山姜素對來曲唑誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征模型大鼠的治療作用及其機制

孫艷敏, 胡俊攀, 王冰玉, 傅金英

（河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450002）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS） 是絕經(jīng)前女性中發(fā)生的一種以稀發(fā)排卵、高雄激素血癥、胰島素抵抗和卵巢多囊樣改變?yōu)橹饕卣鞯膬?nèi)分泌代謝紊亂性疾?。?］。雖然PCOS 的病因尚未明確，但目前普遍認(rèn)為卵巢顆粒細(xì)胞損傷與PCOS 的卵泡發(fā)育異常/閉鎖以及排卵障礙有關(guān)。孫春玲等［2］發(fā)現(xiàn)：PCOS 患者的竇狀卵泡期顆粒細(xì)胞中B 細(xì)胞淋巴瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表達(dá)降低，Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax） 和程序性細(xì)胞死亡分子5（programmed cell death 5，PDCD5） 蛋白表達(dá)水平升高，提示PCOS 患者竇狀卵泡期顆粒細(xì)胞存在程序性細(xì)胞死亡現(xiàn)象。近來多項研究［3-6］顯示： 在PCOS 患者和動物模型卵巢顆粒細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3-Ⅱ（microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、 自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，ATG） 5、 ATG7 和Beclin-1 等自噬標(biāo)記物蛋白的表達(dá)水平均升高，自噬底物p62 表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性降低，提示抑制顆粒細(xì)胞的自噬有助于改善PCOS 癥狀。然而，目前并無特異性治療PCOS 的藥物，因此尋找一種可以針對抑制顆粒細(xì)胞自噬性死亡信號的藥物，對PCOS 治療藥物的開發(fā)和篩選具有重要意義。

山姜素（alpinetin，ALP） 是一種主要從草豆蔻的根或種子提取的天然黃酮類化合物，已知其具有抗菌、消炎、抗氧化、抗腫瘤和降血脂等多種藥理作用［7-8］。最近研究［9］顯示：ALP 能增加高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病模型小鼠的胰島素敏感性。另外研究［10-12］顯示：ALP 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、自噬和甾體激素的作用?；贏LP 的藥理活性和PCOS 的癥狀和病理特征，推測ALP 可能具有治療PCOS 的作用，但ALP 在PCOS 中的作用機制尚不清楚。因此，本研究旨在觀察ALP 對來曲唑誘導(dǎo)的PCOS 模型大鼠的影響，并探討其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器4 周齡SPF 級未孕雌性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量75～85 g，購自河南省實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （豫）2017-0001。來曲唑（浙江海正藥業(yè)股份有限公司），ALP （純度＞99%，湖北廣奧生物科技有限公司），大鼠睪酮和17β-雌二醇的酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海康朗生物科技有限公司），HE 染色試劑盒和生物素-鏈霉卵白素免疫組織化學(xué)染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），RIPA 裂解液和ECL 發(fā)光試劑盒（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒、 甘油醛-3- 磷酸脫氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 抗體和辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP） 標(biāo)記的山羊抗兔IgG （上海碧云天生物技術(shù)有限公司），裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3 （Cleaved caspase-3） 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司），Bax、Bcl-2 和LC3 抗體（美國Abcam 公司）。DNM-9602G 酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），BX53 顯微鏡（日本Olympus 公司），微型垂直電泳-電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 實驗動物分組及實驗方案設(shè)計SD 大鼠飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院中心實驗室SPF 級動物房，溫度22 ℃～24 ℃，濕度55%～65%，12 h 明暗循環(huán)，自由飲水?dāng)z食。大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為對照組（n=9） 和造模組（n=31）。按照參考文獻(xiàn)［13］ 中的方法，以1 mg·kg－1·d－1來曲唑連續(xù)口服21 d 構(gòu)建PCOS 大鼠模型。通過連續(xù)陰道涂片檢查觀察大鼠的動情周期，將表現(xiàn)出無/不規(guī)則卵巢周期大鼠定義為PCOS 陽性。取造模成功的27 只PCOS 大鼠隨機分為模型組、低劑量ALP 組和高劑量ALP 組，每組9 只。低和高劑量ALP 組大鼠分別給予50 和100 mg·kg－1ALP 口服，每天1 次，連續(xù)給藥14 d。對照組和模型組大鼠正常飼養(yǎng)14 d。治療結(jié)束后，即刻測量大鼠體質(zhì)量。連續(xù)14 d 用陰道涂片檢測所有大鼠的動情周期，并計算發(fā)情間期（天數(shù)） 占整個動情周期（天數(shù)） 的百分率，即發(fā)情間期時像百分率。

1.3 標(biāo)本采集50 mg·kg－1戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠后，用真空抗凝管收集眼眶血，將血樣在室溫靜置10 min，2 500 r·min－1離心15 min 收集血清。迅速解剖并摘取大鼠雙側(cè)卵巢，在解剖顯微鏡下去除表面包膜和周圍脂肪組織后，稱雙側(cè)卵巢質(zhì)量，并計算卵巢/體質(zhì)量比（卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量）。沿中軸切下一側(cè)卵巢并用中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于后續(xù)HE 染色和免疫組織化學(xué)檢測；另一側(cè)卵巢用無菌生理鹽水清洗后并將其置入DMEM/F12 培養(yǎng)基中，在解剖顯微鏡下刺破卵泡，收集顆粒細(xì)胞并過200 目細(xì)胞篩，收集細(xì)胞用于后續(xù)Western blotting 法檢測。

1.4 ELISA 法檢測各組大鼠血清中睪酮和17β-雌二醇水平按照試劑盒說明書步驟，采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中樣品中睪酮和17β-雌二醇水平，用酶標(biāo)儀在波長450 nm 處記錄每孔的吸光度（A） 值。然后根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算大鼠血清中睪酮和17β-雌二醇水平。

1.5 HE 染色觀察各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)表現(xiàn)將卵巢石蠟組織切為5 μm 厚度的組織切片，經(jīng)脫蠟和水化后，行常規(guī)HE 染色，用顯微鏡觀察大鼠卵巢組織病理形態(tài)表現(xiàn)并拍照。

1.6 免疫組織化學(xué)染色觀察各組大鼠卵巢組織中Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)強度和分布情況每只大鼠任取5 個不同的卵巢組織石蠟切片（5 μm 厚度），經(jīng)脫蠟、水化、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶和封閉后，室溫孵育Cleaved caspase-3 （1∶200） 1 h，并設(shè)置空白對照組（用PBS 緩沖液代替一抗），然后，按照生物素-鏈霉卵白素免疫組織化學(xué)染色試劑盒步驟依次孵育生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶200）和HRP 標(biāo)記的鏈霉卵白素（1∶200） 后，用DAB顯色和蘇木素復(fù)染后，在顯微鏡下觀察并拍照。根據(jù)空白對照組判斷各組大鼠卵巢組織中Cleaved caspase-3 是否呈陽性表達(dá)。每組任選5 個切片，根據(jù)每個切片的定位細(xì)胞中Cleaved caspase-3陽性著色程度（+，計1分；■，計2分；■，計3 分） 和陽性著色的定位細(xì)胞總數(shù)（+，5%＜著色細(xì)胞總數(shù)＜25%；■，25%≤著色細(xì)胞總數(shù)＜50%；■，著色細(xì)胞總數(shù)≥50%） 判斷Cleaved caspase-3陽性表達(dá)強度。

1.7 Western blotting 法檢測各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平用RIPA 裂解顆粒細(xì)胞，提取蛋白。采用BCA試劑盒對蛋白定量后，取等量的蛋白通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF） 膜上。采用5% 牛血清白蛋白封閉非特異性結(jié)合位點后，分別室溫孵育一抗（1∶1 000 稀釋比例的Bax、Bcl-2 和LC3，1∶8 000 稀釋比例的GAPDH） 2 h，用TBST 緩沖液沖洗3 次后，室溫孵育HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000） 1 h，TBST 洗滌3 次。通過增強的ECL 發(fā)光檢測試劑盒使得條帶曝光并顯影于膠片。用Image J 軟件對條帶進(jìn)行掃描并檢測灰度值。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值；Bax/Bcl-2 比值=Bax 蛋白表達(dá)水平/Bcl-2 蛋白表達(dá)水平×100%，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值=LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組大鼠體質(zhì)量，卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量比，發(fā)情間期時像百分率，血清中睪酮和17β-雌二醇水平，卵巢顆粒細(xì)胞中Bax/Bcl-2 和LC3- Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均呈正態(tài)分布，以-x±s表示。多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量比和發(fā)情間期時像百分率與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量比和發(fā)情間期時像百分率均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，低和高劑量ALP 組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量比和發(fā)情間期時像百分率均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量比和發(fā)情間期時像百分率Tab.1 Body weights, ovary weight/body weight ratios and percentages of diestrous phase of rats in various groups (n=9，-±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量比和發(fā)情間期時像百分率Tab.1 Body weights, ovary weight/body weight ratios and percentages of diestrous phase of rats in various groups (n=9，-±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model ALP Low dose High dose Body weight(m/g)195.35±23.42 228.29±27.49*211.52±8.91△202.16±15.21△△Ovary weight/body weight ratio (η/%)0.21±0.03 0.35±0.08*0.29±0.03△0.26±0.06△△Percentage of diestrous phase (η/%)59.36±5.77 85.21±11.48*75.16±14.19△70.53±6.76△△

2.2 各組大鼠血清中睪酮和17β-雌二醇水平與對照組比較，模型組大鼠血清中睪酮和17β-雌二醇水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量ALP 組大鼠血清中睪酮水平明顯降低（P＜0.05），而17β-雌二醇水平無明顯變化（P＞0.05）；高劑量ALP 組大鼠血清中睪酮和17β-雌二醇水平均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清中睪酮和17β-雌二醇水平Tab.2 Levels of testosterone and 17β -estradiol in serum of rats in various groups (n=9，-±s，ρB/（μg·L-1）］

表2 各組大鼠血清中睪酮和17β-雌二醇水平Tab.2 Levels of testosterone and 17β -estradiol in serum of rats in various groups (n=9，-±s，ρB/（μg·L-1）］

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model ALP Low dose High dose Testosterone 0.52±0.14 1.54±0.17*1.28±0.20△0.89±0.23△△17β-estradiol 27.36±4.02 63.49±11.00*57.32±11.65 40.76±14.90△

2.3 各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠卵巢組織的顆粒細(xì)胞層結(jié)構(gòu)正常，可見黃體和不同發(fā)育階段的卵泡；模型組大鼠卵巢組織呈多囊性改變，黃體數(shù)量減少或消失，出現(xiàn)大量充液性大囊性卵泡和閉鎖性卵泡，顆粒細(xì)胞層排列紊亂且層數(shù)減少；低和高劑量ALP 組大鼠卵巢組織中囊性卵泡和閉鎖性卵泡變少，顆粒細(xì)胞層結(jié)構(gòu)趨向正常。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of ovary tissue of rats in various groups (HE, ×200)

2.4 各組大鼠卵巢組織中Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)強度和分布情況對照組大鼠卵巢組織顆粒細(xì)胞層中Cleaved caspase-3 呈陰性表達(dá)；模型組大鼠卵巢組織中Cleaved caspase-3 蛋白呈陽性表達(dá)，且主要定位于顆粒細(xì)胞層；與模型組比較，低和高劑量ALP 組大鼠卵巢組織顆粒細(xì)胞層中Cleaved caspase-3 蛋白陽性表達(dá)強度明顯降低。見圖2。

圖2 各組大鼠卵巢組織中Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，Bar=200 μm）Fig.2 Expressions of Cleaved caspase-3 in ovary tissue of rats in various groups(Immunohistochemistry，Bar=200 μm)

2.5 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中Bax/Bcl-2 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與對照組比較，模型組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中Bax/Bcl-2 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，低和高劑量ALP 組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中Bax/Bcl-2 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖3 和表3。

表3 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中Bax/Bcl-2 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值Tab.3 Ratios of Bax/Bcl-2 and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰin ovarian granulosa cells of rats in various groups (n=9，-±s，η/%）

表3 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中Bax/Bcl-2 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值Tab.3 Ratios of Bax/Bcl-2 and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰin ovarian granulosa cells of rats in various groups (n=9，-±s，η/%）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model ALP Low dose High dose Bax/Bcl-2 96.73±29.58 312.69±24.29*244.32±13.74△197.54±17.65△△LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ102.75±16.35 464.16±50.42*354.75±66.20△206.83±43.16△△

圖3 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中Bax 、Bcl-2（A）和LC3Ⅰ、LC3Ⅱ(B)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of Bax, Bcl-2(A),and LC3Ⅰ,LC3Ⅱ(B)proteinsinovariangranulosa cells of rats in various groups

3 討 論

研究［14］顯示：育齡期女性中PCOS 患病率約為10%，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。PCOS 不僅是造成育齡期婦女不孕的主要原因之一，還會大幅增加糖尿病、高血壓、異常脂血癥、高胰島素血癥和心血管疾病的患病風(fēng)險［15-16］。目前關(guān)于PCOS 發(fā)病和進(jìn)展機制并不清楚，臨床常用的治療策略也僅是對癥治療且效果不理想，因此篩選優(yōu)良的PCOS 治療藥物具有重要意義。

現(xiàn)有研究［7-12］表明：ALP 具有抗炎、抗氧化、抗胰島素抵抗、調(diào)節(jié)激素和細(xì)胞自噬等藥理作用，提示ALP 可能具有抗PCOS 的作用，但ALP 在PCOS 中的作用尚不清楚。在本研究中，對照組大鼠遵從規(guī)律的動情周期，而來曲唑誘導(dǎo)的PCOS 模型大鼠表現(xiàn)為發(fā)情間期延長，ALP 治療可以縮短PCOS 模型大鼠發(fā)情間期時像。已有研究［13，17］表明：動情周期的變化與睪酮濃度的變化有關(guān)，外周血睪酮水平增加能導(dǎo)致卵巢周期不規(guī)則、發(fā)情間期延長和體質(zhì)量增加。因此，ALP 降低PCOS 模型大鼠的體質(zhì)量和發(fā)情間期時像的百分率的作用可能與其降低外周血睪酮濃度有關(guān)聯(lián)。

卵泡發(fā)育異常是引起PCOS 排卵障礙的主要因素［18］。卵巢顆粒細(xì)胞能合成和分泌的雌二醇、胰島素樣生長因子和其他細(xì)胞因子，表達(dá)諸如雌二醇、促卵泡激素和促黃體生成素等激素的受體，而上述激素和激素受體能介導(dǎo)卵泡生長發(fā)育、閉鎖和排卵［19-21］。因此，顆粒細(xì)胞損傷是導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常和閉鎖的關(guān)鍵因素。在PCOS 中存在顆粒細(xì)胞自噬性死亡的現(xiàn)象，且其能加劇卵泡閉鎖和排卵障礙［3-6］。本文作者觀察到：PCOS 模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的自噬性死亡增加，ALP 可以有效抑制PCOS 模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的自噬性死亡，同時減少卵泡發(fā)育異常/閉鎖，提示ALP 可對PCOS 模型大鼠的顆粒細(xì)胞起到保護作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：ALP 能改善來曲唑誘導(dǎo)的PCOS 模型大鼠的癥狀，包括降低大鼠體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量比、發(fā)情間期時像百分率、血清中睪酮和17β-雌二醇水平，改善卵巢呈多囊性改變和減少閉鎖卵泡數(shù)，并抑制顆粒細(xì)胞損傷，提示ALP 是潛在的治療PCOS 的藥物。