SOCS3 在彌漫大B 細胞淋巴瘤患者外周血單個核細胞中的表達及其對OCI-LY7 細胞自噬和凋亡的影響

孫文雄, 李 蒲

（南昌大學第一附屬醫(yī)院國家藥物臨床試驗機構(gòu)血液科，江西 南昌 330006）

彌漫大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL） 是最常見的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），約占每年NHL新發(fā)病例的24%［1］。DLBCL 具有侵襲性，患者通常表現(xiàn)為淋巴結(jié)迅速腫大和全身癥狀，需要立即治療［2］。雖然大多數(shù)患者表現(xiàn)為淋巴結(jié)病，但結(jié)外病變的發(fā)生率較高。最常見的前期治療是R-CHOP化療（利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松），可治愈50%～60% 的患者［3］。但對于在前期治療中難以治愈的或緩解后復發(fā)的患者，預后較差，采用利妥昔單抗治療后，只有少數(shù)患者獲得了長期緩解［4］。信號傳導抑制因子3（suppressors of cytokine signaling 3，SOCS3） 是信號傳導抑制因子（suppressors of cytokine signaling，SOCS） 家族的成員之一，作為重要的腫瘤抑制因子，SOCS3 的表達或功能受損在各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用［5-6］。研究［7］顯示：SOCS3 的異常表達或功能異常在胰腺癌的調(diào)控、進展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。此外還有研究［8］顯示：SOCS3 通過調(diào)節(jié)Janus 激酶（Janus kinase，JAK） /信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT） 信號通路介導的細胞炎癥反應，對細菌性炎癥疾病和動脈粥樣硬化的治療有重要意義。但SOCS3 在DLBCL 中作用的研究較少且機制尚不明確。因此，本研究通過檢測SOCS3 在DLBCL 患者外周血單個核細胞和DLBCL 細胞中的表達，同時觀察過表達SOCS3 對DLBCL 細胞增殖、 自噬和凋亡的影響，以期為DLBCL 的治療提供新的靶點和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人B 淋巴細胞和人DLBCL 細胞（OCI-LY7 細胞） 購自中國科學院上海細胞生物學研究所。人淋巴細胞分離液（上海博升生物科技有限公司），RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血 清（ 美 國Gibco 公 司），pcDNA3.1-NC 和pcDNA3.1-SOCS3 （上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），LipofectamineTM3000 （美國Invitrogen 公司），5-溴-2-脫氧尿嘧啶（5-bromo-2-deoxyuracil，EDU）試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（美國Abcam 公司），HEPES 緩沖液（美國Thermo Fisher 公司），TRIzol 試劑、RIPA 裂解液和BCA 試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司），PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒和TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試 劑 盒（ 日 本TaKaRa 公司），SOCS3、 微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、 Janus 激酶2 （Janus kinase 2，JAK2）、 磷酸化JAK2 （p-JAK2）、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、磷酸化STAT3 （p-STAT3）、GAPDH和IgG-HRP 抗體（美國Cell Signaling Technology公司），Alexa Fluor 488 標記羊抗兔IgG （H+L）二抗（美國Thermo 公司）。徠卡DM750 顯微鏡（德國徠卡公司），流式細胞儀（美國BD 公司）。

1.2 標本來源選取2018 年6 月—2020 年1 月于南昌大學第一附屬醫(yī)院就診的DLBCL 患者100 例作為研究對象，其中男性54 例，女性46 例，患者平均年齡（55.2±6.43） 歲；生發(fā)中心B 細胞樣型53 例，非生發(fā)中心B 細胞樣型47 例。同時選取50 名健康志愿者為對照組，性別構(gòu)成和平均年齡與DLBCL 患者具有可比性。受試者均簽署知情同意書，研究方案獲得南昌大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準。采集所有DLBCL 患者和健康志愿者的外周靜脈血，利用淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞，加入TRIzol 溶液1 mL，－80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞培養(yǎng)和分組人B 淋巴細胞和OCI-LY7細胞用含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d 更換1 次培養(yǎng)基。OCI-LY7 細胞分為pcDNA3.1-NC 組和pcDNA3.1-SOCS3 組，待細胞生長融合至60%時，按照LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，將pcDNA3.1-NC 或pcDNA3.1-SOCS3轉(zhuǎn)染至OCI-LY7 細胞中，最終轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol·L－1。轉(zhuǎn)染后在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后結(jié)束培養(yǎng)，收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測不同細胞中SOCS3 mRNA 表達水平TRIzol 試劑提取受試者外周血單個核細胞、人B 淋巴細胞、OCI-LY7 細胞和轉(zhuǎn)染組OCI-LY7 細胞總RNA。使用紫外分光光度計檢測總RNA。采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行RT-qPCR，步驟嚴格按試劑盒說明書完成。經(jīng)StepOnePlus 實時PCR 系統(tǒng)完成實驗后，采用2－△△Ct法計算SOCS3 mRNA 表達水平。SOCS3 引物：上游引物序列5′-CCTGCGCCTCAAGACCTTC-3′，下游引物序列5′-GTCACTGCGCTCCAGTAGAA-3′； GAPDH 引物： 上游引物序列5′-CATGTACGTTGCTATCCA-GGC-3′，下游引物序列5′-CTCCTTAATGTCA-CGCACGAT-3′。

1.5 EDU 實驗檢測2 組細胞中EDU 陽性細胞率OCI-LY7 細胞接種于24 孔板中，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長融合至60%時，按上述方法進行轉(zhuǎn)染分組。48 h 后，每孔中加入100 μL 含100 μmol·L－1EDU 的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，吸取培養(yǎng)基后，將細胞在4% 多聚甲醛溶液中固定15 min，PBS 緩沖液洗滌細胞2 次，在0.5%Triton X-100 溶液中孵育20 min，PBS 緩沖液洗滌細胞2 次，在黑暗中與Apollo 染色液孵育30 min，PBS 緩沖液洗滌細胞2 次，并用Hoechst 33342 染色30 min。PBS 緩沖液洗滌細胞2 次，在熒光顯微鏡下觀察，隨機選擇5 個視野，記錄在該范圍內(nèi)染成紅色的陽性細胞數(shù)，計算EDU 陽性細胞率，代表細胞增殖能力。

1.6 細胞免疫熒光染色檢測2 組細胞中LC3 陽性細胞率將OCI-LY7 細胞按照1×105/孔的密度接種于24 孔細胞培養(yǎng)板，每孔置有細胞爬片，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC 和pcDNA3.1-SOCS3 質(zhì)粒48 h 后，將細胞培養(yǎng)基吸走，PBS 緩沖液洗3 次，每次5 min；4% 多聚甲醛固定細胞15 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min； 破膜液（PBS 緩沖液+0.2% Triton X-100） 室溫處理細胞30 min，封閉液（PBS 緩沖液+0.2% Triton X-100+10% 驢血清） 室溫處理細胞1 h，LC3 一抗（1∶500） 4℃孵育過夜；次日，回收一抗，細胞用PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min； 室溫避光孵育熒光二抗（IgG，1∶1 000） 1 h，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。最后用含有熒光淬滅劑的封片劑封片。在熒光顯微鏡下隨機選取10 個視野，計數(shù)綠色的LC3 陽性細胞數(shù)并計算LC3 陽性細胞率，以LC3陽性細胞率代表細胞自噬水平。

1.7 流式細胞術(shù)檢測2 組細胞凋亡率和不同細胞周期細胞百分率OCI-LY7 細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，用冷PBS 緩沖液洗滌3 次，1 000 g 離心5 min 棄去上清液。檢測細胞凋亡率時將HEPES 緩沖液、Annexin-Ⅴ/FITC 溶液和PI 溶液（50∶1∶2） 混合，使細胞在室溫黑暗環(huán)境下用混合溶液染色15 min，然后用1 mL HEPES 緩沖液處理，震蕩混勻后，利用流式細胞儀在激發(fā)光波長為488 nm 處檢測細胞凋亡率。檢測不同細胞周期細胞百分率時先用PBS 緩沖液將細胞密度調(diào)整為1×105mL－1，然后將懸浮液依次用1 mL 預冷的75% 乙醇處理1 h，1 000 g 離心5 min 棄上清，PBS 緩沖液洗滌3 次，100 μL RNase A 處理，在37 ℃黑暗環(huán)境下孵育3 min，在4 ℃條件下用400 μ L PI 染色30 min，再利用流式細胞儀在激發(fā)光波長為488 nm處檢測不同細胞周期細胞百分率。

1.8 Western blotting 法檢測2 組細胞中SOCS3、LC3 Ⅱ、LC3 Ⅰ、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表達水平OCI-LY7 細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，RIPA 裂解液裂解細胞，收集總蛋白，通過BCA 法測定總蛋白含量，并將配對的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。樣品經(jīng)變性后，10% SDS-PAGE 電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。室溫下，PVDF 膜在5% 脫脂奶粉中封閉1 h，在4 ℃條件下與SOCS3 抗體（1 ∶1 000）、 LC3 抗體（1 ∶1 000）、p-JAK2 抗體（1∶1 000）、 JAK2 抗體（1∶1 000）、 p-STAT3 抗 體（1∶1 000）、STAT3 抗 體（1 ∶1 000） 和GAPDH 抗 體（1 ∶2 000） 孵育過夜。PVDF 膜在TBST 中洗滌3 次，并與IgG-HRP 抗體（1∶4 000） 在室溫下孵育1 h。PVDF 膜在TBST 中洗滌3 次，顯影曝光，采用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶的灰度值進行分析。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值。計算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，以LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值代表細胞自噬水平；p-JAK2 蛋白表達水平以p-JAK2 與JAK2 比值表示，p-STAT3 蛋白表達水平以p-STAT3 與STAT3 比值表示。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。細胞中SOCS3 mRNA 表達水平、EDU 陽性細胞率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、LC3 陽性細胞數(shù)、細胞凋亡率、不同細胞周期細胞百分率和細胞中JAK2/STAT3 信號通路蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以xˉ±s表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 2 組受試者外周血單個核細胞、人B 淋巴細胞和OCI-LY7 細胞中SOCS3 mRNA 表達水平與對照組（1.15±0.18） 比較，DLBCL 組患者外周血單個核細胞中SOCS3 mRNA 表達水平（0.52±0.23） 明顯降低（P＜0.01）； 與人B 淋巴細胞（1.09±0.12） 比較，OCI-LY7 細胞中SOCS3 mRNA 表達水平（0.63±0.25）明顯降低（P＜0.01）。

2.2 2 組細胞中SOCS3 mRNA 和蛋白表達水平與 pcDNA3.1-NC 組（1.05±0.05） 比較，pcDNA3.1-SOCS3 組細胞中SOCS3 mRNA 表達水平（1.56±0.21）明顯升高（P＜0.01）； 與pcDNA3.1-NC組（0.08±0.03） 比較，pcDNA3.1-SOCS3 組細胞中SOCS3 蛋白表達水平（0.45±0.09） 明顯升高（P＜0.01）。見圖1。

圖1 2 組細胞中SOCS3 蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of SOCS3 protein in cells in two groups

2.3 2 組細胞中EDU 陽性細胞率與pcDNA3.1-NC組（35%±2%） 比較，pcDNA3.1-SOCS3 組細胞中EDU 陽性細胞率（8%±3%） 明顯降低（P＜0.01）。見圖2。

圖2 2 組細胞EDU 染色結(jié)果（Bar=50 μm）Fig.2 Results of EDU staining of cells in two groups（Bar=50 μm）

2.4 2 組細胞中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值和LC3 陽性細胞率與pcDNA3.1-NC 組（2.23±0.21）比較，pcDNA3.1-SOCS3 組 OCI-LY7 細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（0.97±0.25） 明顯降低（P＜0.01）。與pcDNA3.1-NC 組（36%±3%） 比較，pcDNA3.1-SOCS3 組細胞中LC3 陽性細胞率（18%±2%） 明顯降低（P＜0.01）。見圖3 和4。

圖3 2 組細胞中LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of LC3 Ⅰand LC3Ⅱproteins in cells in two groups

2.5 2 組細胞凋亡率和不同細胞周期細胞百分率與pcDNA3.1-NC 組（9.23%±2.54%）比較，pcDNA3.1-SOCS3 組OCI-LY7 細胞凋亡率（32.89%±2.21%） 明顯升高（P＜0.01）。見圖5。與pcDNA3.1-NC 組（G0/G1期40.32%±3.45%、S 期45.94%±2.87% 和G2/M 期14.75%±2.28%） 比較，pcDNA3.1-SOCS3 組細胞中G0/G1期細胞百分率（69.18%±2.54%） 明顯升高（P＜0.01），S 期細胞百分率（15.35%±2.68%）明顯降低（P＜0.01），而G2/M 期細胞百分 率（15.26%±2.48%） 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖6。

圖5 流式細胞術(shù)檢測2 組細胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rates of cells in two groups detected with flow cytometry

圖6 2 組不同細胞周期細胞百分率Fig.6 Percentages of cells at different cell cycles in two groups

2.6 2 組細胞中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表達水平與pcDNA3.1-NC 組（0.72±0.12 和0.72±0.12） 比較，pcDNA3.1-SOCS3 組細胞中p-JAK2和p-STAT3 蛋白表達水平（0.21±0.08 和0.22±0.06） 明顯降低（P＜0.01）。見圖7。

圖7 2 組細胞中JAK2/STAT3 信號通路相關(guān)蛋白表達電泳圖Fig.7 Electrophoregram of expressions of JAK2/STAT3 signaling pathway related proteins in cells in two groups

3 討 論

DLBCL 是高度異質(zhì)性的惡性淋巴瘤，是NHL最常見的組織學亞型［9］。DLBCL 最常發(fā)生于60～70 歲老年人，在兒童中也可以看到［10］。對于晚期DLBCL 患者，使用環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松的化學療法是最佳治療選擇，但有30%～40% 的患者會復發(fā)［11-13］。因此，為更好地了解DLBCL 的發(fā)生發(fā)展和改善DLBCL 患者的預后，確定新的分子靶標具有重要意義。

圖4 2 組細胞LC3 免疫熒光染色結(jié)果（×400）Fig.4 Results of LC3 immunofluorescence staining in cells in two groups (×400)

SOCS3 是SOCS 家族的重要成員，是細胞因子和生長因子相關(guān)信號通路中的負調(diào)控蛋白，在JAK/STAT 信號通路中充當負調(diào)節(jié)劑，可防止腫瘤細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并促進腫瘤細胞凋亡［14］。因此，SOCS3 的激活和過表達在腫瘤生長中具有潛在作用［15］。SOCS3 作為腫瘤抑制基因，其異常表達在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后中發(fā)揮著重要的作用。CHU 等［16］ 研究發(fā)現(xiàn)：SOCS3 在結(jié)直腸癌組織中表達下調(diào)，而過表達SOCS3 的可抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和致瘤能力，同時增加細胞凋亡率，且SOCS3 高表達的患者通常預后相對較好。但SOCS3 對DLBCL 作用的研究甚少且作用機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示：SOCS3 在DLBCL 患者外周血單個核細胞和OCI-LY7 細胞中低表達；通過在OCI-LY7 細胞中過表達SOCS3，OCI-LY7 細胞增殖能力降低，表明過表達SOCS3 可抑制OCI-LY7 細胞的增殖能力。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和癌癥化療期間經(jīng)常發(fā)生。自噬是一個連續(xù)的過程，其主要吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，借此實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新［17］。研究［18-19］表明：下調(diào)LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ比值可抑制細胞自噬，進而抑制結(jié)腸癌、卵巢癌等腫瘤細胞的增殖和侵襲，進一步影響相關(guān)疾病的進展。本研究結(jié)果顯示：過表達SOCS3 能明顯下調(diào)OCI-LY7 細胞中LC3 Ⅱ/ LC3Ⅰ比值，同時降低OCI-LY7 細胞中LC3 陽性細胞率，表明過表達SOCS3 可抑制OCI-LY7 細胞的自噬能力。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是被動的過程，而是主動過程，涉及一系列基因的激活、 表達和調(diào)控等作用［20］。研究［21-22］表明： 抑制膀胱癌和乳腺癌細胞增殖，觸發(fā)細胞周期停滯和細胞凋亡，可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示： 過表達SOCS3 能誘導OCI-LY7 細胞凋亡，增加G0/G1期細胞百分率，減少S 期細胞百分率，因此過表達SOCS3 可促進OCI-LY7 細胞凋亡。

JAK/STAT 信號通路是一種在哺乳動物的各種組織和細胞中發(fā)揮重要作用的信號通路，參與調(diào)節(jié)細胞存活、增殖、遷移和侵襲等多種生物學過程［23］。SOCS3 是JAK/STAT 信號通路的關(guān)鍵負反饋調(diào)節(jié)劑［24］。LI 等［25］研究表明：在非小細胞肺癌組織中SOCS3 表達水平降低，上調(diào)SOCS3 表達水平可通過抑制JAK/STAT3 信號通路來降低人肺癌A549 細胞凋亡率，進而對肺癌進展有一定延緩作用。本研究結(jié)果顯示： 過表達SOCS3 可抑制JAK2/STAT3 信號通路的激活，但其是否與凋亡和自噬相關(guān)尚有待進一步研究。

綜上所述，SOCS3 在DLBCL 患者外周血單個核細胞和OCI-LY7 細胞中低表達。過表達SOCS3可以抑制OCI-LY7 細胞的增殖和自噬，并促進OCI-LY7 細胞凋亡，抑制JAK2/STAT3 信號通路的激活。因此，SOCS3 具有作為DLBCL 診斷生物標志物的潛在價值，也可能是DLBCL 治療的潛在靶標。