNK1、p38MAPK、ERK1 的基因表達，從而減少炎性因子的釋放，抑制滑膜異常增殖，阻抑RA 關(guān)節(jié)骨質(zhì)侵蝕［38］。通過基因芯片檢測及生物信息分析技術(shù)證實，與模型組相比，艾灸雙側(cè)腎俞穴治療后的RA 家兔滑膜細胞MAPK 通路上大量信號分子表達下調(diào)，說明艾灸的抗炎效應(yīng)可能是對MAPK信號通路中相關(guān)信號分子表達的有效調(diào)控來實現(xiàn)的［39］。通過火針刺激L1～L5夾脊穴及阿是穴，可有效調(diào)節(jié)RA 模型大鼠滑膜組織JNK、p38MAPK 蛋白表達，降低MAPK 活性，從而參與抑制炎癥細胞因子的轉(zhuǎn)錄，這可能是火針治療RA起效的作用機制之一［40］。

4 展望

中醫(yī)藥以其多成分、多靶點、低毒性的特點在調(diào)控信號通路方面有著獨特的優(yōu)勢。中藥提取物及有效部位、中藥復(fù)方、中醫(yī)物理治療均可以有效治療RA。然而，國際上關(guān)于藥物機制的研究已深入到分子機制層面?？v觀相關(guān)中醫(yī)藥研究，大部分研究僅局限于臨床療效觀察，對其作用機制研究不夠深入。

目前關(guān)于MAPK 信號通路與RA 的實驗研究報道眾多，諸多研究發(fā)現(xiàn)，通過有效抑制MAPK 信號通路激活，可降低炎性因子的釋放，改善關(guān)節(jié)炎的嚴重程度、減少骨破壞。關(guān)于MAPK 抑制劑的研發(fā)已成為RA 領(lǐng)域的研究熱點。中醫(yī)藥的研究有望在多方面展開，進一步結(jié)合組學(xué)技術(shù)、表觀遺傳等新技術(shù)、新方法，將臨床實踐與基礎(chǔ)研究有效銜接，通過人或動物的體內(nèi)實驗以及體外細胞實驗，層層推進臨床優(yōu)勢復(fù)方-單味中藥-中藥有效成分對RA 的作用機制，以期更好地解析中醫(yī)藥治療RA的科學(xué)內(nèi)涵。