LAG3 慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立

劉宇軒, 黃莉莉, 楊馥旭, 方楷漪, 胡楠楠, 穆業(yè)騰, 郭 沖, 夏 薇, 關(guān)新剛

（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥生物工程重點實驗室，吉林 吉林 132013）

淋巴細胞活化因子3 （lymphocyte activation gene 3，LAG3） 是一種屬于免疫球蛋白超家族的CD4 樣分子，在活化的T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等細胞上表達［1-2］。在腫瘤組織中，LAG3 在腫瘤浸潤淋巴細胞表面高表達［3-4］。LAG3 的主要配體為主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子（major histocompatibility complex Ⅱ，MHC Ⅱ）。腫瘤細胞表面表達的LAG3 配體分子與其結(jié)合，抑制T 淋巴細胞激活，發(fā)揮負向免疫調(diào)節(jié)功能［5-6］。WANG 等［7］研究顯示： 纖維蛋白樣蛋白1 （fibrinogen-like protein 1，F(xiàn)GL1） 是MHC Ⅱ之外的LAG3 的另一個配體。FGL1 在大多數(shù)正常組織中低表達，但是在多種腫瘤組織中呈高水平表達，且與治療和預(yù)后有密切關(guān)聯(lián)。正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)GL1 參與促進細胞分裂和代謝功能；腫瘤患者中阻斷FGL1-LAG3 信號通路可激活T 淋巴細胞免疫抗腫瘤反應(yīng)，揭示了一種新的免疫逃避機制。近年來，多項研究［8-10］顯示：LAG3 在多種腫瘤中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，包括結(jié)腸癌、非小細胞肺癌、胰腺癌和頭頸部細胞癌等。

隨著對癌癥免疫治療機制研究的逐漸深入，LAG3 有望成為繼程序性死亡受體1 （programmed cell death protein 1，PD-1） 和細胞毒性T 淋巴細胞抗原4 （cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4） 等免疫檢查點之后的新型免疫治療靶點。研究［11-12］顯示：LAG3 單克隆抗體可以通過結(jié)合LAG3 阻斷其與配體的相互作用，下調(diào)LAG3對免疫系統(tǒng)的抑制作用。目前已有包括Relatlimab、

RO7247669 和MGD013 在內(nèi)的多種LAG3 單克隆抗體、融合蛋白及雙特異性抗體進入Ⅰ期/Ⅱ期臨床試驗，其中已完成的Relatlimab （LAG3 抗體）Ⅲ期臨床試驗［13］結(jié)果顯示：Relatlimab 與PD-1 抗體聯(lián)用能夠明顯改善黑色素瘤患者的中位生存期。為了深入研究LAG3 蛋白在癌癥免疫治療中的重要作用，本研究通過構(gòu)建融合mCherry 紅色熒光蛋白的LAG3 慢病毒表達載體，轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定表達LAG3 的HEK293T 細胞系，為后續(xù)研究LAG3 抑制劑在癌癥治療中的作用提供重要的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器HEK293T 細胞為本實驗室凍存。培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，pEZ-mCherry 質(zhì)粒購自廣州易錦生物技術(shù)有限公司，pcDNA3.1-LAG3 質(zhì)粒為本實驗室構(gòu)建，T4 DNA 連接酶、EcoR Ⅰ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶購自日本TaKaRa 公司，Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司，LAG3 單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG （H+L） 購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，蛋白預(yù)染Marker 和顯色底物購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。核酸電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad 公司，倒置熒光顯微鏡購自美國Lifte-Technologies 公司，全自動多功能酶標儀購自瑞士TECAN 公司。

1.2 LAG3 慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建將pEZ-mCherry載體與pcDNA3.1-LAG3 質(zhì)粒同時用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和NotⅠ進行雙酶切，37 ℃水浴4 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分離并對相關(guān)片段進行凝膠回收，采用T4 DNA 快速連接酶在25 ℃水浴連接1 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細胞，接種至含氨芐青霉素（Amp） 的LB 平板培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。從平板培養(yǎng)基中挑取單個菌落，160 r·min－1搖床過夜，提取質(zhì)粒。雙酶切驗證成功的質(zhì)粒由生工生物工程（上海） 股份有限公司進行測序。

1.3 LAG3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立LAG3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及嘌呤霉素篩選獲得。轉(zhuǎn)染前1 d，將對數(shù)生長期的HEK293T 細胞以每孔1×106個細胞的密度接種在6 孔細胞培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染前匯合度達到70%～90%。第2 天加入含有Lipofectamine 3000 及LAG3 質(zhì)粒的Opti-MEM 混合溶液，以轉(zhuǎn)染空載體PEZ-mCherry 為對照，4 h 后換成新鮮配制的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h 后在熒光顯微鏡下587 nm 激發(fā)光觀察細胞膜上和細胞質(zhì)中LAG3-mCherry 紅色熒光的表達及細胞膜定位情況。為了獲得穩(wěn)定表達LAG3 的HEK293T 細胞系，轉(zhuǎn)染48 h 后將細胞轉(zhuǎn)移至10 cm 培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)，更換為含嘌呤霉素（8 mg·L－1） 的新鮮培養(yǎng)基，每隔2 d 棄去原有培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液清洗2 次，更換含嘌呤霉素（8 mg·L－1） 的新鮮培養(yǎng)基，此步驟重復(fù)3 次。在篩選細胞的細胞膜上檢測到明亮的紅色熒光提示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞初步制備成功。

1.4 LAG3 蛋白表達驗證通過Western blotting法驗證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中LAG3 蛋白表達情況。篩選結(jié)束后收集細胞，PBS 緩沖液清洗2～3 次，用RIPA 裂解液冰上裂解60 min，每隔10 min 顛倒混勻，之后將裂解液經(jīng)12 000 g、 4 ℃離心30 min，取上清進行BCA 蛋白定量及SDS-PAGE 分析。取30 μg 總蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 凝膠分離，25 V恒壓14 min 轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。PVDF 膜用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h 后，分別與LAG3一抗（1∶1 000） 和β -actin 一抗（1∶1 000） 在4 ℃搖床孵育過夜。TBST 清洗3 次后，再與辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000） 室溫孵育2 h，洗滌3 次后，將ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（BeyoECL Star） 中的A 液和B 液按1∶1 比例混合，覆蓋到膜上，使用化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)（MicroChemi 4.2）進行顯影成像。若在相對分子質(zhì)量為72 000 附近出現(xiàn)特異性條帶則提示LAG3-mCherry 融合蛋白表達成功。

2 結(jié) 果

2.1 LAG3 慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建含有mCherry 紅色熒光蛋白基因的慢病毒表達載體pEZ-mCherry 和LAG3 質(zhì)粒（pcDNA3.1-LAG3） 分別用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和NotⅠ進行雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測到長度約為8 012 bp 的載體片段和2 066 bp 的目的基因片段（圖1）。將載體片段和目的片段凝膠回收，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，提取重組質(zhì)粒后EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切鑒定結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒雙酶切后可見長度約為8 012 和2 066 bp 的2 條DNA 條帶，與pEZ-mCherry載體和LAG3基因片段大小相符（圖2），提示重組質(zhì)粒pEZ-LAG3-mCherry構(gòu)建成功。

圖1 LAG3 質(zhì)粒和mCherry 慢病毒表達載體雙酶切鑒定Fig.1 Double digestion of LAG3 plasmid and mCherry lentiviral expression vector

圖2 重組質(zhì)粒pEZ-LAG3-mCherry 的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pEZLAG3-mCherry by double digestion

2.2 LAG3-mCherry 重組質(zhì)粒的DNA 序列測定

重組質(zhì)粒pEZ-LAG3-mCherry DNA 測序結(jié)果顯示：LAG3 基因成功插入到pEZ-mCherry 載體中的EcoR Ⅰ位點（GAATTC），提示LAG3-mCherry重組質(zhì)粒pEZ-LAG3-mCherry 構(gòu)建成功。見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒pEZ-LAG3-mCherry 的DNA 測序結(jié)果Fig.3 DNA sequencing results of recombinant plasmid pEZ-LAG3-mCherry

2.3 LAG3-mCherry 在HEK-293T 細胞中的定位利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒pEZ-LAG3-mCherry 轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞，轉(zhuǎn)染48 h 后在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光（圖4），紅色熒光主要分布在HEK-293T 細胞的細胞膜上，在細胞質(zhì)中也有少量分布，與參文［14］ 報道的LAG3基因作為細胞膜受體定位相符。

圖4 LAG3-mCherry 在HEK293T 細胞中的定位（Bar=20 μm）Fig.4 Location of LAG3-mCherry in HEK293T cells (Bar=20 μm)

2.4 LAG3-mCherry 蛋白表達驗證LAG3-mCherry 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞后，經(jīng)過嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定表達LAG3-mCherry 的細胞系。提取穩(wěn)定表達細胞系的總蛋白，采用Western blotting 法檢測LAG3 蛋白表達情況：轉(zhuǎn)染LAG3-mCherry 重組質(zhì)粒的細胞裂解液泳道中在相對分子質(zhì)量72 000 附近檢測到清晰單一條帶，與預(yù)計相對分子質(zhì)量相符；而轉(zhuǎn)染空載體的細胞裂解液泳道中未檢出條帶，提示LAG3-mCherry 融合蛋白在制備的穩(wěn)定表達細胞系中成功表達。見圖5。

圖5 Western blotting 法檢測HEK293T 細胞中LAG3-mCherry 蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expression of LAG3-mCherry in HEK293T cells detected by Western blotting method

3 討 論

免疫檢查點是一類免疫細胞上表達的負性調(diào)節(jié)功能的受體分子，能夠抑制T 淋巴細胞的過度激活發(fā)揮防止發(fā)生自身損傷［15］。腫瘤細胞通過表達免疫檢查點的配體從而逃避免疫系統(tǒng)的識別和殺傷，因此基于免疫檢查點阻斷策略的藥物研發(fā)成為了腫瘤免疫治療的熱點領(lǐng)域［16］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的免疫檢查點主要包括PD-1、CTLA-4、LAG3 和T 細胞免疫球蛋白黏蛋白3 （T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3） 等［17-18］?，F(xiàn)在已有多款基于PD-1、 PD-L1 和CTLA-4 檢查點的單克隆抗體被批準用于臨床多種癌癥治療并取得了前所未有的治療效果?；谄渌庖邫z查點的單克隆抗體也相繼進入臨床試驗，有望獲得批準用于臨床相關(guān)癌癥的治療。

研究［17］顯示：腫瘤細胞誘導(dǎo)的T 淋巴細胞衰竭是其逃逸免疫攻擊的重要因素之一。阻斷免疫檢查點分子介導(dǎo)的抑制性信號通路能夠激活抗腫瘤免疫應(yīng)答［18］。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，長期抗原刺激會促使LAG3 基因呈高水平表達［16，19］，誘導(dǎo)T 淋巴細胞衰竭，封閉LAG3 能夠促進T 細胞增殖并提高有關(guān)細胞因子的分泌［20］。WOO 等［21］在小鼠腫瘤模型上檢測到腫瘤浸潤淋巴細胞上LAG3 和PD-1 的共表達，同時阻斷LAG3/PD-1 能夠抑制小鼠結(jié)腸癌細胞的生長，并消除80% 的腫瘤。開發(fā)LAG3 免疫抑制信號的特異性阻斷藥物具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

mCherry 作為一種示蹤熒光蛋白，具有較高的激發(fā)態(tài)、較低的光毒性和較強的組織穿透性，因此在細胞分布研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［22］。由于HEK293T 細胞生長繁殖速度快，極少表達細胞外配體所需的內(nèi)生受體，且比較容易轉(zhuǎn)染［23-27］，因此本實驗選擇HEK293T 細胞作為轉(zhuǎn)染并觀察蛋白表達的對象。本研究成功構(gòu)建了LAG3-mCherry 慢病毒表達載體，在熒光顯微鏡下觀察到LAG3 基因主要在轉(zhuǎn)染細胞的細胞膜上分布，Western blotting 法檢測證實了LAG3 蛋白的成功表達。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了LAG3-mCherry的慢病毒表達載體pEZ-LAG3-mCherry，建立了LAG3-mCherry 穩(wěn)定表達的HEK293T 細胞系，為進一步研究LAG3 基因功能及其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。