外周血凝血指標(biāo)、血小板計(jì)數(shù)和NLR 檢測對惡性腫瘤患者治療前機(jī)體凝血狀態(tài)的評估價值

汪 敏, 于鵬躍, 王 言, 宋燕珂, 李 峣, 孫 瑩, 趙麗艷

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長春 130041）

近年來惡性腫瘤的發(fā)病率逐年升高，病死率已升至人類疾病的第2 位。靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE） 是惡性腫瘤患者的常見并發(fā)癥，發(fā)病率為5%～10%［1］，如果不采取積極有效的抗凝治療，VTE 可影響腫瘤患者的進(jìn)一步治療，成為導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一［2］。多數(shù)研究者關(guān)注惡性腫瘤患者在治療過程中并發(fā)VTE，而對于治療前患者凝血狀態(tài)的研究較少。部分腫瘤患者在初診時并未出現(xiàn)VTE 的臨床表現(xiàn)，但凝血常規(guī)指標(biāo)和血小板計(jì)數(shù)卻已出現(xiàn)異常，提示患者機(jī)體處于亞臨床高凝狀態(tài)［3］。研究［4-6］表明：中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（neutrophil/lymphocyte ratio，NLR） 是一種常用的、非特異性急性炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，可作為全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后VTE 發(fā)生及視網(wǎng)膜靜脈血栓形成的預(yù)測指標(biāo)，提示NLR 對于機(jī)體高凝狀態(tài)的評估具有一定價值。研究［7-9］證明：手術(shù)、化療、放療和生物治療等方法，會對惡性腫瘤患者的凝血狀態(tài)產(chǎn)生不同程度影響。本文作者收集惡性腫瘤患者治療前外周血中凝血指標(biāo)、血小板計(jì)數(shù)和NLR 數(shù)據(jù)，進(jìn)行回顧性分析，評估治療前惡性腫瘤患者機(jī)體的止凝血狀態(tài)，為預(yù)防腫瘤患者血栓形成、提高生活質(zhì)量和延長患者生存期提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2018 年11 月—2020 年4 月吉林大學(xué)第二醫(yī)院收治的354 例惡性腫瘤患者為腫瘤組，男性135 例，女性219 例，年齡25～85 歲，平均年齡（55.70±11.00） 歲。其中宮頸癌74 例，肺癌65 例，卵巢癌55 例，結(jié)直腸癌50 例，胃癌43 例，食管癌35 例和胰腺癌32 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合相應(yīng)腫瘤的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，均未進(jìn)行臨床治療（包括手術(shù)、化療、放療和生物治療等），所有腫瘤分期均按照相應(yīng)腫瘤最新版的TNM 分期執(zhí)行。排除標(biāo)準(zhǔn)：①活動性或慢性感染；②患有嚴(yán)重的血液系統(tǒng)疾?。虎厶悄虿?；④嚴(yán)重肝或腎功能不全；⑤同時并存其他原發(fā)性腫瘤；⑥3 個月內(nèi)接受抗凝劑和（或） 抗血小板治療。對照組為2020 年4 月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院體檢中心體檢的健康成年人100 名，男性40 名，女性60 名，年齡20～78 歲，平均年齡（44.10±12.60） 歲，心、肺、肝和腎功能檢查未見明顯異常，排除家族中有腫瘤或遺傳病史者。對照組和患者基本資料見表1。

表1 各組受試者基本資料Tab.1 Basic informations of subjects in various groups

1.2 凝血指標(biāo)檢測采集受試者2.7 mL 空腹靜脈血，注入含有濃度為109 mmol·L－1枸櫞酸鈉0.3 mL 的真空抗凝管中，輕輕顛倒混勻，3 000 r·min－1離心10 min，取上清乏血小板血漿用于測定，注意將黃疸、乳糜和溶血等可能對檢測結(jié)果有影響的標(biāo)本去除，采用美國沃芬公司ACLTOP 全自動凝血分析儀檢測凝血指標(biāo)。采用凝固法- 透射比濁法檢測凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、 活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT） 和凝血酶時間（thrombin time ，TT），將接觸因子或激活劑加入到血漿中，使血漿發(fā)生凝固，凝血儀記錄血漿中吸光度（A） 值的變化，并將其轉(zhuǎn)變成數(shù)據(jù)，經(jīng)過預(yù)定的數(shù)學(xué)法則處理，得出檢測結(jié)果，單位以秒（s）表示；采用凝血酶凝固法（Clauss 法） 檢測纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB） 水平，以過量凝血酶作用于待檢血漿中的FIB，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，血漿凝固，血漿中FIB 的含量與凝固時間呈負(fù)相關(guān)，檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比即可得出FIB 水平，單位為g·L－1；采用免疫比濁法檢測D-二聚體（D-Dimer）和纖維蛋白（原） 降解產(chǎn)物（fibrin or fibrinogen degradation products ，F(xiàn)DP） 水平，血漿中的D-Dimer 和FDP 與各自試劑中單克隆抗體致敏的乳膠顆粒發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，發(fā)生凝集后血漿濁度上升，通過測定濁度的變化，求出D-Dimer 和FDP 水平，單位為mg·L－1；采用發(fā)色底物法檢測抗凝血酶（antithrombin，AT） 活性，在血漿中加入肝素后形成復(fù)合物（AT·肝素），在該復(fù)合物中加入過量的凝血因子Ⅹa （coagulation factor Ⅹa，F(xiàn) Ⅹa） 與其發(fā)生反應(yīng)，形成無活性的復(fù)合物（AT·肝素·FⅩa），當(dāng)加入底物后，殘留的FⅩa將底物分解并產(chǎn)生游離的p-硝基苯胺，通過定量檢測游離p-硝基苯胺的量，可間接計(jì)算出樣本中AT活性的百分比。為減少凝血因子離體后活性減低對檢測結(jié)果的影響，應(yīng)在標(biāo)本采集后4 h 內(nèi)完成檢測。

1.3 血小板計(jì)數(shù)和NLR 檢測采集受試者2.0 mL 空腹靜脈血，注入含有15% 的EDTA-K2抗凝劑的真空管內(nèi)，充分顛倒混勻，半小時后上機(jī)檢測。采用日本希森美康全自動血細(xì)胞分析儀Sysmex-XN2000 進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)、 中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的檢測，試劑為原裝配套熒光染液、溶血劑和稀釋液，同時計(jì)算NLR。為避免延遲檢測對檢測結(jié)果真實(shí)性的影響，應(yīng)在標(biāo)本采集后2 h 內(nèi)完成檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。研究對象年齡和BMI 及外周血各檢測指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（Kolmogorov-Smirnov 和Shapiro-Wilk） 及方差齊性檢驗(yàn)（Levene’s），對于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料（研究對象年齡和BMI，外周血PT、 APTT、 TT、 FIB、 AT、 血小板計(jì)數(shù)和NLR） 均以±s表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)）；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料（D-Dimer 和FDP） 以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M （P25，P75）］ 表示，2 組間比較采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)），多組間比較采用多個獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)（Kruskal-WallisH檢驗(yàn)）。性別構(gòu)成以頻數(shù)或百分率表示，2 組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組患者凝血指標(biāo)、血小板計(jì)數(shù)和NLR

與對照組比較，早和晚期腫瘤組患者PT 均延長（P＜0.01），APTT 均縮短（P＜0.05 或P＜0.01），F(xiàn)IB、 D-Dimer、 FDP 水平和NLR 均升高（P＜0.01）；與對照組比較，晚期腫瘤組患者TT縮短（P＜0.05），AT 活性降低（P＜0.05），血小板計(jì)數(shù)升高（P＜0.05）；與早期腫瘤組比較，晚期腫瘤組患者PT 延長（P＜0.01），TT 縮短（P＜0.01），F(xiàn)IB、 D-Dimer、 FDP 水平和NLR 升高（P＜0.01）。見表2。

表2 對照組和腫瘤組受試者凝血指標(biāo)、血小板計(jì)數(shù)和NLRTab.2 Coagulation indexes, platelet counts and NLR of subjects in control group and tumor group

2.2 不同類型腫瘤組患者凝血指標(biāo)、血小板計(jì)數(shù)和NLR與對照組比較，各類型腫瘤組患者PT 均延長（P＜0.05 或P＜0.01），除食管癌外的不同類型腫瘤組患者APTT 均縮短（P＜0.05 或P＜0.01），肺癌、 卵巢癌和食管癌患者TT 均縮短（P＜0.05 或P＜0.01），各類型腫瘤組患者FIB 、D-Dimer 和FDP 水平均升高（P＜0.05 或P＜0.01），結(jié)直腸癌、 食管癌和胰腺癌患者AT 活性降低（P＜0.05），晚期卵巢癌患者血小板計(jì)數(shù)升高（P＜0.01），各類型腫瘤組患者NLR 均升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

表3 對照組和不同類型腫瘤組受試者凝血指標(biāo)、血小板計(jì)數(shù)和NLRTab.3 Coagulation indexes, platelet counts, and NLR of subjects in control group and different types of tumor groups

續(xù)表

3 討 論

惡性腫瘤患者血液常處于高凝狀態(tài)，主要原因包括腫瘤細(xì)胞自身促凝、腫瘤細(xì)胞與凝血因子間相互作用促凝和腫瘤治療相關(guān)的促凝［10］。腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)或分泌不同的促凝蛋白，如組織因子（tissue factor，TF）、癌促凝素（cancer procoagulant，CP） 和乙酰肝素酶等，激活機(jī)體凝血系統(tǒng)［3］。局部腫物腔內(nèi)生長時引起血流減慢與淤滯，與此同時造成血管內(nèi)皮損傷，釋放出血管性血友病因子（von willebrand factor，VWF）、TF 和黏附因子等，從而導(dǎo)致機(jī)體止血、凝血功能紊亂以及血栓事件的發(fā)生。與普通人群比較，惡性腫瘤患者發(fā)生VTE的風(fēng)險增加4～7 倍［11］，增加了腫瘤患者的死亡風(fēng)險。在臨床治療前對患者的止凝血狀態(tài)進(jìn)行綜合評估，旨在減少惡性腫瘤患者并發(fā)血栓發(fā)生的概率，從而進(jìn)行有針對性的抗凝治療。

本研究中凝血常規(guī)檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，早和晚期惡性腫瘤組患者PT 均延長，與蔣麗君等［12］報(bào)道的晚期惡性腫瘤患者PT 水平均高于健康對照組的結(jié)果一致。PT 是外源性凝血途徑最常用的篩查試驗(yàn)，由TF 啟動凝血級聯(lián)反應(yīng)，PT 雖有延長，但延長程度并無臨床意義，考慮是惡性腫瘤釋放促凝物質(zhì)，消耗部分凝血因子所致。本研究中，與對照組比較，早和晚期腫瘤組患者APTT 均縮短，F(xiàn)IB 和D-Dimer 水平均升高，與有關(guān)研究報(bào)道［12-13］相符。APTT 縮短多見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病，F(xiàn)IB 是參與止凝血過程的重要物質(zhì)，是血栓性疾病發(fā)生的獨(dú)立危險因素。D-Dimer 既是機(jī)體纖溶酶降解交聯(lián)纖維蛋白后的產(chǎn)物，也是活動性血栓形成的標(biāo)志物之一，臨床上用于對VTE 發(fā)生的排除診斷。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，早和晚期腫瘤組患者FDP 均升高，但在不同類型腫瘤組中只有晚期卵巢癌患者具有臨床意義，結(jié)合D-Dimer 的變化，考慮晚期卵巢癌患者止凝血平衡已經(jīng)破壞；與對照組比較，晚期惡性腫瘤患者TT 縮短且AT 活性降低，TT 縮短多見于肺癌和卵巢癌晚期患者。AT 是肝臟合成的重要抗凝物質(zhì)，與肝素結(jié)合后能迅速滅活多種凝血因子的活性，尤其與凝血酶結(jié)合后生成無活性的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物。有研究［14］顯示：早期腫瘤患者AT 活性與正常人比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，晚期腫瘤患者AT 活性可明顯降低。本研究中AT 活性降低主要見于晚期結(jié)直腸癌、食管癌和胰腺癌患者，表明該類患者機(jī)體抗凝活性減低，凝血功能相對增強(qiáng)。與對照組比較，本研究所納入的不同類型腫瘤組患者PT 均延長、 APTT 均縮短、 FIB 、D-Dimer 和FDP 水平均升高，其中PT 延長和FDP水平升高程度并未達(dá)到具有臨床意義的界值，所以惡性腫瘤患者在治療前具有臨床意義的變化主要為APTT 縮短及FIB 和D-Dimer 水平升高，提示腫瘤患者機(jī)體正常的止凝血平衡已經(jīng)破壞，存在高凝狀態(tài)，且該變化在晚期惡性腫瘤患者中表現(xiàn)更為明顯。

在本研究外周血常規(guī)檢測中，與對照組比較，晚期惡性腫瘤患者血小板計(jì)數(shù)升高，尤其是晚期卵巢癌患者，雖然晚期宮頸癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌和食管癌患者血小板計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可以看出上述患者血小板計(jì)數(shù)有升高趨勢。有研究［15］指出：30%～60% 惡性腫瘤患者的血小板計(jì)數(shù)升高，且在疾病的進(jìn)展期和晚期更易出現(xiàn)。腫瘤細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素6 （interleukin- 6，IL-6），使血清中血小板生成素（thrombopoietin，TPO） 的水平明顯升高，促進(jìn)骨髓巨核系統(tǒng)增殖及血小板釋放［16］。GEDDINGS 等［17］研究表明： 惡性腫瘤組織分泌的微泡（microvesicles ，MVs） 中TF 表達(dá)明顯增加，通過生成凝血酶進(jìn)而激活血小板，促進(jìn)血栓形成。另外，血小板可以釋放促凝微顆粒，通過激活凝血途徑促進(jìn)纖維蛋白沉積與微血栓形成［3］。血小板數(shù)量增多與功能異?；罨茄ㄐ约膊“l(fā)生的主要原因之一，有針對性的抗血小板治療也是預(yù)防惡性腫瘤患者血栓發(fā)生的方法之一。

近年來研究［18］表明：中性粒細(xì)胞除了參與機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)之外，還能夠影響血液凝固并參與病理性血栓的形成。中性粒細(xì)胞在腫瘤組織中大量存在，通過釋放中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，Nets） 而導(dǎo)致病理性靜脈和動脈血栓形成或稱 “免疫血栓形成”［19］。有研究［20］證明：Nets 主要通過某些機(jī)制促進(jìn)VTE 的發(fā)生。一方面，Nets 提供重要網(wǎng)狀支架，介導(dǎo)血小板的黏附、聚集和活化，招募紅細(xì)胞聚集，促進(jìn)纖維蛋白沉積與微血栓形成；另一方面，Nets 通過介導(dǎo)凝血酶的合成來增加凝血功能。研究［21-23］顯示：NLR 作為一種全身性炎癥的生物學(xué)標(biāo)志物，也是VTE 發(fā)生的危險因素之一，且與VTE 血栓負(fù)荷有關(guān)聯(lián)。許嬋等［24］報(bào)道：惡性腫瘤患者凝血因子Ⅴ（coagulation factor Ⅴ，F(xiàn)Ⅴ）和凝血因子Ⅷ（coagulation factorⅧ，F(xiàn)Ⅷ） 活性增強(qiáng)，F(xiàn)IB 與D-Dimer 水平明顯升高，AT 活性明顯降低，而上述凝血指標(biāo)的異常與NLR 升高具有一致性，在某種程度上NLR 水平升高提示患者止凝血功能紊亂。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，早期和晚期不同類型腫瘤組患者NLR 均升高，且該變化在晚期腫瘤患者中更為明顯。

在臨床工作中，腫瘤患者處于高凝狀態(tài)對疾病的治療、進(jìn)展和預(yù)后均有不利影響，對患者凝血狀態(tài)進(jìn)行評估至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明：惡性腫瘤患者在治療前凝血指標(biāo)異常，血小板計(jì)數(shù)和NLR升高，在一定程度上均提示機(jī)體處于高凝狀態(tài)，晚期腫瘤患者更為明顯，具有并發(fā)血栓發(fā)生的風(fēng)險。臨床上可以結(jié)合凝血常規(guī)指標(biāo)、PLT 和NLR 初步判斷腫瘤患者凝血狀態(tài)，有助于后期建立準(zhǔn)確而有針對性的抗凝和抗血小板治療策略，從而預(yù)防惡性腫瘤患者VTE 的發(fā)生。