丹參多酚酸酯調(diào)控SMAD2/FKBP1A/NF-κB 軸對骨質(zhì)疏松癥大鼠破骨細胞分化和骨吸收的影響

馬運鋒, 韓小飛

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 河南省中醫(yī)院骨病一科，河南 鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 河南省中醫(yī)院風濕病科，河南 鄭州 450002）

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低、骨組織結(jié)構(gòu)惡化和骨強度受損為特征的代謝性疾病，骨折風險極高，其中老年人最為常見［1］。在絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥中，由于缺乏雌激素的控制，破骨細胞變得過度活 躍，導(dǎo)致骨吸收加強［2］。丹參多酚酸酯（salvianolate，Sal） 是中藥丹參的活性成分，具有活血化瘀的功效，常用于治療冠心病引起的心絞痛［3-4］。研究［5］表明：Sal 可通過降低骨吸收和增加骨形成緩解糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的狼瘡易發(fā)性小鼠骨質(zhì)丟失。SMAD家族蛋白2（SMAD family member 2，SMAD2） 是轉(zhuǎn)化生長因子β （transforming growth factor-β，TGF-β） 信號的細胞內(nèi)特異性傳感器，參與骨代謝，在破骨細胞和成骨細胞的發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用［6］。研究［7］顯示：SMAD2 磷酸化水平升高可促進破骨細胞生成。研究［8］顯示：Sal 可通過抑制SMAD2 介導(dǎo)的膠原沉積，預(yù)防心肌梗死大鼠的心房顫動。因此，在骨質(zhì)疏松癥中Sal 可能對SMAD2 有調(diào)控作用。FK506 結(jié)合蛋白1A （FK506-binding protein 1A，F(xiàn)KBP1A） 是機體普遍表達的肽基- 脯氨酰異構(gòu)酶，在骨化性纖維增生癥中FKBP1A 可抑制TGF-β 或骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP） 信號激活［9］。而FKBP1A 蛋白在骨質(zhì)疏松癥中的作用尚未見報道。核因子κB （nuclear factor-κB，NF-κB） 作為破骨細胞活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子在骨質(zhì)疏松癥中可被SMAD 家族蛋白（SMAD family member，SMAD） 激活［10-11］。本研究從體內(nèi)和體外水平評價Sal 調(diào)控SMAD2/FKBP1A/NF-κB 軸對骨質(zhì)疏松癥大鼠破骨細胞分化和骨吸收的影響，為闡明其作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物30 只SPF 級雌性Sprague Dawley（SD） 大鼠，10 周齡，體質(zhì)量260～280 g； 5 只SPF 級雌性SD 大鼠，1～3 日齡，體質(zhì)量10～12 g；以上SD 大鼠均購于河南省實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK （豫） 2017-0001。

1.2 主要試劑和儀器Sal （批號：16100521） 購自上海綠谷制藥有限公司，α-MEM 細胞培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS） 購自美國Gibco公司，抗酒石酸酸性磷酸酶5b （tartrate-resistant acid phosphatase 5b，TRAP5b） 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購自美國Invitrogen公司，蘇木精（Hematoxylin）和伊紅（Eosin） 染色液購自美國Sigma 公司，兔抗Flag 和Myc 標簽單克隆抗體及兔抗SMAD2和β - 肌動蛋白（β -actin） 多克隆抗體購自美國Abcam 公司，兔抗FKBP1A 和磷酸化核因子κB P65 （phosphorylated nuclear factor κB P65，p-P65）單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司，HRP 標記的山羊抗兔酶標二抗購自美國Cell Signaling Technology 公司，NF-κB 抑制劑QNZ 購自美國Med Chem Express 公司，慢病毒空載體（vector） 和慢病毒介導(dǎo)的FKBP1A 過表達載體（LV-FKBP1A） 由生工生物工程（上海） 股份有限公司構(gòu)建，噻唑藍（MTT） 染色液購自上海炎熙生物科技有限公司，ECL 發(fā)光液購自美國Thermo 公司。酶標儀購自美國ELX800 公司，ZLM-0.3 實驗室臥式研磨機購自上海眾時機械有限公司，凝膠成像分析儀購自廣州瑞豐實驗設(shè)備有限公司，MEDIX-90 雙能X 射線骨密度儀購自法國MEDILINK 公司。

1.3 動物模型制備和給藥30 只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和Sal 組，每組10 只。采用10%水合氯醛（3 mL·kg－1） 腹腔注射大鼠進行麻醉，手術(shù)摘除卵巢后快速縫合傷口，觀察4 周，假手術(shù)組大鼠僅暴露卵巢不摘除。Sal 組大鼠手術(shù)后4 周隔天腹腔注射40 mg·kg－1Sal，持續(xù)4 周。假手術(shù)組和模型組大鼠隔天皮下注射等體積0.9% 生理鹽水，持續(xù)4 周。給藥結(jié)束后采用斷頭法處死大鼠，取右側(cè)股骨和骨腔組織進行下一步檢測。

1.4 雙能X 線骨密度儀檢測各組大鼠股骨骨密度（bone mineral density，BMD）給藥結(jié)束后處死大鼠，取右側(cè)股骨組織長為1 cm 左右，采用雙能X 射線骨密度儀測BMD，劃定中心區(qū)域，用小物體掃描模式（分辨率為1.0 mm×1.2 mm，掃描速度50 mm·s－1，掃描寬度2.0 cm） 進行掃描。

1.5 三點彎曲試驗檢測各組大鼠股骨最大載荷BMD 值測定結(jié)束后，取各組骨質(zhì)疏松大鼠右側(cè)股骨，放于生物力學(xué)測試機上，找股骨中點為施壓點，加壓速度為2 mm·min－1，采用計算機記錄并計算股骨最大載荷。

1.6 HE 染色觀察各組大鼠骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)大鼠處死后取股骨組織，用4% 多聚甲醛固定48 h，在10% 乙二胺四乙酸（EDTA） 中脫鈣3 周，石蠟包埋，使用切片機將其切成5 μm 左右薄片，放入45 ℃恒溫箱烘干，二甲苯脫蠟，酒精脫水，使用蘇木精溶液染色切片5 min，用流水沖洗10 s，滴加1% 鹽酸酒精和1% 氨水酒精在切片上各停留15 s，蒸餾水沖洗后加入1% 伊紅染液染色3 min，梯度酒精脫水，二甲苯使切片透明，中性樹膠封片。光鏡下選取各組大鼠右側(cè)股骨組織8 個高倍視野（×100） 拍照，使用IPP 軟件（Image Pro -Plus Software 6.0） 觀察骨小梁形態(tài)和大小。

1.7 細胞分離、培養(yǎng)和處理從初生SD 雌性大鼠股骨和脛骨骨髓中分離出骨髓巨噬細胞（bone marrow macrophages，BMMs），在含有10% 胎牛血清和1% 青霉素/鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)基中加入30 μg·L－1巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF） 和100 μg·L－1核因子κB 配體（nuclear factor κB ligand，RANKL） 培養(yǎng)細胞7 d 誘導(dǎo)BMMs 分化，每3 d 更換1 次細胞培養(yǎng)液。對照組細胞加入等體積0.9% 生理鹽水； Sal 組細胞誘導(dǎo)分化后以10 mg·L－1Sal 孵育細胞72 h； RANKL+Sal+vector 組細胞誘導(dǎo)分化后加入10 mg·L－1Sal 和2 mg·L－1vector 轉(zhuǎn)染48 h ； RANKL+Sal+LV-FKBP1A 組細胞誘導(dǎo)分化后加入10 mg·L－1Sal和2 mg·L－1LV-FKBP1A 轉(zhuǎn)染48 h； RANKL+Sal+LV-FKBP1A+QNZ 組細胞誘導(dǎo)分化后加入10 mg·L－1Sal 和2 mg·L－1LV- FKBP1A 轉(zhuǎn)染48 h，再加入10 nmol·L－1NF- κB 抑制劑QNZ （溶于10%DMSO） 孵育細胞1 h。各組細胞處理結(jié)束后轉(zhuǎn)入含10% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h 后進行各項指標檢測。

1.8 MTT 法檢測各組細胞增殖活性在細胞培養(yǎng)的第0、2、4、6 和8 天時分別加入5 g·L－1MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸出培養(yǎng)液并加入150 μL DMSO，待結(jié)晶全部溶解后，使用酶標儀檢測波長490 nm 處吸光度（A） 值，以A 值表示各組細胞增殖活性。

1.9 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率BMMs 以3×105mL－1的密度接種于培養(yǎng)基孵育24 h。收集細胞并用預(yù)冷PBS 緩沖液洗滌3 次。將細胞重懸在含有PI 的緩沖液中，室溫培養(yǎng)15 min 后，采用BD LSRFortessa 細胞分析儀檢測細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，實驗重復(fù)3 次，取平均值。

1.10 ELISA 法檢測各組大鼠血清和各組細胞中TRAP5b 水平在藥物干預(yù)的最后一天，以仰臥位將大鼠綁定在解剖固定板上，采用10 mL 注射器針頭刺入大鼠心臟，采集血液5 mL ，放置4 h 后，以3 000 r·min－1離心5 min，分離血清。收集各組BMMs 培養(yǎng)液上清。采用ELISA 法按照TRAP5b檢測試劑盒說明書檢測各組大鼠血清和各組BMMs培養(yǎng)液上清中TRAP5b 水平。

1.11 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）分析使用在線數(shù)據(jù)庫STRING 預(yù)測SMAD2 和FKBP1A 的相互作用。HEK293T 細胞培養(yǎng)在含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，待細胞長至80%，分別加入濃度為1 g·L－1質(zhì)粒在饑餓條件下進行轉(zhuǎn)染，24 h 后吸取培養(yǎng)液，加入1 mL PBS緩沖液并刮取細胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，從中吸取100 μL 作為input。將剩余的細胞懸液在室溫下6 000 r·min－1離心2 min，去上清，加入1 mL細胞裂解緩沖液［20 mmol·L－1Tris-HCl （pH 7.5），150 mmol·L－1NaCl，1% Triton X-100 ，0.5 mmol·L－1EDTA，0.5 mmol·L－1DTT］充分混勻，4 ℃、3 000 r·min－1離心1 min 去上清，加入預(yù)冷PBS 緩沖液重懸，重復(fù)3 次后加入等體積PBS 緩沖液充分混勻，取適量預(yù)混液加入兔抗Myc標簽一抗（5 mg·L－1）、 兔抗Flag 標簽一抗（1 ∶30） 和山羊抗兔二抗（1∶1 000）］ 進行Western blotting 法檢測。

1.12 Western blotting 法檢測各組大鼠骨組織和各組細胞中SMAD2、FKBP1A 和p-P65 蛋白表達水平采用RIPA 裂解液裂解細胞并提取總蛋白，BCA 試劑盒測定樣品蛋白濃度。電泳結(jié)束后用蛋白轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，采用5% 脫脂牛奶將膜封閉1 h，TBST 洗膜完成后，用一抗SMAD2 （1∶1 000 稀釋）、FKBP1A （1∶2 000 稀釋）、p-P65 （1∶500 稀釋） 和β-actin （1∶1 000 稀釋） 4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，加入HRP 標記的山羊抗兔酶標二抗（1∶2 000 稀釋） 室溫孵育2 h，洗膜完成后在ECL 中顯色，采用Image J 軟件進行灰度值分析，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin 條帶灰度值。

1.13 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組大鼠骨組織和各組細胞中組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）和降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）mRNA 表達水平將收集的小鼠右側(cè)股骨組織放入ZLM-0.3 實驗室臥式研磨機中，填充少量液氮，研磨5 min。使用TRIzol 試劑按照說明書提取大鼠骨組織和各組細胞中總RNA，使用TaqMan 試劑盒將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物由生工生物工程（上海） 有限公司合成，引物序列：CTSK，上游引物序列5′-ATGTGGGGGCTCAAGGTT-3′，下游引物序列5′-CCACAAGATTCTGGGGACTC-3′ ； CTR ，上游引物序列5′-TTTCAAGAACCTTAGCTGCCAGAG-3′，下游引物序列5′-CAAGGCACGGACAATGTTGAGAAG-3′；GAPDH，上游引物序列5′-GTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′ ，下游引物序列5′-GCCATGGGTGGAATCATATTGG-3′。PCR反應(yīng)體系20 μL：2 μL 模板，2 μL 10×TaqMan 酶，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，14 μL ddH2O 。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃、1 min，95 ℃、30 s，56 ℃、l min，72 ℃、l min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用SYBR Green Mater Mix 試劑檢測待檢基因的mRNA 水平，重復(fù)檢測3 次，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計算目的基因mRNA 表達水平。

1.14 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組大鼠股骨BMD 和股骨最大負載，各組細胞增殖活性和凋亡率，各組大鼠血清和各組細胞中TRAP5b 水平，各組大鼠骨組織和各組細胞中SMAD2、FKBP1A 及p-P65 蛋白表達水平和CTSK 及CTR mRNA 表達水平均呈正態(tài)分布，以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)和股骨BMD 及最大負載HE 染色結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨骨小梁數(shù)量明顯減少，且排列較不規(guī)則；與模型組比較，Sal 組大鼠股骨骨小梁數(shù)量明顯增加，骨小梁排列趨于整齊，分離程度降低。見圖1。

圖1 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE,×100）Fig.1 Pathomorphology of femur tissue of rats in various groups (HE,×100)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨BMD 和最大負載明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，Sal組大鼠股骨BMD 和最大負載明顯升高（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠股骨BMD 和最大負載Tab.1 BMD and maximum loads of femur of rats in various groups (n=10，±s）

表1 各組大鼠股骨BMD 和最大負載Tab.1 BMD and maximum loads of femur of rats in various groups (n=10，±s）

*P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.01 vs model group.

Group Sham operation Model Sal BMD（mg·cm－3）225.32±15.37 167.25±12.16*207.28±13.25△Maximum load（F/N）65.42±4.63 41.36±2.38*56.24±4.95*△

2.2 各組大鼠血清中TRAP5b 水平、骨組織中SMAD2 及FKBP1A 蛋白表達水平和CTSK 及CTR mRNA 表達水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TRAP5b 水平、 骨組織中SMAD2 及FKBP1A 蛋白表達水平和CTSK 及CTR mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01）； 與模型組比較，Sal 組大鼠血清中TRAP5b 水平、 骨組織中SMAD2 及FKBP1A 蛋白表達水平和CTSK 及CTR mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.01）。見表2、圖2 和表3。

表2 各組大鼠血清中TRAP5b 水平Tab.2 Levels of TRAP5b in serum of rats in various groups [n=10,±s,ρB/（ng·L-1）]

表2 各組大鼠血清中TRAP5b 水平Tab.2 Levels of TRAP5b in serum of rats in various groups [n=10,±s,ρB/（ng·L-1）]

*P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.01 vs model group.

Group Sham operation Model Sal TRAP5b 523.48±52.36 962.34±67.41*642.16±42.28*△

圖2 各組大鼠骨組織中SMAD2 和FKBP1A 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.2 Electrophoregram(A) and histogram (B) of expressions of SMAD2 and FKBP1A proteins in femur tissue of rats in various groups

表3 各組大鼠骨組織中CTSK 和CTR mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of CTSK and CTR mRNA in bone tissue of rats in various groups (n=10，±s）

表3 各組大鼠骨組織中CTSK 和CTR mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of CTSK and CTR mRNA in bone tissue of rats in various groups (n=10，±s）

*P＜0.01 vs sham operation group；△P＜0.01 vs model group.

Group Sham operation Model Sal CTSK 1.00±0.12 6.03±0.35*2.24±0.27*△CTR 1.00±0.09 8.32±0.46*3.43±0.39*△

2.3 各組細胞增殖活性、細胞中TRAP5b 水平、CTSK 和CTR mRNA 表達水平及細胞凋亡率與對照組比較，培養(yǎng)4 d后，RANKL組細胞增殖活性明顯升高（P＜0.01），細胞中TRAP5b 水平和CTSK 及CTR mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01），細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）； 與RANKL 組比較，培養(yǎng)4 d 后，RANKL+ Sal 組細胞增殖活性明顯降 低（P＜0.01），細胞中TRAP5b 水平和CTSK 及CTR mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.01），細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。見圖3、 表4 、表5 和圖4。

圖4 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

表4 各組細胞中TRAP5b 水平Tab.4 Levels of TRAP5b in cells in various groups[n=6,±s,ρB/（ng·L-1）]

表4 各組細胞中TRAP5b 水平Tab.4 Levels of TRAP5b in cells in various groups[n=6,±s,ρB/（ng·L-1）]

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs RANKL group.

Group Control RANKL RANKL+ Sal TRAP5b 29.53±2.46 53.47±4.18*35.63±2.76*△

表5 各組細胞中CTSK 和CTR mRNA 表達水平Tab.5 Expression levels of CTSK and CTR mRNA in cells in various groups （n=6,±s）

表5 各組細胞中CTSK 和CTR mRNA 表達水平Tab.5 Expression levels of CTSK and CTR mRNA in cells in various groups （n=6,±s）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs RANKL group.

Group Control RANKL RANKL+ Sal CTSK mRNA 1.00±0.07 4.71±0.28*2.11±0.23*△CTR mRNA 1.00±0.09 6.53±0.41*2.89±0.32*△

圖3 各組細胞增殖活性Fig.3 Proliferation activities of cells in various groups

2.4 Co-IP 分析及各組細胞中SMAD2 和FKBP1A蛋白表達水平在線數(shù)據(jù)庫STRING 預(yù)測結(jié)果顯示： SMAD2 和FKBP1A 蛋白之間存在直接相互作用。Co-IP 實驗結(jié)果顯示：Myc 抗體和Flag 抗體均檢測到SMAD2 和FKBP1A 蛋白的表達，進一步證實SMAD2 蛋白與FKBP1A 蛋白存在相互作用。見圖5。Western blotting 法檢測： 與對照組比較，RANKL 組細胞中SMAD2 和FKBP1A 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）； 與RANKL 組比較，RANKL+ Sal 組細胞中SMAD2 和FKBP1A 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。見圖6。

圖5 SMAD2 與FKBP1A 蛋白相互作用分析Fig.5 Analysis on interaction between SMAD2 and FKBP1A proteins

圖6 各組細胞中SMAD2 和FKBP1A 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.6 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of SMAD2 and FKBP1A proteins in cells in various groups

2.5 Sal 調(diào)控SMAD2/FKBP1A/NF-κB 軸實驗中各組細胞中SMAD2、FKBP1A 和p-P65 蛋白表達水平與對照組比較，RANKL 組細胞中SMAD2、FKBP1A 和p-P65 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。與RANKL 組比較，RANKL+ Sal 組細胞中SMAD2、FKBP1A 和p-P65 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）；與RANKL+Sal+vector 組比較，RANKL+Sal+LV-FKBP1A 組細 胞 中SMAD2、FKBP1A 和p-P65 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）； 與RANKL+Sal+LV-FKBP1A 組比較，RANKL+Sal+LV-FKBP1A+QNZ 組細胞中SMAD2、 FKBP1A 和p-P65 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。見圖7。

圖7 各組細胞中SMAD2、FKBP1A 和p-P65 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.7 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of SMAD2, FKBP1A and p-P65 proteins in cells in various groups

2.6 Sal 調(diào)控SMAD2/FKBP1A/NF-κB 軸實驗中各組細胞凋亡率、細胞中TRAP5b 水平和CTSK 及CTR mRNA 表達水平與RANKL+Sal+vector組比較，RANKL+Sal+LV-FKBP1A 組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01），細胞中TRAP5b 水平和CTSK及CTR mRNA表達水平明顯升高（P＜0.01）；與RANKL+Sal+LV-FKBP1A組比較，RANKL+Sal+LV-FKBP1A+QNZ 組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），TRAP5b 水平和CTSK 及CTR mRNA表達水平明顯降低（P＜0.01）。見圖8、表6 和表7。

表6 各組細胞中TRAP5b 水平Tab.6 Levels of TRAP5b in cells in various groups[n=6,±s,ρB/（ng·L-1）]

表6 各組細胞中TRAP5b 水平Tab.6 Levels of TRAP5b in cells in various groups[n=6,±s,ρB/（ng·L-1）]

*P＜0.01 vs RANKL+Sal+vector group ；△P＜0.01 vs RANKL+Sal+LV-FKBP1A group.

Group RANKL+ Sal+ vector RANKL+ Sal+LV-FKBP1A RANKL+ Sal+LV-FKBP1A+QNZ TRAP5b 35.41±2.39 62.27±4.16*32.28±3.25△

表7 各組細胞中CTSK 和CTR mRNA 表達水平Tab.7 Expression levels of CTSK and CTR mRNA in cells in various groups （n=6,±s）

表7 各組細胞中CTSK 和CTR mRNA 表達水平Tab.7 Expression levels of CTSK and CTR mRNA in cells in various groups （n=6,±s）

*P＜0.01 vs RANKL+Sal+vector group ；△P＜0.01 vs RANKL+Sal+LV-FKBP1A group.

Group RANKL+ Sal+ vector RANKL+ Sal+LV-FKBP1A RANKL+ Sal+LV-FKBP1A+QNZ CTSK mRNA 1.00±0.08 2.21±0.18*0.89±0.09△CTR mRNA 1.00±0.07 2.48±0.15*0.75±0.06*△

圖8 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率Fig.8 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

3 討 論

隨著全球人口的老齡化，骨質(zhì)疏松癥已成為嚴重的社會和公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率在世界常見疾病中位居第7 位［12］。骨穩(wěn)態(tài)取決于破骨細胞對骨骼的吸收和成骨細胞對骨骼的形成，該耦合關(guān)系的不平衡則會導(dǎo)致骨骼疾病［13］。研究［14-15］顯示：骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)破骨細胞更活躍，加劇了骨吸收，而誘導(dǎo)破骨細胞凋亡被認為在骨吸收加速的條件下降低破骨細胞活性的有效策略。有研究［16］表明：與西藥比較，補中益氣湯、補腎益經(jīng)湯和補骨壯骨湯等中藥湯劑對于治療骨質(zhì)疏松有更好的效果。Sal 是中藥丹參的有效成分，常用于治療心臟疾?。?］。Sal 可通過上調(diào)成骨分化相關(guān)基因和蛋白的表達，促進成骨細胞分化，防止糖皮質(zhì)激素治療引起的骨丟失［17］。此外，Sal 可提高血清鈣濃度，降低血清TRAP5b 水平，緩解糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥［18］。破骨細胞標記物TRAP5b和CTR 反映了破骨細胞數(shù)量的變化，而CTSK 反映了破骨細胞的骨吸收活性［19］。本研究采用去勢法建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，結(jié)果表明：與模型組比較，Sal 組大鼠血清中TRAP5b 水平和骨組織中CTSK 及CTR mRNA 表達水平明顯降低，表明Sal對雌激素缺乏引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥有保護作用。

研究者［20］通過使用細胞角蛋白14（cytokeratin 14，K14） 啟動子在轉(zhuǎn)基因小鼠（K14-SMAD2） 上皮細胞中過表達SMAD2，結(jié)果顯示：K14-SMAD2 小鼠BMD 明顯降低，TRAP5b 水平、破骨細胞分化因子RANKL mRNA 表達水平和破骨細胞數(shù)量明顯增加，引起小鼠牙槽骨丟失。Sal可通過抑制TGF-β1/SMAD2/3 介導(dǎo)的膠原沉積，改善心肌梗死大鼠心臟功能［8］。在骨質(zhì)疏松癥中，Sal 對SMAD2 的調(diào)控作用尚未見報道。本研究結(jié)果顯示：Sal 組大鼠骨組織中SMAD2 和FKBP1A蛋白表達水平明顯降低； 此外，Sal 可明顯抑制RANKL 誘導(dǎo)后的破骨細胞增殖，促進細胞凋亡，抑制細胞中SMAD2、FKBP1A 和p-P65 蛋白表達水平。研究［21］表 明： 在心臟內(nèi)皮細胞 中，F(xiàn)KBP1A 過表達可明顯降低Notch 1 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch 1 intracellular domain，N1ICD） 的穩(wěn)定性，抑制Notch 受體1 （Notch receptor 1，NOTCH1）通路的激活，促進心室壁的形成。NOTCH1 過表達可抑制NF-κB 通路激活劑RANKL 誘導(dǎo)的破骨細胞增殖和分化［22］。FKBP1A 在破骨細胞中的作用尚未見報道。本研究中，Co-IP實驗驗證了SMAD2和FKBP1A 的結(jié)合，且FKBP1A 過 表 達 可 促進SMAD2 和p-P65 蛋白的表達，抑制破骨細胞凋亡，促進TRAP5b 分泌和CTSK 和CTR mRNA 的表達，而NF-κB 通路抑制劑QNZ 可逆轉(zhuǎn)FKBP1A 過表達的作用。

綜上所述，Sal 通過調(diào)控SMAD2 和FKBP1A蛋白的相互作用，抑制NF-κB 信號通路，進而抑制RANKL 誘導(dǎo)的破骨細胞增殖和分化，促進細胞凋亡，對雌激素缺乏引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥有保護作用。本研究為骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新的靶點和方向。