乳腺癌患者外周血中hMAM、SBEM 和CEACAM19 mRNA聯(lián)合檢測及其臨床意義

于秀艷, 李 鋌, 叢占杰, 王文龍, 張曉偉, 吳雪峰

（吉林省腫瘤醫(yī)院檢驗科，吉林 長春 130012）

乳腺癌血行轉(zhuǎn)移和復發(fā)與外周血中循環(huán)的腫瘤細胞有密切關(guān)聯(lián)，監(jiān)測外周血中的腫瘤細胞對早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌微轉(zhuǎn)移具有重要意義［1］。腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中需要以形成新生血管的形式來持續(xù)吸氧和吸收營養(yǎng)，由于新生血管管壁通透性大，也為癌細胞進入外周血提供了途徑［2］。近年來，隨著乳腺癌相關(guān)分子生物學研究的不斷擴大，分子靶向治療是目前最活躍的研究領(lǐng)域之一［3］。分子靶向在乳腺癌診斷、分期和綜合治療中發(fā)揮著重要作用。人乳腺珠蛋白（human mammaglobin，hMAM） 是1996 年WASTON 等［4］在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)的一種具有高特異性的分泌性球蛋白。研究［5-6］表明：hMAM對于乳腺癌外周血微轉(zhuǎn)移診斷具有重要臨床意義。在乳腺癌組織中可以檢測到乳腺上皮小黏蛋白（small breast epithelial mucin，SBEM），其與乳腺癌患者預后有關(guān)［7］。SBEM mRNA 也可以作為乳腺癌患者骨髓微轉(zhuǎn)移的標志物［8］。SBEM 也是一個潛在的預測血行微轉(zhuǎn)移和乳腺癌新輔助化療反應的特異性標志物［9］，國內(nèi)外研究關(guān)于SBEM mRNA 在乳腺癌患者外周血中的檢測報道甚少。癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子19 （carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 19，CEACAM19）是癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA） 家族的新成員，也稱為CEA 樣基因1 （carcinoembryonic antigen-like gene 1，CEAL1），在腫瘤患者中表達敏感性高［10］。研究［11］表明： CEACAM19 與乳腺癌預后有關(guān)聯(lián)。有研究［12］表明：CEACAM19 mRNA 表達水平與乳腺癌患者雌激素受體（estrogen receptor，ER）表達水平有關(guān)。

單一的標志物診斷乳腺癌外周血微轉(zhuǎn)移具有局限性，在國內(nèi)外研究中，乳腺癌患者外周血中hMAM、 SBEM 和CEACAM19 mRNA 檢測均有報道［13-14］，但外周血中上述3 個指標的聯(lián)合檢測尚未見報道。本研究主要通過實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法聯(lián)合檢測乳腺癌患者外周血中hMAM、 SBEM和CEACAM19 mRNA 的陽性表達率，探討其診斷乳腺癌外周血微轉(zhuǎn)移的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2020 年1 月—2021 年3 月在吉林省腫瘤醫(yī)院乳腺治療中心行手術(shù)治療、術(shù)后經(jīng)病理確診且資料完整的乳腺腫瘤患者為研究對象。乳腺癌組患者104 例，均為女性，年齡30～80 歲，中位年齡52.5 歲；根據(jù)2013 年StGallen 乳腺癌國際會議專家共識進行乳腺癌分子分型，按照WHO 乳腺腫瘤組織學標準進行組織學分類：浸潤性導管癌71 例，浸潤性小葉癌20 例，黏液癌13 例；按照國際抗癌聯(lián) 盟 （Union for International Cancer Control，UICC） 2003 年制訂的乳腺癌TNM 分期標準進行分期：Ⅰ期13 例，Ⅱ期36 例，Ⅲ期39 例，Ⅳ期16 例。同期術(shù)后病理確診的良性乳腺病組患者52 例，其中乳腺纖維腺瘤31 例，乳腺導管內(nèi)乳頭狀瘤21 例，均為女性，年齡20～76 歲，中位年齡45.0 歲。健康對照組50 名，均為健康體檢者，均為女性，年齡22～80 歲，中位年齡48.5 歲。乳腺癌組、良性乳腺病組和健康對照組研究對象年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 納入標準和排除標準

1.2.1 納入標準 乳腺癌組和良性乳腺病組患者均為女性，為乳腺癌或乳腺良性病首診，有明確的病理學診斷依據(jù)，乳腺癌組患者TNM 分期明確為早期，均簽署知情同意書，術(shù)前未接受過放療、化療、內(nèi)分泌治療和生物治療等干預措施；健康對照組志愿者均為女性，來源于本院體檢中心的健康體檢者，均簽署知情同意書，彩色超聲和CT 等影像檢查結(jié)果正常，血常規(guī)、尿常規(guī)、便常規(guī)、生化常規(guī)和腫瘤標志物檢測結(jié)果均正常。

1.2.2 排除標準 乳腺癌組和良性乳腺病組患者有既往腫瘤病史，并發(fā)其他部位原發(fā)性腫瘤的患者，存在嚴重感染性疾病、糖尿病、心臟疾病、肝腎疾病和自身免疫性疾病，高血壓?。ㄊ湛s壓≥140 mmHg 或舒張壓≥90 mmHg），認知障礙和其他精神障礙，病歷資料不完整，標本溶血、乳糜血和黃疸；健康對照組志愿者既往有腫瘤病史，既往有自身免疫性疾病，標本溶血、乳糜血和黃疸。

1.3 實驗試劑、儀器和檢測方法

1.3.1 主要試劑和儀器 人外周血淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，血液RNA 提取試劑盒和FastKing 一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光試劑盒（SYBR Green） 均購自天根生化科技（北京） 有限公司，hMAM、SBEM、CEACAM19 和β-actin 引物（表1） 由寶生物工程（大連） 有限公司設(shè)計及合成。ABI7500 型RT-qPCR 儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司。

表1 PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR

1.3.2 標本采集 所有入組研究對象于清晨空腹采集EDTA 抗凝靜脈血5 mL，抗凝血用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，提取總RNA 用DEPC 處理的無菌EP 管于-80 ℃條件下保存待檢測。

1.3.3 RT-qPCR 法檢測各組受試者外周血中hMAM、 SBEM 和CEACAM 19 mRNA 陽性表達率 按照RNA 提取試劑盒說明書提取單個核細胞RNA，NanoDrop 2000C 測定RNA 含量?？偡磻w系為50 μL：2×FastKing RT-qPCR Buffer（SYBR Green） 25 μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μL，上下游引物（10 μmol·L－1） 各1.25 μL，總RNA 1 μg，50×ROX Reference Dye 1 μL，最后加入RNase-Free ddH2O 至50 μL。混合后進行擴增，反應條件： 50 ℃、 30 min，95 ℃、 3 min，95 ℃、15 s、60 ℃、30 s，40 個循環(huán)。采用2－ΔΔCt法計算目的基因相對表達水平［15］，測定值2－ΔΔCt＞2 為表達陽性，hMAM 聯(lián)合SBEM 和CEACAM19 檢測中任意一個指標陽性即為陽性表達，計算各組受試者外周血中hMAM、 SBEM 和CEACAM19 陽性表達率。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。乳腺癌患者外周血中hMAM、SBEM 和CEACAM19 mRNA 表達水平以±s表示。各組受試者hMAM、SBEM 和CEACAM19 mRNA 陽性表達率以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗或確切概率法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌患者外周血中hMAM、SBEM 和CEACAM19 mRNA 表達水平

hMAM、 SBEM 和CEACAM19 mRNA 在乳腺癌患者外周血中均有表達（圖1），其表達水平分別 為 3.79±7.16、 23.40±62.63 和 10.76±25.76。

圖1 RT-qPCR 法檢測乳腺癌患者外周血中hMAM、SBEM 和CEACAM19 mRNA 表達水平的擴增曲線Fig.1 Amplification curves of expression levels of hMAM,SBEM and CEACAM19 mRNA in peripheral blood of patients with breast cancer detected by RT-qPCR method

2.2 不同臨床病理特征乳腺癌患者外周血中hMAM、SBEM 和CEACAM19 mRNA 陽性表達率

TNM 分期Ⅲ+ Ⅳ期乳腺癌組患者外周血中hMAM、 SBEM 和CEACAM19 mRNA 陽性表達率均高于TNM 分期Ⅰ+ Ⅱ期乳腺癌組（P＜0.05）；SBEM 和CEACAM19 mRNA 陽性表達率與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)（P＜0.05），hMAM mRNA 陽性表達率與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)聯(lián)（P＞0.05）；3 項檢測指標與患者年齡、腫瘤大小、病理類型和孕激素受體（progesterone receptor，PR） 表達均無關(guān)聯(lián)（P＞0.05）；hMAM和SBEM mRNA 陽性表達率與ER 表達無關(guān)聯(lián)（P＞0.05），而CEACAM19 mRNA 陽性表達率與ER 表達有關(guān)聯(lián)（P＜0.05） ； SBEM 和CEACAM19 mRNA 陽性表達率與HER-2 表達無關(guān)聯(lián)（P＞0.05），而hMAM mRNA 陽性表達率與HER-2 表達有關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征乳腺癌患者外周血中hMAM、SBEM 和CEACAM19 mRNA 陽性表達情況Tab.2 Positive expressions of hMAM, SBEM and CEACAM19 mRNA in peripheral blood of breast cancer patients with different clinicopathologic features [n（η/%）］

2.3 3 組受試者外周血中hMAM 聯(lián)合SBEM 和CEACAM19 mRNA 檢測陽性表達情況

健康對照組中無hMAM mRNA 陽性表達者，良性乳腺病組hMAM mRNA 陽性表達患者3 例，陽性表達率為7.9%，健康對照組與良性乳腺病組受試者外周血中hMAM mRNA 單獨及聯(lián)合SBEM和（或） CEACAM19 mRNA 檢測陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與健康對照組和良性乳腺病組比較，乳腺癌組患者外周血中hMAM mRNA 單獨或聯(lián)合SBEM 和（或）CEACAM19 mRNA 檢測陽性表達率均明顯升高（P＜0.05）。三者聯(lián)合檢測hMAM mRNA 陽性表達率從39.4% 增加到66.3%。見表3。

表3 3 組受試者外周血中hMAM 聯(lián)合SBEM 和CEACAM19 mRNA 檢測陽性表達情況Tab.3 Positive expressions in detection of hMAM combined with SBEM and CEACAM19 mRNA in peripheral blood of subjects in three groups ［n（η/%）］

2.4 不同TNM 分期乳腺癌患者hMAM 聯(lián)合SBEM 和CEACAM19 mRNA 檢測陽性表達率

與TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌組比較，TNM分期Ⅲ+ Ⅳ期乳腺癌組患者hMAM 單獨或聯(lián)合SBEM 和（或） CEACAM19 mRNA 檢測陽性表達率均明顯升高（P＜0.01）； 三者聯(lián)合檢測，TNM分期Ⅰ+ Ⅱ期乳腺癌組患者外周血中hMAM mRNA 陽性表達率從20.40% 升高至48.98%，TNM 分期Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌組患者外周血中hMAM mRNA 陽性表達率從56.40% 升高至81.82%。見表4。

表4 不同TNM 分期乳腺癌患者外周血中hMAM 聯(lián)合SBEM 和CEACAM19 mRNA 檢測陽性表達情況Tab.4 Positive expressions in detection of hMAM combined with SBEM and CEACAM19 mRNA in peripheral blood of breast cancer patients at different TNM stages ［n（η/%）］

3 討 論

hMAM 在血液和骨髓中不表達，在正常乳腺上皮組織中表達較低，而在乳腺癌組織中高表達，其他腫瘤均不表達，具有乳腺組織表達特異性。乳腺癌常見轉(zhuǎn)移部位有淋巴結(jié)、外周血和骨髓，常規(guī)方法很難檢測到微小轉(zhuǎn)移病灶，因乳腺癌組織高特異性，hMAM mRNA 檢測已被國內(nèi)外廣泛用于診斷乳腺癌外周血微轉(zhuǎn)移的研究［16-19］。一項納入20 多個研究包含2 300 例乳腺癌患者的Meta 分析［20］顯示：外周血中hMAM 表達是乳腺癌患者不良預后的一個預測指標。MIKSICEK 等［21］首次利用表達序列標簽技術(shù)和基因表達分析數(shù)據(jù)庫分離得到SBEM mRNA，SBEM 是一種可編碼的低相對分子質(zhì)量唾液酸糖蛋白，其僅在乳腺和唾液腺組織中表達，在其他組織中不表達，具有乳腺組織特異性，可用于乳腺癌微轉(zhuǎn)移的檢測。尤小蘭等［22］對92 例乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA 進行檢測并進行臨床隨訪，結(jié)果顯示： 外周血中hMAM mRNA 檢測有助于判斷乳腺癌預后。CEACAM19是CEA 家族的成員，屬于免疫球蛋白家族黏附分子，不具有乳腺癌組織特異性。研究［23-24］顯示：CEACAM19 在陰莖癌和胃癌組織中表達，且CEACAM19 與乳腺癌的進展有關(guān)［25］。ESTIAR 等［13］在研究CEACAM19 表達與激素受體狀態(tài)之間的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)：CEACAM19 可能是某些乳腺癌患者亞組（如ER/PR 陰性） 的新治療靶點。

本研究結(jié)果顯示：晚期乳腺癌患者外周血中hMAM、 SBEM 和CEACAM19 mRNA 陽性表達率均較早期乳腺癌患者高，其可能原因是由于乳腺癌患者TNM 分期越晚，腫瘤細胞侵襲能力越強，腫瘤微血管形成越多，擴大了腫瘤細胞與微血管的接觸面積，從而增加了腫瘤細胞進入外周血的機會，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［26］。本研究結(jié)果顯示：乳腺癌患者外周血中SBEM 和CEACAM19 mRNA 陽性表達率與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)，hMAM mRNA 陽性表達率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)聯(lián)；hMAM、SBEM 和CEACAM19 mRNA 陽性表達率與患者年齡、 腫瘤大小、 病理類型和PR 表達均無關(guān)；hMAM 和SBEM mRNA 陽性表達率與ER 表達無關(guān)聯(lián)，而CEACAM19 mRNA 陽性表達率與ER 表達有關(guān)聯(lián)；SBEM 和CEACAM19 mRNA 陽性表達率與HER-2 表達無關(guān)聯(lián)，而hMAM mRNA 陽性表達率與HER-2 有關(guān)聯(lián)。本研究中不同臨床病理特征乳腺癌患者外周血中hMAM 檢測結(jié)果與本課題組前期研究結(jié)果一致［27］。ZHANG 等［7］研究發(fā)現(xiàn)：SBEM mRNA 表達與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小和組織分級無關(guān)，但與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；陶健等［27］研究發(fā)現(xiàn)：乳腺癌患者外周血中SBEM mRNA 表達與患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)聯(lián)，而與患者年齡、腫瘤大小和激素受體差異無關(guān)聯(lián)；LIU 等［9］研究發(fā)現(xiàn)：SBEM mRNA表達水平與乳腺癌患者TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)，與腫瘤患者年齡、腫瘤大小和激素無相關(guān)性。上述3 項研究報道與本研究結(jié)果一致。ESTIAR 等［13］研究發(fā)現(xiàn)： CEACAM19 在腫瘤樣本中的表達與腫瘤患者臨床病理特征無關(guān)，而CEACAM19 在ER/PR 陽性和ER/PR 陰性乳腺癌患者中的表達差異有統(tǒng)計學意義，與PR 關(guān)系的研究結(jié)果與本研究不同； 于洪濤等［12］在研究CEACAM19 與乳腺癌相關(guān)激素基因關(guān)系時發(fā)現(xiàn)：乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中CEACAM19 mRNA表達水平明顯高于原發(fā)癌組織，ER 陽性組乳腺癌患者癌組織中CEACAM19 mRNA 表達水平明顯高于ER 陰性組，CEACAM19 mRNA 表達水平與PR 和Her-2 表達無相關(guān)性，結(jié)果與本研究結(jié)果一致。MICHAELIDOU 等［11］研究發(fā)現(xiàn)： 乳腺癌患者中CEACAM19 mRNA 表達與ER 有關(guān)聯(lián)，與PR、 Her-2 及腫瘤TNM 分期無關(guān)聯(lián)。CEACAM19 mRNA 表達結(jié)果存在差異可能是因樣本量和納入標準存在差異而產(chǎn)生，CEACAM19 在國內(nèi)外的研究報道相對較少，應在大樣本大數(shù)據(jù)前提下進行統(tǒng)計分析進一步證實。

本研究結(jié)果顯示：健康人外周血中未檢測到hMAM mRNA 表達，良性乳腺病組患者外周血中hMAM mRNA 陽性表達率僅7.9%，體現(xiàn)了hMAM 高特異度［6］；健康對照組與良性乳腺病組受試者外周血中hMAM mRNA 單獨及聯(lián)合SBEM和（或） CEACAM19 mRNA 檢測陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學意義；與健康對照組和良性乳腺病組比較，乳腺癌組患者外周血中hMAM mRNA 單獨或聯(lián)合SBEM 和（或） CEACAM19 mRNA 檢測陽性表達率均明顯升高，與以往報道［28］相符，三者聯(lián)合檢測hMAM mRNA 陽性表達率從39.4% 升高至66.3%。近幾年國內(nèi)外研究中，hMAM 在乳腺癌患者外周血中的陽性表達率為30%～60%［29-32］，本研究中hMAM 陽性率處于該范圍內(nèi)。本研究結(jié)果表明： 隨著乳腺癌患者TNM 分期增加，hMAM mRNA 陽性表達率升高，與TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌組比較，TNM 分期Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌組患者hMAM mRNA 單獨或聯(lián)合SBEM 和（或） CEACAM19 mRNA 檢測陽性表達率均明顯升高；三者聯(lián)合檢測，TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌組患者外周血中hMAM mRNA 陽性表達率從20.40% 升高至48.98%，TNM 分期Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌組患者外周血中hMAM mRNA 陽性表達率從56.40% 升高至81.82%。本研究結(jié)果顯示：hMAM 聯(lián)合SBEM 和CEACAM19 mRNA 檢測陽性率與hMAM 聯(lián)合SBEM 或CEACAM19 mRNA檢測陽性率相差不大，其主要原因是乳腺癌患者外周血中單個基因單獨表達的少，基本上都是兩兩表達或者三者同時表達，但與hMAM mRNA 單獨檢測時比較陽性表達率明顯升高。

綜上所述，本研究采用RT-qPCR 法檢測乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA 陽性表達率較低，但由于其高特異度，聯(lián)合SBEM mRNA 和（或）CEACAM19 mRNA 檢測可以提高hMAM mRNA檢測陽性表達率，在提高靈敏度的同時，又保證了其高特異度，有望成為乳腺癌早期篩查和診斷的有效方法，對于診斷乳腺癌外周血微轉(zhuǎn)移也具有一定臨床意義。