MMP-9 和TIMP-1 表達(dá)在胃癌根治術(shù)后患者預(yù)后評(píng)估中的作用

覃麗粒, 馬小波, 趙天業(yè), 陶雪蓉, 鄭 敏, 王雪瑩, 易嘉欣, 吳燕華, 姜 晶

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院臨床研究部，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理科，吉林 長春 130021）

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)生率和死亡率均較高，患者就診時(shí)多處于晚期，預(yù)后不佳，已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。尋找有效的胃癌預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物，對(duì)胃癌的精準(zhǔn)治療、延長患者生存時(shí)間和提高患者生存質(zhì)量具有重要意義。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良和死亡的主要原因，而細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM） 降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，該過程依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinases，MMPs） 和組織金屬蛋白酶抑制 劑 （tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs） 的調(diào)控［1］。其中，MMP-9 和TIMP-1 被認(rèn)為是MMPs 和TIMPs 家族中最關(guān)鍵的蛋白酶，二者的蛋白表達(dá)變化和平衡在腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮重要作用，但其作用方式和作用結(jié)果尚無統(tǒng)一結(jié)論。MMP-9 是ECM 降解的關(guān)鍵蛋白酶，近年來研究［2-7］顯示：MMP-9 具有非蛋白酶依賴活性，能介導(dǎo)宿主免疫防御反應(yīng)，并激活細(xì)胞因子，調(diào)控關(guān)鍵的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且MMP-9 在不同臨床分期腫瘤中的調(diào)控作用具有異質(zhì)性。TIMP-1 作為MMP-9 特異性的內(nèi)源性抑制劑，不但能抑制MMP-9 的基質(zhì)降解活性，還能激活細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子α （transforming growth factor- α，TGF- α）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、 細(xì)胞黏附分子（cell adhesion molecule，CAM） 和結(jié)合細(xì)胞表面蛋白CD63，激活黏著斑激酶-磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B （focal adhesion kinase-phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，F(xiàn)AK-PI3K/AKT） 信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖失控和播散生長［8］。已有研究［9-11］證實(shí)：MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)平衡隨腫瘤進(jìn)展而變化，兩者的聯(lián)合表達(dá)較單獨(dú)的MMPs 或TIMPs 的變化意義更大，但其與胃癌的相關(guān)研究較少，尚缺乏人群驗(yàn)證。本研究擬利用胃癌患者生存隊(duì)列，采用免疫組織化學(xué)方法檢測胃癌患者癌組織中MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)情況，探討MMP-9 和TIMP-1 聯(lián)合表達(dá)在胃癌患者生存中的預(yù)測價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象本研究中選擇2008—2018 年于吉林大學(xué)第一醫(yī)院胃結(jié)直腸外科進(jìn)行胃癌根治術(shù)且病理診斷確診為胃癌的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首發(fā)腫瘤為胃癌，并接受胃癌切除術(shù)；②手術(shù)切緣陰性且無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；③簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①第一次隨訪即失訪；②死于圍手術(shù)期并發(fā)癥；③術(shù)前行放療和化療；④未明確浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期等基本臨床病理特征；⑤確診為其他癌癥的患者。本研究最終納入270 例胃癌患者，此方案通過了吉林大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批（審批號(hào)：2018-189）。

1.2 臨床資料包括一般人口學(xué)資料（患者性別和年齡） 和臨床資料［疾病診斷、手術(shù)日期、腫瘤類型、腫瘤大小、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、腫瘤臨床分期（TNM 分期）、術(shù)后化療及其他治療方案等信息］。TNM 分期按照國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC/UICC） 聯(lián)合制定的TNM 分期系統(tǒng)第8 版進(jìn)行劃分。

1.3 隨訪 隨訪員于患者術(shù)后第1、3、6 個(gè)月和之后每年1 次對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行隨訪。隨訪內(nèi)容包括： 患者術(shù)后及出院后的治療情況和預(yù)后情況（復(fù)發(fā)、進(jìn)展和死亡），若死亡需記錄死因及死亡日期，若失訪需定期到公安局人口管理系統(tǒng)查詢核實(shí)，并記錄患者生存狀況、死亡原因和死亡時(shí)間。隨訪時(shí)間自患者接受治療之日起，截止到2018 年8 月，中位隨訪時(shí)間為65.77 個(gè)月，隨訪時(shí)間最長為100.17 個(gè)月。隨訪期間患者共死亡160 例，健在99 例，失訪11 例，失訪率為4.10%。生存時(shí)間定義為患者自接受手術(shù)之日起直至患者死亡的時(shí)間（若死亡），或到末次隨訪時(shí)間（若存活），或到上一次隨訪時(shí)間（若失訪）。

1.4 試劑、主要儀器和設(shè)備兔抗MMP-9 （貨號(hào)：ab76003，濃度1∶150） 和TIMP-1 （貨號(hào)：ab211926，濃度1∶150） 單克隆抗體（英國Abcam公司），乙二胺四乙酸（EDTA）、PBS 緩沖液、動(dòng)物非免疫血清（羊） 和二氨基聯(lián)苯胺（DAB） 顯色試劑盒（福州邁新試劑生物技術(shù)有限公司），中性甲醛（長春賽默瑞特科技有限公司），石蠟（上海器械廠華靈康復(fù)有限公司），乙醇和二甲苯（北京化工廠），中性樹脂封片劑（中國上海標(biāo)本模型廠）。移液器（德國Eppendorf 公司），電磁爐（中國美的集團(tuán)），切片機(jī)（德國萊卡公司），烘箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），顯微鏡（日本奧林巴斯公司），冰箱（中國海爾集團(tuán)）。

1.5 樣本采集于患者胃癌根治術(shù)中留取腫瘤黏膜組織2～3 塊，在離體30 min 內(nèi)液氮速凍。樣本于－80 ℃冰箱儲(chǔ)存，同時(shí)制作保留石蠟包埋的癌組織切片，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.6 免疫組織化學(xué)染色分別采用MMP-9 和TIMP-1 單克隆抗體對(duì)胃癌石蠟組織包埋病理切片進(jìn)行染色。切片置于65 ℃烘箱中烘烤20 min；常規(guī)脫蠟，梯度水化，EDTA 修復(fù)液高溫抗原修復(fù)20 min，冷卻后PBS 緩沖液潤洗3 次，每次5 min；滴加內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑，濕盒室溫孵育10 min；PBS 緩沖液潤洗3 次后，滴加封閉液，濕盒室溫孵育15 min；滴加稀釋后的一抗，每張切片約60 μL，濕盒室溫孵育1.5 h； PBS 緩沖液潤洗3 次，各5 min； 滴加HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體，濕盒室溫孵育25 min；PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min；DAB 顯色，蘇木精復(fù)染1 min，梯度乙醇反向脫水，每次1 min ，二甲苯浸泡2 次，每次2 min，最后中性樹脂封片后用顯微鏡進(jìn)行觀察。由2 位病理醫(yī)生獨(dú)立對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，當(dāng)結(jié)果不一致時(shí)，由第3 位病理醫(yī)生進(jìn)行裁定。腫瘤細(xì)胞中MMP-9 和TIMP-1 表達(dá)部位為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿，當(dāng)呈現(xiàn)棕黃色染色時(shí)，計(jì)為MMP-9 或TIMP-1 陽性表達(dá)，不染色則計(jì)為陰性表達(dá)。當(dāng)聯(lián)合分析時(shí)，根據(jù)MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)情況，可分為MMP-9－/TIMP-1－、 MMP-9+/TIMP-1－、MMP-9－/TIMP-1+和MMP-9+/TIMP-1+。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用STATA12.0 統(tǒng)計(jì)軟件繪制森林圖。計(jì)數(shù)資料（患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤類型、組織學(xué)分級(jí)、術(shù)后化療、TNM 分期、結(jié)局、MMP-9 陽性表達(dá)率、 TIMP-1 陽性表達(dá)率和MMP-9/TIMP-1 表達(dá)情況） 以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法； 采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，Log-rank 檢驗(yàn)比較生存曲線的差異；采用多因素Cox 回歸模型計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HRs） 及其95% 置信區(qū)間（95%CI），分析影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者的一般特征本研究納入270 例胃癌患者，其中年齡＞65 歲108 例（40.0%），男性205 例（75.9%），腫瘤直徑≥5 cm 患者188 例（69.6%），非印戒細(xì)胞型胃癌240 例（88.9%），組織學(xué)分級(jí)為高級(jí)別胃癌213 例（78.9%），術(shù)后未進(jìn)行規(guī)范化療者152 例（56.3%），TNM 分期Ⅲ期胃癌105 例（38.9%）。隨訪期間，99 例（36.7%） 患者仍然存活，11 例（4.1%） 患者失訪，160 例（59.2%） 患者死亡，MMP-9 蛋白陽性表達(dá)率為30.4%，TIMP-1 蛋白陽性表達(dá)率為26.3%。見表1。

表1 胃癌患者的一般特征Tab.1 Baseline characteristics of gastric cancer patients

2.2 不同臨床病理特征胃癌患者癌組織中MMP-9/TIMP-1 蛋白表達(dá)分布情況MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)在不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤類型、組織學(xué)分級(jí)、化療和TNM 分期的胃癌患者中分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征胃癌患者癌組織中MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)分布情況Tab.2 Distributions of MMP-9 and TIMP-1 expressions in cancer tissue of gastric cancer patients with different clinicopathological parameters [n（η/%）］

2.3 胃癌患者預(yù)后的單因素分析MMP-9+組胃癌患者的中位生存時(shí)間較MMP-9－組患者長（Log-rankP=0.044），MMP-9+/TIMP-1+組 與MMP-9+/TIMP-1－組胃癌患者生存時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但MMP-9－組胃癌患者中位生存時(shí)間短，均表現(xiàn)出不良預(yù)后，因此本研究將MMP-9+/TIMP-1+和MMP-9+/TIMP-1－2 組曲線進(jìn)行合并，著重探討MMP-9+組、 MMP-9－/TIMP-1－組和MMP-9－/TIMP-1+組胃癌患者的預(yù)后情況，結(jié)果顯示：MMP-9－/TIMP-1+組胃癌患者的中位生存時(shí)間最短，預(yù)后最差（Log-rankP=0.044）。見圖1。組織學(xué)分級(jí)為高級(jí)別、術(shù)后未接受化療和TNM 分期為Ⅲ期的胃癌患者中位生存時(shí)間明顯縮短，預(yù)后更差（Log-rankP=0.007，Log-rankP＜0.01，Log-rankP＜0.001）。年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤類型與胃癌患者預(yù)后無關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。見表3。

表3 胃癌患者預(yù)后的單因素Cox 回歸分析Tab.3 Univariate Cox regression analysis on prognosis of gastric cancer patients [n（η/%）］

圖1 不同MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)胃癌患者的生存曲線Fig.1 Survival curves of gastric cancer patients with different expressions of to MMP-9 and TIMP-1 proteins

2.4 胃癌患者預(yù)后的多因素分析以患者生存狀態(tài)為應(yīng)變量（刪失=0，死亡=1），以MMP-9/TIMP-1 蛋白表達(dá)（MMP-9－/TIMP-1+=1，MMP-9－/TIMP-1－=2，MMP-9+/TIMP-1+/－=3）、年齡（≤65=0，＞65=1）、 性別（女=0 ，男=1）、腫瘤大?。ǎ? cm=0，≥5 cm=1）、腫瘤類型（非印戒細(xì)胞癌=0，印戒細(xì)胞癌=1）、組織學(xué)分級(jí)（低級(jí)別=0，高級(jí)別=1）、 術(shù)后化療（化療=0，未化療=1） 和TNM 分期（Ⅰ/Ⅱ期=0，Ⅲ期=1） 為自變量納入多因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示：MMP-9+與胃癌患者的良好預(yù)后相關(guān)；MMP-9－胃癌患者中，TIMP-1+患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯 提 高，預(yù) 后 更 差（MMP-9+/TIMP-1+/－vsMMP-9－/TIMP-1+：HR=0.537，95%CI：0.338～0.851，P=0.008）。術(shù)后未進(jìn)行化療和較高的TNM 分期始終是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=1.873，95%CI：1.334～2.631，P＜0.001；HR=2.301，95%CI：1.656～3.197，P＜0.001）。見表4。

表4 胃癌患者預(yù)后的多因素Cox 回歸分析Tab.4 Multivariate Cox regression analysis on prognosis of gastric cancer patients

2.5 MMP-9+和MMP-9－/TIMP-1+表達(dá)在胃癌患者預(yù)后評(píng)估中的亞組分析為了準(zhǔn)確評(píng)估在不同化療情況、 不同TNM 分期和不同類型胃癌患者中MMP-9+和MMP-9－/TIMP-1+表達(dá)的預(yù)后評(píng)估價(jià)值，本研究進(jìn)行了亞組分析，結(jié)果顯示：與TNM分期為Ⅲ期、未接受術(shù)后化療和印戒細(xì)胞型的胃癌患者比較，MMP-9/TIMP-1 聯(lián)合表達(dá)對(duì)TNM 分期為Ⅰ/Ⅱ期、接受術(shù)后化療和非印戒細(xì)胞型的患者預(yù)后評(píng)估價(jià)值更大，其中MMP-9+組患者的預(yù)后優(yōu)于MMP-9－/TIMP-1+組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 MMP-9 聯(lián)合TIMP-1 表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Relationship between expressions of MMP-9 and TIMP-1 and prognosis of gastric cancer patients

3 討 論

本研究利用胃癌生存隊(duì)列，評(píng)估了MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)對(duì)胃癌患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值，以期為開展胃癌的精準(zhǔn)治療、延長患者生存時(shí)間和提高患者生存質(zhì)量提供依據(jù)。

既往研究［1，12］結(jié)果顯示： MMP-9 能降解ECM 和基底膜，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為腫瘤不良預(yù)后的預(yù)測標(biāo)志物。近年來研究［2，13-16］顯示：MMP-9 還具有非蛋白酶依賴性活性，能在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，其陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌等的良好預(yù)后有關(guān)聯(lián)，與本研究結(jié)果一致。一方面，MMP-9 可以促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤的免疫應(yīng)答［17］，同時(shí)激活A(yù)MP 依賴的蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK），調(diào)控Toll 樣受體4 （Toll-like receptors 4，TLR4） 與脂多糖的結(jié)合，介導(dǎo)機(jī)體的天然免疫反應(yīng)［18］；另一方面，MMP-9 還可以激活細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮抑素、腫瘤抑素和腫瘤壞死因子α 等，抑制腫瘤血管生成［19］，并激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［3，20-22］，抑制癌細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯和DNA 損傷。因此，MMP-9 在胃癌中可能更多地發(fā)揮了免疫調(diào)控和抗血管生成的作用，進(jìn)而影響胃癌患者的預(yù)后。

本研究結(jié)果顯示：MMP-9+胃癌患者的預(yù)后較好，MMP-9－胃癌患者中，TIMP-1+患者的預(yù)后最差。TIMP-1 作為MMP-9 特異性的內(nèi)源性抑制劑，與其按照1∶1 的比例結(jié)合，進(jìn)而參與一個(gè)涉及多細(xì)胞因子、多信號(hào)通路的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展［23］。既往研究［9-11］顯示： MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)平衡隨腫瘤的進(jìn)展而變化，二者的聯(lián)合表達(dá)較單獨(dú)的MMPs 或TIMPs 的變化意義更大。在非侵襲性的腫瘤早期，腫瘤細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞［24］分泌的MMP-9 表達(dá)水平較低，尚不足以誘導(dǎo)TIMP-1 分泌，該階段以MMP-9 陽性表達(dá)為主要表現(xiàn)［9，25］，MMP-9 能介導(dǎo)宿主免疫防御反應(yīng)［2，16］，同時(shí)激活抗血管生成因子，發(fā)揮抑癌作用［26-27］。當(dāng)MMP-9 分泌增多，腫瘤細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞就會(huì)誘導(dǎo)TIMP-1 分泌來調(diào)節(jié)蛋白酶反應(yīng)，二者的表達(dá)量均呈現(xiàn)較高趨勢［25］。隨著腫瘤的進(jìn)一步進(jìn)展，MMP-9 可能被高水平的TIMP-1 所抑制，該階段以TIMP-1 陽性表達(dá)為主要表現(xiàn)［9］，高水平的TIMP-1 能激活TGF-α/β、 VEGF 和CAM，結(jié)合細(xì)胞表面蛋白CD63，激活FAK-PI3K/AKT 和MAPK 信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖失控和播散生長［8，28］。

本研究中亞組分析結(jié)果也顯示：對(duì)于TNM 分期為Ⅰ/Ⅱ期的胃癌患者，MMP-9+對(duì)預(yù)后的預(yù)測價(jià)值更大；對(duì)于接受術(shù)后化療的胃癌患者，在腫瘤負(fù)荷降低或免疫狀態(tài)改變后，MMP-9+可作為患者良好預(yù)后的預(yù)測標(biāo)志物。在其他類型腫瘤中，MMP-9 對(duì)不同分期的腫瘤患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值可能不同［6，29］，在早期直腸癌和乳腺癌中，MMP-9+與患者的良好預(yù)后有關(guān)聯(lián)［14-15］，但在進(jìn)展期直腸癌中，則是患者不良預(yù)后的預(yù)測標(biāo)志物［30］。上述研究結(jié)果均提示：MMP-9 的動(dòng)態(tài)變化及其與TIMP-1的動(dòng)態(tài)平衡，可能在胃癌進(jìn)展的不同階段發(fā)揮不同作用。目前，MMP-9 抑制劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但效果并不理想。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究的研究對(duì)象缺少TNM 分期為Ⅳ期或不能進(jìn)行根治術(shù)的胃癌患者，因此MMP-9 和TIMP-1 聯(lián)合表達(dá)對(duì)晚期胃癌患者預(yù)后的預(yù)測作用尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。其次，當(dāng)聯(lián)合分析時(shí)，MMP-9+/TIMP-1+組、MMP-9+/TIMP-1－組和MMP-9－/TIMP-1+組的樣本量較小，未來需擴(kuò)大樣本量繼續(xù)進(jìn)行研究。最后，對(duì)腫瘤組織中MMP-9 和TIMP-1 的免疫組織化學(xué)染色法的評(píng)價(jià)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，未來需深入研究以建立標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)價(jià)方案。

綜上所述，MMP-9/TIMP-1 聯(lián)合表達(dá)可作為胃癌根治術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子，MMP-9+是胃癌患者預(yù)后良好的獨(dú)立影響因素，MMP-9－胃癌患者中，TIMP-1+患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)更高，預(yù)后更差。深入探討MMP-9 和TIMP-1 在胃癌組織中的表達(dá)模式和機(jī)制對(duì)實(shí)現(xiàn)胃癌患者的個(gè)體化預(yù)后評(píng)價(jià)和精準(zhǔn)治療具有重要價(jià)值。