二陳湯對肥胖型多囊卵巢綜合征和肥胖型不孕的“異病同治”研究

蔡孟成，金永生，俞超芹，程 雯，俞 瑾，周 玲（海軍軍醫(yī)大學(xué)：.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,.藥學(xué)系,.中醫(yī)系,上海 200433）

“異病同治”是指不同的疾病，病機(jī)相同，采用相同的方法進(jìn)行治療。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肥胖型多囊卵巢綜合征（obese polycystic ovary syndrome，OPCOS）與肥胖型不孕（obese infertility，OI）是兩種不同的疾病，但病因病機(jī)卻相同，都是“恣于酒食”，致使“軀脂滿溢，濕痰閉塞子宮”，辨證都可以辨為“痰濕阻滯證”。燥濕化痰是治療痰濕證的重要法則。因此，利用燥濕化痰的方法治療這兩種疾病符合“異病同治”理論。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，由半夏、陳皮、茯苓、甘草四味中藥構(gòu)成，具有燥濕化痰，理氣和中的功效，是治療痰濕證的基礎(chǔ)方。近年來，隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的深入，“異病同治”成為了中藥現(xiàn)代化研究的重要方向：項昌培[1]等研究了三七對糖尿病腎病、糖尿病腦病和糖尿病心肌病的“異病同治”；沈浮[2]等研究了追風(fēng)透骨膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎“異病同治”；丁珊珊[3]等進(jìn)行了二陳湯治療“慢性阻塞性肺病”、“多囊卵巢綜合征”與“非酒精性脂肪肝”的“異病同治”研究。本文旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討二陳湯“異病同治”肥胖型PCOS 與肥胖型不孕的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，以期探討二陳湯治療肥胖型PCOS 與肥胖型不孕的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 中藥活性成分及靶點獲取

利 用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）以半夏、陳皮、茯苓、甘草為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取各藥成分。再利用口服生物利用度（OB）≥30%以及類藥性（DL）≥0.18 進(jìn)一步篩選，獲取各藥中的潛在活性成分。根據(jù)得到的潛在活性成分，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集其靶點[4]。

1.2 疾病靶點獲取

利用GeneCard（https://www.genecards.org/）與OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）以obesity、polycystic ovary syndrome、infertility 等為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得相應(yīng)疾病靶點。將肥胖與不孕的靶點交集獲得肥胖型不孕靶點（#1），將肥胖與PCOS 靶點交集獲得肥胖型PCOS 的靶點（#2）[5]。

1.3 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.1”項下二陳湯的靶點與“1.2”項下肥胖型不孕的靶點進(jìn)行交集，得到#3；二陳湯與肥胖型PCOS 的靶點進(jìn)行交集，得到#4。#3 與#4 交集得到#5，#5 即為肥胖型不孕與肥胖型PCOS 的公共靶點；#6=#3?#5 即為肥胖型不孕的獨有靶點；#7=#4?#5 即為肥胖型PCOS 的獨有靶點。利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用STRING（https://www.string-db.org/）構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，物種選擇人類，相關(guān)度設(shè)置為>0.900，其余保持默認(rèn)設(shè)置，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，圖中節(jié)點代表蛋白，連線代表蛋白與蛋白間的相互作用關(guān)系，度值越高，說明蛋白越關(guān)鍵。最后下載蛋白互作關(guān)系文件（tsv 格式），并粘貼KEGG 分析出的通路名稱、基因比、P值以及基因數(shù)目至Excel 表格。

1.5 GO 及KEGG 富集分析

利用CytoScape 3.7.1 軟件中的ClueGo 功能對公共靶點進(jìn)行GO 生物過程富集分析，P值設(shè)定為<0.05，生物過程中至少包含15 個基因，合并類似生物過程，保存結(jié)果，將結(jié)果可視化。將“1.4”項下KEGG 的結(jié)果導(dǎo)入線上作圖軟件，選取與肥胖型不孕和肥胖型PCOS 相關(guān)的通路繪制KEGG 富集分析圖，并根據(jù)KEGG 富集分析結(jié)果從KEGG 網(wǎng)站（https://www.kegg.jp/）上下載通路圖，將二陳湯能夠干預(yù)的靶點標(biāo)記為紅色。

1.6 分子對接

利用Pubchem 數(shù)據(jù)庫獲取“1.3”項下得到度值較高活性成分的三維結(jié)構(gòu)，保存為SDF 格式，進(jìn)一步利用openbabel 轉(zhuǎn)化為PDBQT 格式。利用PDB數(shù)據(jù)庫獲取“1.4”項下得到的度值最高的蛋白的結(jié)構(gòu)（PDB 格式），利用Pymol 對該蛋白進(jìn)行去配體操作，再利用Autodock 軟件進(jìn)行去水、加氫、加電荷操作，保存為PDBQT 格式。根據(jù)PDB 數(shù)據(jù)庫中配體的活性位點設(shè)置本次對接的活性位點，運行Autogrid與Autodock 進(jìn)行配體與蛋白的對接，并獲得相應(yīng)的結(jié)合能，最后利用Pymol 將分子對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 中藥活性成分及靶點獲取

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中，檢索到半夏成分116 個，陳皮成分63 個，茯苓成分34 個，甘草成分280 個。根據(jù)OB、DL 進(jìn)行篩選，獲取到半夏潛在活性成分13 個，陳皮潛在活性成分5 個，茯苓潛在活性成分15 個，甘草潛在活性成分92 個。共對應(yīng)靶點2 031 個，去除重復(fù)靶點后，獲得靶點218 個。

2.2 疾病靶點獲取

利用GeneCard 與OMIM 數(shù)據(jù)庫獲得肥胖相關(guān)靶點9 513 個，PCOS 靶點4 797 個，不孕癥靶點4 171 個。肥胖與不孕癥的交集靶點為2 783 個，肥胖與PCOS 交集靶點2 962 個，見圖1。

圖1 中藥靶點與疾病靶點維恩圖

2.3 活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

肥胖與不孕的交集靶點為肥胖型不孕靶點（#1），肥胖與PCOS 的交集靶點為肥胖型PCOS 靶點（#2），二陳湯與肥胖型不孕的交集靶點為136 個（#3），二陳湯與肥胖型PCOS 的交集靶點為149 個（#4），#3 和#4 的交集靶點（#5）為117 個，二陳湯治療肥胖型不孕的獨有靶點為19 個（#6），二陳湯治療肥胖型PCOS 的獨有靶點為32 個（#7），見圖1。節(jié)點代表成分或靶點，邊代表成分與靶點之間的相互作用關(guān)系，某一個節(jié)點散發(fā)的邊越多，說明其度值越高，在網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位。其中紅色菱形代表二陳湯潛在活性成分，綠色圓形代表肥胖型不孕與肥胖型PCOS 的公共靶點，藍(lán)色圓形代表肥胖型不孕的獨有靶點，紫色圓形代表肥胖型PCOS 的獨有靶點，見圖2。根據(jù)度值的大小由高到低進(jìn)行排序，度值排名前5 名的藥物為槲皮素、山奈酚、柚皮素、黃芩苷和刺芒柄花素，其度值分別為116、41、25、24、23，度值排名前5 的靶點包括前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）、雄激素受體（AR）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）和一氧化氮合酶2（NOS2），其度值分別為116、91、78、69、66。

圖2 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將二陳湯治療肥胖型不孕的117 個靶點與二陳湯治療肥胖型PCOS 的149 個靶點分別導(dǎo)入STRING 軟件，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。經(jīng)過相關(guān)度>0.9 篩選后得到二陳湯干預(yù)肥胖型不孕的節(jié)點數(shù)為123 個，邊有1 022 條，平均節(jié)點度值為8.31；二陳湯干預(yù)肥胖型PCOS 的節(jié)點數(shù)為133 個，邊有1 086 條，平均節(jié)點度值為8.17。將STRING 軟件導(dǎo)出的二陳湯治療肥胖型不孕和二陳湯治療肥胖型PCOS tsv 格式文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，選取度值大于20 的節(jié)點作為關(guān)鍵節(jié)點進(jìn)行可視化。其中圓圈半徑越大、顏色越深表示該節(jié)點處于重要地位，連線越粗顏色越深代表兩個節(jié)點的相關(guān)性越強(qiáng)。篩選得到二陳湯治療肥胖型不孕的關(guān)鍵靶點包括STAT3、JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK14 和FOS，見圖3A 和圖3B；二陳湯治療肥胖型PCOS 的關(guān)鍵靶點包括STAT3、JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、MAPK14、IL-6、MAPK8、FOS、EGFR 和ESR1，見圖3C，圖3D。其中，STAT3、JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、MAPK14、IL-6 和FOS 是二者共有靶點，表明這8 個靶點可能是二陳湯治療肥胖型不孕和肥胖型PCOS“異病同治”的關(guān)鍵靶點。

圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 與KEGG 富集分析

為了進(jìn)一步探究二陳湯“異病同治”的作用機(jī)制，利用Cytoscape 3.7.1 進(jìn)行二陳湯治療肥胖型PCOS 和肥胖型不孕細(xì)胞對激素刺激的應(yīng)答、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的應(yīng)答等生物過程有關(guān)；二陳湯治療肥胖型PCOS 主要與細(xì)胞運動的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的應(yīng)答、對凋亡過程的調(diào)節(jié)等生物過程有關(guān)，見圖4，可見，二者具有相同的生物過程。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，二陳湯治療肥胖型PCOS 的靶點主要富集在AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗、內(nèi)分泌抵抗等通路；二陳湯治療肥胖型不孕的靶點主要富集在AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、內(nèi)分泌抵抗、HIF-1 信號等通路，見圖5。AGE-RAGE 信號通路見圖6，其中藍(lán)色是二陳湯治療肥胖型不孕的靶點，紅色是二陳湯治療肥胖型PCOS 的靶點。綜上可見，二陳湯治療這兩種疾病對應(yīng)的靶點參與的生物過程與信號通路既存在相似性，也存在差異性，為二陳湯“異病同治”提供了理論依據(jù)。

圖4 GO 富集分析

圖5 KEGG 富集分析

圖6 AGE-RAGE 信號通路圖

2.6 分子對接結(jié)果

活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖顯示：度值較高的成分包括槲皮素、山奈酚、柚皮素、黃芩苷和刺芒柄花素，其CAS 號分別為：117-39-5、520-18-3、480-41-1、21967-41-9 和485-72-3。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示STAT3 為度值最高的蛋白質(zhì)，但由于槲皮素、山奈酚等和STAT3 的對接結(jié)果已被報道[6-7]。因此，本研究選擇JUN 蛋白作為對接受體，其PDB 數(shù)據(jù)庫ID 為4y46，將活性成分與蛋白質(zhì)進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示刺芒柄花素的結(jié)合能最強(qiáng)，為?6.02 kcal/mol，其次為柚皮素，結(jié)合能為?5.41 kcal/mol，山奈酚、黃芩苷、槲皮素的結(jié)合能類似，分別為?5.17 kcal/mol、?5.15 kcal/mol 和?5.11 kcal/mol，對接模式見圖7。

圖7 槲皮素(A)、黃芩苷(B)、刺芒柄花素(C)、山奈酚(D)和柚皮素(E)與JUN 對接模式圖

3 討論

二陳湯中以半夏為君，其性溫燥重在化痰；陳皮理氣，治痰先治氣，與半夏相須為用；茯苓為佐，重在健脾滲濕，因“脾為生痰之源”；甘草為使，合諸藥而解百毒，四藥合用，共奏燥濕化痰之功?，F(xiàn)代研究表明，加味二陳湯可以改善肥胖型PCOS 患者卵巢多囊樣改變、內(nèi)分泌功能以及糖脂代謝[8]；還可幫助肥胖型不孕患者受孕[9]。二陳湯對肥胖型PCOS 與肥胖型不孕均具有明顯療效，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對二陳湯“異病同治”進(jìn)行探討。

本研究表明槲皮素、山奈酚、柚皮素、黃芩苷等為二陳湯關(guān)鍵的活性成分，這些活性成分均屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用。現(xiàn)代研究表明，槲皮素可以明顯降低肥胖型PCOS 患者睪酮（T）與黃體生成素（LH）水平[10]，從而改善PCOS 高雄激素狀態(tài)并促進(jìn)患者排卵；槲皮素還可以使不孕癥患者芳香化酶表達(dá)降低[11]，幫助患者排卵受孕。黃芩苷可以通過抑制炎癥反應(yīng)下調(diào)caspase-3 減少顆粒細(xì)胞凋亡[12]，抑制活性氧產(chǎn)生減少卵母細(xì)胞凋亡[13]，發(fā)揮治療作用。山奈酚對于肥胖型PCOS 和肥胖型不孕亦具有改善作用，山奈酚是一種天然的孕酮受體調(diào)節(jié)劑，可以在體內(nèi)外激活孕酮受體信號[14]；同時山奈酚改善胰島素抵抗可以調(diào)控肥胖型PCOS 患者的糖脂代謝[15]。

從靶點上看，STAT3、JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、MAPK14、IL-6 和FOS 是二陳湯“異病同治”的關(guān)鍵靶點，以STAT3、JUN、MAPK1 最為重要。STAT3 在細(xì)胞的生長與死亡中起到關(guān)鍵作用，其主要受到細(xì)胞因子和生長因子的調(diào)節(jié)。IL-6 是一種細(xì)胞因子，在IL-6 的作用下可以使STAT3磷酸化激活，從而介導(dǎo)下游的細(xì)胞生物過程。研究表明當(dāng)歸水提物可以降低p-STAT3 從而降低激素水平與炎癥反應(yīng)[16]；肌醇可以通過降低p-STAT3改善卵巢組織的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[17]。也有研究表明右歸膠囊可以通過JAK2/STAT3 通路改善高齡不孕患者的體外受精結(jié)局[18]?？梢?，STAT3 是二陳湯“異病同治”的關(guān)鍵靶點。MAPKs 是信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，能被不同的細(xì)胞外刺激，如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等激活，MAPK/ERK 途徑的異常激活，導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)系統(tǒng)破壞，進(jìn)而出現(xiàn)胰島素抵抗[19]。左歸丸可以通過抑制MAPK/ERK 通路中相關(guān)重要因子的基因表達(dá)，改善PCOS 大鼠的胰島素抵抗和卵巢多囊樣改變[20]；補(bǔ)腎化痰法可以經(jīng)APN/p38MAPK 信號通路，改善肥胖型PCOS 的糖脂代謝紊亂[21]。JUN是MAPK 信號通路中的重要分支，它在細(xì)胞周期、生殖、凋亡、細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，脫氫表雄酮下調(diào)尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）/uPAR 通過JNK 信號通路提高p-c-Fos、p-c-Jun 的表達(dá)，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲，改善卵巢功能，從而起到治療PCOS 型不孕的作用[22]。

GO 與KEGG 富集分析表明，二陳湯“異病同治”的靶點主要富集在炎癥、糖脂代謝、內(nèi)分泌等信號通路。最新醫(yī)學(xué)研究顯示，PCOS 是一類慢性炎癥相關(guān)性疾病，這種炎癥不同于細(xì)菌或病毒感染的急性炎癥，是一種長期存在的免疫性炎癥，通常以IL-6、CRP、TNF-α 等水平反映機(jī)體的免疫狀態(tài)[23]。目前研究普遍認(rèn)為當(dāng)機(jī)體處于炎癥狀態(tài)時，炎癥因子水平增加并激活幾條重要的炎癥信號通路，例如JAK-STAT 信號通路、MAPK 信號通路以及NF-kBp65 信號通路等，這些炎癥信號通路與胰島素信號通路之間通過交叉對話促使胰島素受體底物-1（INS-1）、INS-2 等分子的表達(dá)或活性受到抑制，誘導(dǎo)胰島素抵抗的產(chǎn)生[24]；而胰島素抵抗又進(jìn)一步通過抑制胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1（IGFBP-1）基因轉(zhuǎn)錄或抑制肝臟性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）合成等途徑刺激雄激素合成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)亢進(jìn)，最終導(dǎo)致高雄激素血癥的產(chǎn)生。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，二陳湯“異病同治”肥胖型PCOS 與肥胖型不孕的成分主要包括槲皮素、山奈酚、黃芩苷，“異病同治”的靶點為STAT3、JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、MAPK14、IL6 和FOS，炎癥通路、糖脂代謝通路、內(nèi)分泌通路是二陳湯異病同治的關(guān)鍵因素，這為中醫(yī)藥治療慢性低度炎癥，改善胰島素抵抗，調(diào)整月經(jīng)周期提供了理論依據(jù)。