子宮內(nèi)膜異位癥患者細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因篩選的生物信息學(xué)分析

李 楠, 陳 蕾, 許天敏, 張 琨

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長春 130041；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長春 130041；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院研究中心，吉林 長春 130041）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMS） 是婦科常見的良性疾病，在育齡婦女中的發(fā)病率可達(dá)10%～15%，是育齡女性慢性盆腔痛和不育的常見病因［1］。研究［2-3］提示：EMS 雖為良性疾病卻有浸潤、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的惡病質(zhì)傾向及惡變的可能，其發(fā)病率逐年增加。EMS 病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前臨床上基本通過出現(xiàn)明顯癥狀后的B 超檢查及最終進(jìn)行有創(chuàng)病理活檢確診，很難早期發(fā)現(xiàn)和診斷。因此，急需探索用于EMS 早期診斷和預(yù)后評估的生物學(xué)標(biāo)記物。近年來，基于基因分子水平進(jìn)行EMS 發(fā)生發(fā)展的研究較多，EMS 組織中已鑒定出多種失調(diào)基因參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、血管形成、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和細(xì)胞黏附等功能［4-5］。隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來及生物信息學(xué)的發(fā)展，對數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以快速發(fā)現(xiàn)病變組織中的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），并可通過進(jìn)一步分析找到影響疾病發(fā)生發(fā)展的分子靶標(biāo)。本研究通過對基因表達(dá)匯編（Gene Expression Omnibus，GEO） 數(shù)據(jù)庫中EMS基因芯片進(jìn)行聯(lián)合分析，以期篩選出具有高可信度的DEGs 并分析其生物學(xué)功能，為揭示EMS 發(fā)生的分子機(jī)制提供理論依據(jù)，并有助于開辟EMS 研究的新方向。

1 資料與方法

1.1 EMS 基因芯片數(shù)據(jù)信息獲取使用GEO 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“endometriosis” 為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，采用GEO2R 在線工具篩選相關(guān)數(shù)據(jù)集。篩選條件：①mRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)集；②以異位子宮內(nèi)膜組織為樣本；③以病變旁或正常子宮內(nèi)膜組織為對照。選擇基于GPL571 平臺的GSE25628 數(shù)據(jù)集，其中包括8 個(gè)EMS 樣本（含一個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)樣本） 和6 個(gè)正常子宮內(nèi)膜樣本； 基于GPL6102 平臺的GSE23339 數(shù)據(jù)集，包括10 個(gè)EMS 樣本（含4 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)樣本） 和9 個(gè)正常子宮內(nèi)膜樣本； 基于GPL570 平臺的GSE7305 數(shù)據(jù)集，包括10 個(gè)EMS樣本和10 個(gè)正常子宮內(nèi)膜樣本。

1.2 DEGs 的提取和分析GEO2R （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/） 可用于分析GEO 數(shù)據(jù)集中不同數(shù)據(jù)組的差異表達(dá)水平。以EMS 組織為實(shí)驗(yàn)組，以正常子宮內(nèi)膜組織樣本為對照組，使用GEO2R 在線分析工具分別分析并篩選出GSE25628、GSE23339 和GSE7305 數(shù)據(jù)集中的DEGs。篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，且|logFC|≥1.5。以logFC≥1.5 為上調(diào)基因，logFC≤－1.5 為下調(diào)基因。然后，對每個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用Venn 圖網(wǎng)絡(luò)工具（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/） 確定3 個(gè)數(shù)據(jù)集公共的DEGs 用于進(jìn)一步分析。

1.3 DEGs 的基因本體功能注釋（Gene Ontology，GO）富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析使用富集分析數(shù)據(jù)庫6.8 版本（DAVID）（https：//david.ncifcrf.gov/） 進(jìn)行DEGs 的GO 注釋分析和KEGG 通路富集分析。在GO 分析中P＜0.01，在KEGG 分析中P＜0.05，數(shù)據(jù)被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最后獲得DEGs 的分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological process，BP）和細(xì)胞成分（cellular component，CC） 等注釋分析和通路富集分析。

1.4 DEGs 蛋白- 蛋白互作（protein-proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心基因篩選為了評估潛在的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，將上述所得的70 個(gè)DEGs 映射到STRING 數(shù)據(jù)庫11.0 版本（http：//string-db.org/） 進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。隨后通過Cytoscape 軟件（www.cytoscape.org/） 將PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化并去除游離蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)。最后通過cytoscape 的一個(gè)插件CytoHubba 計(jì)算每個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的連接度（Degree） 并按照降序排列，以排序前10 的DEGs 作為EMS 發(fā)病相關(guān)的核心基因。

2 結(jié) 果

2.1 EMS 患者DEGs 的篩選采用GEO2R 對3 個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行處理分析后，從GSE25628 數(shù)據(jù)集中鑒定出1 182 個(gè)DEGs，其中726 個(gè)基因上調(diào)，456 個(gè)基因下調(diào)； 從GSE23339 數(shù)據(jù)集中鑒定到386 個(gè)DEGs，其中186 個(gè)基因上調(diào)，200 個(gè)基因下調(diào)；從GSE7305 數(shù)據(jù)集中鑒定出801 個(gè)DEGs，其中372 個(gè)基因上調(diào)，429 個(gè)基因下調(diào)。使用Venn 圖網(wǎng)絡(luò)工具將篩選出來的DEGs 進(jìn)行Venn 分析，結(jié)果顯示：在GSE25628、GSE23339 和GSE7305 數(shù)據(jù)集中同時(shí)存在的DEGs 共70 個(gè)，其中發(fā)生上調(diào)的基因有27 個(gè)，發(fā)生下調(diào)的基因有43 個(gè)（圖1）。

圖1 DEGs 的Venn 分析Fig.1 Venn analysis of DEGs

2.2 DEGs 的GO 富集和KEGG 通路分析使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對共同上調(diào)或下調(diào)的DEGs 進(jìn)行GO富集分析和KEGG 通路分析。GO 富集分析結(jié)果顯示：在生物學(xué)功能方面，DEGs 主要富集在傷口愈合、單個(gè)生物細(xì)胞-細(xì)胞黏附、腎臟發(fā)展、解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生、黏多糖代謝過程、細(xì)胞外基質(zhì)組織和細(xì)胞黏附等方面；在細(xì)胞成分上，DEGs 主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域和蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)等。見表1。KEGG 通路分析結(jié)果顯示： DEGs 富集于磷酸肌醇代謝通路中，包括PIP5K1B、 PLCH1 和PLCB1，P=0.042 693。

表1 DEGs 在GO 富集中的分布Tab.1 Distribution of DEGs in GO enrichment

2.3 DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心基因識別采用STRING 數(shù)據(jù)庫11.0 版本分析DEGs 之間的PPI 關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)共涉及70 個(gè)節(jié)點(diǎn)和312 個(gè)連接。利用cytoscape 對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化及分析（圖2），計(jì)算每個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的連接度，選擇具有最高連接度的10 個(gè)節(jié)點(diǎn)DEGs 作為EMS 的核心基因（表2），結(jié)果顯示：排名前10 位的核心基因分別為核心蛋白聚糖（decorin，DCN）、 上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）、雙鏈蛋白聚糖（biglycan，BGN）、 脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）、神經(jīng)酪氨酸激酶受體2（neurotyrosine kinase receptor，NTRK2）、磷脂酰肌醇聚糖3（glypican-3 ，GPC-3）、 表皮生長因子受體3 （epidermal growth factor receptor 3，ERBB3）、 分化抗原簇蛋白24（cluster of differentiationprotein 24，CD24）、 巢蛋白2 （nidogen-2，NID2） 和血小板反應(yīng)蛋白2（thrombospondin-2，THBS2）。

表2 連接度排名前10 位核心基因Tab.2 Top 20 core genes in connectivities

圖2 DEGs 的PPI 分析Fig.2 PPI analysis of DEGs

3 討 論

子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)） 出現(xiàn)在子宮體以外的部位時(shí)，稱為EMS，主要表現(xiàn)為下腹痛、痛經(jīng)、 不孕和性交不適，降低了患者的生活質(zhì)量。EMS 在某些方面類似于惡性腫瘤：呈漸進(jìn)性和浸潤性生長，有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移傾向。目前EMS 的病因仍不清楚，被廣泛接受的發(fā)生機(jī)制仍是逆行月經(jīng)學(xué)說。遺傳變異會增加EMS 的易感性，也有越來越多的指標(biāo)被鑒定出有希望成為EMS 早期診斷的生物標(biāo)志物，但尚無定論。

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，通過基因芯片數(shù)據(jù)研究疾病發(fā)病機(jī)制成為了研究熱點(diǎn)，也為研

究EMS 提供了新方法。本研究采用生物信息學(xué)方法分析從GEO 數(shù)據(jù)庫下載的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選EMS 病變組織與健康組織之間的DEGs，對篩選出的DEGs 進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路分析，最后通過建立PPI 網(wǎng)絡(luò)來識別與EMS 相關(guān)的核心基因。本研究共篩選出10 個(gè)EMS 的核心基因，包括DCN、 EPCAM、 BGN、 FABP4、 NTRK2、GPC3、 ERBB3、 CD24、 NID2 和THBS2，通過對比上述基因的GO 基因功能分析結(jié)果和KEGG 通路分析結(jié)果顯示： 有4 個(gè)基因（DCN、 BGN、NID2 和THBS2） 與細(xì)胞外基質(zhì)有密切關(guān)聯(lián)，在EMS 患者中的表達(dá)均下調(diào)，推測其可能通過異常的基質(zhì)重塑，參與異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生長、侵襲和黏附等過程，促進(jìn)EMS 的發(fā)展。細(xì)胞外基質(zhì)分子表達(dá)和降解的調(diào)控不僅對維持組織或器官的完整結(jié)構(gòu)起作用，而且對其正常功能的維持也起著至關(guān)重要的作用。EMS 的發(fā)展涉及多個(gè)步驟的基質(zhì)重塑過程，包括異常組織生長、侵襲和黏連形成等。EMS 相關(guān)的異?；|(zhì)重塑過程受多種因素的影響，包括蛋白水解酶及其抑制劑，通過調(diào)節(jié)生殖道的組織更新來維持子宮內(nèi)膜的完整性以及雌、孕激素水平，均直接影響月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜的生長和脫落。

DCN 是富含亮氨酸的小蛋白聚糖家族的一員，是一種基質(zhì)蛋白聚糖，可以調(diào)節(jié)膠原纖維形成和維持組織完整性［6］，在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)揮重要作用。DCN 基因在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，參與腫瘤進(jìn)展。近年來，已有多項(xiàng)研究將DCN 定為潛在預(yù)測生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)，如肺腺癌、腎細(xì)胞癌和大腸癌［7-9］等。大腸癌的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析同時(shí)顯示：DCN mRNA 低表達(dá)與miR200c 高表達(dá)有關(guān)，表明miR200c 可能是DCN 的一種內(nèi)源性抑制劑［10-11］，而miR200 已在2015 年被鑒定為EMS 中有診斷價(jià)值的生物標(biāo)記物。但DCN 在EMS 中作用的研究還較少。DCN 可能通過誘導(dǎo)異位內(nèi)膜組織中p21 的合成來誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，從而對人子宮內(nèi)膜異位上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞具有明顯的抑制增殖作用，且孕酮誘導(dǎo)的DCN 表達(dá)在抑制EMS 發(fā)生中起重要的作用［12］。近期有研究［13］顯示：EMS 患者的顆粒細(xì)胞（壁細(xì)胞） 中DCN mRNA 表達(dá)水平異常降低，但目前尚不清楚DCN 是否也參與了EMS 的病理生理過程。

BGN 與DCN 具有結(jié)構(gòu)相似性，是一種富含亮氨酸的蛋白聚糖。BGN 在腫瘤細(xì)胞間質(zhì)中的上調(diào)與細(xì)胞增殖、 細(xì)胞遷移、 轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān)［14-16］。BGN 過表達(dá)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的侵襲性和遷移性［17］。研究［18］顯示：采用蛋白質(zhì)印跡和ELISA 法分別測定卵巢EMS 患者血清和腹腔液中BGN 水平，腹腔液中BGN 水平與良性囊腫患者和健康女性對照組比較明顯升高，但血清中BGN 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2011 年，一項(xiàng)尋找卵巢EMS 潛在生物標(biāo)志物的研究［19］已將BGN 預(yù)測為潛在的生物標(biāo)志物，并提出編碼分泌蛋白或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基因，可能代表了一系列潛在的卵巢EMS 診斷和治療的生物標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)，但仍需更進(jìn)一步研究來明確。

NID2 是一種巢蛋白（nidogen） 家族蛋白，與細(xì)胞外基質(zhì)中的層黏連蛋白和膠原蛋白協(xié)同發(fā)揮平衡基底膜完整性和穩(wěn)定性的作用［20-21］。NID2 高甲基化與癌癥的發(fā)生有關(guān)，在幾種癌癥中NID2 表達(dá)下調(diào)，提示NID2 具有抑癌活性［22-23］。NID2 的缺失有助于癌癥的發(fā)展，由于細(xì)胞間相互作用減弱，可能會刺激轉(zhuǎn)移和侵襲［24-25］。研究［26-27］顯示：NID 可作為診斷卵巢癌和肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)記物。EMS與部分卵巢透明細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜樣癌和子宮內(nèi)膜癌的形成有關(guān)［28］，但其惡變機(jī)制至今尚未明確。

THBS2 是凝血酶原蛋白家族中的一員。通常被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生過程中血管生成的內(nèi)源性負(fù)性調(diào)節(jié)因子［29］。THBS2 是基質(zhì)細(xì)胞鈣離子（Ca2+） 結(jié)合糖蛋白家族的成員，已觀察到其可與多種細(xì)胞受體、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相互作用，從而影響細(xì)胞黏附、 增殖和凋亡功能［30-31］。據(jù)報(bào)道，THBS2 可以分別通過基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs） 中 的 MMP-2、MMP-9 和MMP-3 促進(jìn)不同腫瘤的發(fā)展［32-34］。而在異位子宮內(nèi)膜中MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)均高于無EMS 患者［35］。病例對照研究顯示：MMP3 基因多態(tài)性與患EMS 的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)關(guān)系，因此與MMPs 有密切關(guān)聯(lián)的THBS2 有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，DCN、BGN、NID2 和THBS2 基因是參與EMS 發(fā)生進(jìn)展過程的核心基因，可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)參與EMS 的發(fā)生發(fā)展。異常基質(zhì)重塑與EMS 的發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，了解參與子宮內(nèi)膜基質(zhì)重塑的基因及其調(diào)節(jié)因子，可能有助于闡明EMS 的病因，并進(jìn)一步改善EMS 診斷、治療和預(yù)后判斷的方法。經(jīng)后續(xù)大量樣本檢測驗(yàn)證，上述基因有望成為預(yù)測EMS 發(fā)生的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。