小鼠NR1D1 基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及其生物信息學(xué)分析

董 浩, 江海圳, 李 超, 高登科, 靳亞平, 陳華濤

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院臨床獸醫(yī)系，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100）

核受體亞家族1 組D 成員1 （nuclear receptor subfamily 1 group D member 1，NR1D1），又被稱(chēng)為REV-ERBα，于1989 年首次被發(fā)現(xiàn)［1-2］。由于前期未發(fā)現(xiàn)NR1D1 的配體，NR1D1 一直被認(rèn)為是孤兒核受體［3-5］，阻礙了研究者對(duì)其功能特性進(jìn)行充分認(rèn)識(shí)。2007 年，RAGHURAM 等［6］證實(shí)血紅素是NR1D1 的天然配體。進(jìn)一步研究［7-11］表明：血紅素既可激活單體NR1D1 與靶基因序列（AGGTCA） 的結(jié)合，也可激活2 個(gè)NR1D1 組成的二聚體與2 個(gè)間距2 bp 的靶序列結(jié)合，從而對(duì)下游靶基因起到轉(zhuǎn)錄抑制作用。隨著對(duì)NR1D1 生理功能認(rèn)識(shí)的不斷深入和化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，NR1D1 人工合成配體也應(yīng)運(yùn)而生。2010 年，GRANT 等［12］采用NR1D1 與核受體輔阻遏物1（nuclear receptor corepressor-1，NCoR-1） 之間相互作用的分析方法篩選出GSK4112 是一種與血紅素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NR1D1 的小分子化合物。2012 年SOLT 等［13］人工合成了2 種NR1D1 配體SR9011和SR9009，并證明其在HEK293T 細(xì)胞中劑量依賴(lài)特性地增加與Gal4 DNA 結(jié)合域（DNA binding domain） 嵌合，起到增強(qiáng)NR1D1 轉(zhuǎn)錄抑制功能的作用。研究［13-14］表明： 小鼠腹腔注射SR9011 和SR9009 激動(dòng)劑可增加機(jī)體能量消耗，并降低體脂、血漿甘油三酯和膽固醇水平，提示NR1D1 與機(jī)體代謝性功能之間存在重要的關(guān)聯(lián)。NR1D1 配體的發(fā)現(xiàn)，加深了對(duì)NR1D1 生理功能的認(rèn)識(shí)，但在分子生物學(xué)水平需要更進(jìn)一步深入研究和探討。

NR1D1 基因位于小鼠第11 號(hào)染色體上，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI） 網(wǎng)站上的Gene ID 是217166，基因長(zhǎng)度為7 476 bp，包含7 個(gè)內(nèi)含子和8 個(gè)外顯子。BONNELYE 等［15］于1994 年發(fā)現(xiàn)NR1D1 的 同 源 異 構(gòu) 體NR1D2。NR1D1 和NR1D2 在編碼序列和蛋白結(jié)構(gòu)上具有很高的相似性，在晝夜節(jié)律和代謝穩(wěn)態(tài)維持中均發(fā)揮其相應(yīng)作用［8，16］。進(jìn)一步的研究［16-17］顯示：NR1D1－/－小鼠表現(xiàn)出較嚴(yán)重的晝夜節(jié)律和代謝紊亂，NR1D2－/－小鼠在晝夜節(jié)律和代謝穩(wěn)態(tài)方面卻無(wú)明顯異常，說(shuō)明NR1D1 在晝夜節(jié)律和代謝穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著更重要的生理作用。

NR1D1 調(diào)控的下游靶基因種類(lèi)繁多且復(fù)雜，目前對(duì)其調(diào)控晝夜節(jié)律和代謝等多種生理功能的認(rèn)識(shí)尚不全面。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠NR1D1基因的過(guò)表達(dá)載體，并對(duì)小鼠NR1D1 蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為后續(xù)NR1D1 基因功能及其相關(guān)通路機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

8 周齡雄性ICR 小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK（京） 2016-0011。HEK293T 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。pcDNA3.1 質(zhì)粒購(gòu)于美國(guó)Promega 公司，DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、 無(wú)內(nèi)毒素小提中量試劑盒和DNA 純化回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司，ECL Super Sensitive Kit 和DiGreen Safe DNA Dye 購(gòu)于北京迪寧生物科技有限公司，THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix 和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒購(gòu)于東洋紡（上海） 生物科技有限公司，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 、 TRIzol 、XhoⅠ、DL 10 000 DNA marker 和DL 5 000 DNA marker 購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京） 有限公司，ClonExpress?ⅡOne Step Cloning Kit 購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司，BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，兔抗NR1D1 抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司，鼠抗β-actin 抗體購(gòu)于天津三箭生物技術(shù)有限公司，HRP共軛羊抗兔抗體和HRP 共軛羊抗鼠抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Striping Buffer 購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。PCR 擴(kuò)增儀、熒光定量系統(tǒng)和電泳儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)于英國(guó)Syngene 公司，核酸蛋白測(cè)定儀和CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 科技有限公司。

1.2 小鼠肝組織總RNA 提取和cDNA 獲取

選用ICR 品系8 周齡小鼠，脫頸處死后摘取肝臟，稱(chēng)取100 mg 肝臟組織加入到提前準(zhǔn)備好的TRIzol 試劑中，用組織勻漿機(jī)打碎肝組織，－ 80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用TRIzol 提取法提取肝組織中總RNA，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作獲得總RNA，用超微量分光光度計(jì)測(cè)量總RNA 濃度，取部分RNA 稀釋至200 mg·L－1。使用TOYOBO 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒并嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，獲得cDNA 樣品。反應(yīng)體系共10 μL，由模板Total RNA 5 μL、5×RT Master Mix 2 μL 和去離子水3 μL 組成。PCR 反應(yīng)程序： 37 ℃、 15 min，50 ℃、 5 min，98 ℃、5 min，4 ℃保存。獲得的cDNA 置于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 NR1D1 編碼區(qū)片段獲取和重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1 NR1D1 編碼區(qū)引物設(shè)計(jì) 從NCBI 網(wǎng)站中查找小鼠的NR1D1 編碼區(qū)序列（coding sequence，CDS），用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)其PCR 引物序列： 上游引物5′-CGATATCGGATCCGGTACCCTCGAGATGACGACCCTGGACTCCAAT A-3′，下游引物5′-GCGGTTTAAACTTACCGGTCTCGAGTCACTGGGCGTCCACCCGGAAG-3′。在NR1D1 CDS 的引物序列上下游5′端加上線(xiàn)性化pcDNA 3.1 載體兩末端的同源序列，設(shè)計(jì)的引物序列由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。

1.3.2 目的序列片段擴(kuò)增及純化回收 采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase 合成擴(kuò)增NR1D1 CDS 片段，按照其說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系：小鼠肝組織cDNA 4 μL （200 ng），5×PrimeSTAR Buffer （Mg2+Plus） 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，加去離子水補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35 次；72 ℃終延伸5 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，結(jié)束后，將符合預(yù)期的條帶凝膠切下，并按照DNA 純化回收試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將目的基因片段純化回收。

1.3.3 載體線(xiàn)性化 采用限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ將載體pcDNA3.1 線(xiàn)性化，反應(yīng)體系： pcDNA3.1 1 μL，10×QuickCut Green Buffer 2 μ L ，XhoⅠ1 μL，加去離子水補(bǔ)至20 μL。37 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)酶切產(chǎn)物，將符合預(yù)期的條帶凝膠切下并使用膠回收試劑盒回收純化線(xiàn)性化載體片段。

1.3.4 同源重組反應(yīng) 采用ClonExpress?ⅡOne Step Cloning Kit 中的Exnase Ⅱ?qū)⒒厥盏腘R1D1 CDS 片段與線(xiàn)性化載體進(jìn)行同源重組反應(yīng)。反應(yīng)體系：線(xiàn)性化pcDNA3.1 104.3 ng，NR1D1 CDS片段76 ng，5×CE ⅡBuffer 4 μ L ，Exnase Ⅱ2 μL，加去離子水補(bǔ)至20 μL。37 ℃反應(yīng)30 min，結(jié)束后立即4 ℃條件下保存。

1.3.5 重組質(zhì)粒的擴(kuò)增、提取和鑒定 采用DH5α感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至DH5α內(nèi)，在含30 mg·L－1羧芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基平板上涂布培養(yǎng)，12～16 h 之后挑取單克隆菌落，將其放入37 ℃恒溫?fù)u床中擴(kuò)增12 h。采用無(wú)內(nèi)毒素小提中量試劑盒按其說(shuō)明書(shū)提取重組質(zhì)粒，并按照“1.3.3” 中方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI 中的序列進(jìn)行比對(duì)。

1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞

HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)于含青霉素-鏈霉素-兩性霉素B 和10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基的60 mm 培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染前24 h，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T 細(xì)胞接種至2 個(gè)6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞。接種24 h 后，使用轉(zhuǎn)染試劑Turbofect 且按其說(shuō)明書(shū)操作，選取每個(gè)6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的3 個(gè)孔將pcDNA3.1 空載體和pcDNA3.1-NR1D1 重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞中，分別為對(duì)照組和pcDNA3.1-NR1D1 轉(zhuǎn)染組，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測(cè)2 組細(xì)胞中NR1D1 mRNA 表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h 后，使用TRIzol 試劑提取細(xì)胞樣品總RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄操作方法同 “1.2”。用Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)人GAPDH 和人與小鼠通用的NR1D1 引物序列，見(jiàn)表1。使用TOYOBO的THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix 并按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系： qPCR Mix 10 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 4 μL，去離子水4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性10 s，60 ℃延伸30 s，循環(huán)40 次；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸60 s，95 ℃變性15 s。采用熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)，以人GAPDH 基因作為內(nèi)參基因，采用2－△△Ct相對(duì)定量法計(jì)算目的基因mRNA 表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.6 Western blotting 法檢測(cè)2 組細(xì)胞中NR1D1 蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h 后，使用RIPA 細(xì)胞裂解液并按其說(shuō)明書(shū)操作提取細(xì)胞蛋白樣品。采用BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白濃度后加入Loading Buffer，金屬浴100 ℃、10 min；配制12% 凝膠電泳分離膠和5% 濃縮膠，取20 μg 總蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，待蛋白樣品電泳至合適位置時(shí)電泳結(jié)束；將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜；用10% 脫脂奶粉封閉2 h后，將PVDF 膜放入提前稀釋好的兔抗NR1D1 抗體中室溫?fù)u床孵育2 h，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗膜5 次，每次5 min；HRP 共軛羊抗兔二抗室溫孵育1 h，用TBST 洗膜5 次，每次5 min。將ECL 發(fā)光液滴加至膜上，曝光并拍攝保存圖像。用TBST 洗膜5 次，每次5 min，加入抗體洗脫液Striping Buffer 使其沒(méi)過(guò)PVDF 膜，洗脫15 min 后，孵育鼠抗β-actin 抗體按上述操作進(jìn)行。用ImageJ 軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin 條帶灰度值的比值代表NR1D1蛋白表達(dá)水平。

1.7 生物信息學(xué)分析

通過(guò)DNAStar 軟件將測(cè)序結(jié)果同其他物種NR1D1 CDS 序列進(jìn)行相似性比對(duì)；應(yīng)用MEGA7軟件對(duì)人、小鼠、大鼠、中國(guó)倉(cāng)鼠、黑猩猩、兔、犬、豬、馬、牛、綿羊、山羊、家貓和斑馬魚(yú)的NR1D1 CDS 序列進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；使用ExPASy （https：//web.expasy.org/protparam/）在線(xiàn)工具預(yù)測(cè)小鼠NR1D1 蛋白的理化性質(zhì)，包括理論分子質(zhì)量、分子式、原子總數(shù)、等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)、消光系數(shù)、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)和脂肪族系數(shù)； 應(yīng)用ProtScale （https：//www.expasy.org/resources/protparam） 預(yù)測(cè)小鼠NR1D1 氨基酸序列的親/疏水性；通過(guò)SingalP5.0 （https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0） 在線(xiàn)程序?qū)π∈驨R1D1 氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；通過(guò)TMHMM-2.0 （https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？ TMHMM-2.0） 在線(xiàn)程序進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)； 應(yīng)用 PhosphoSitePlus?（https：//www.cellsignal.cn/learn-and-support/phosphositeplus-ptm-database） 在線(xiàn)生物資源系統(tǒng)對(duì)小鼠NR1D1 蛋白翻譯后修飾（磷酸化和泛素化）研究提供相關(guān)信息；通過(guò)SOPMA （https：//npsa

prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=npsa_sopma.html） 在線(xiàn)程序?qū)π∈驨R1D1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)； 通過(guò)SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive） 程序?qū)π∈蠛腿薔R1D1 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并采用pyMOL 軟件對(duì)兩者相似性進(jìn)行比較。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組HEK293T 細(xì)胞中NR1D1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，2 組間樣本均數(shù)比較采取兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 目的片段獲取和載體線(xiàn)性化

以小鼠組織的cDNA 為模板，通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得帶有pcDNA3.1 同源臂的NR1D1 CDS 片段（圖1 A），瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期大?。? 898 bp） 相符。通過(guò)XhoⅠ將pcDNA3.1 載體酶切線(xiàn)性化，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。線(xiàn)性化載體條帶大小與預(yù)期結(jié)果（5 211 bp） 相符（圖1 B）。

圖1 NR1D1 CDS PCR 產(chǎn)物（A）和pcDNA3.1 載體線(xiàn)性化結(jié)果（B）鑒定Fig.1 Identification of NR1D1 CDS PCR products(A) and linearized pcDNA3.1 vector (B)

2.2 重組質(zhì)粒鑒定

使用無(wú)縫克隆酶將純化回收后NR1D1 CDS 片段連接至線(xiàn)性化的pcDNA3.1 載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α，擴(kuò)增后提取菌液中的質(zhì)粒，使用XhoⅠ將重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳后獲得與預(yù)期大小一致的2 條電泳條帶（pcDNA3.1： 5 211 bp；NR1D1 CDS：1 854 bp）。將鑒定正確的重組質(zhì)粒測(cè)序，pcDNA3.1-NR1D1 中NR1D1 CDS 片段的測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列完全一致，證明過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-NR1D1 構(gòu)建成功。

圖2 小鼠pcDNA3.1-NR1D1 重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物鑒定Fig.2 Identification of enzyme digestion products of mouse pcDNA3.1-NR1D1 recombinant plasmid

2.3 2 組細(xì)胞中NR1D1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平

分別將pcDNA3.1 和pcDNA3.1-NR1D1 轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞，48 h 后收取細(xì)胞樣品，用于提取總RNA 和總蛋白樣品。RT-qPCR 法檢測(cè)結(jié)果顯示： 與對(duì)照組比較，pcDNA3.1-NR1D1 轉(zhuǎn)染組NR1D1 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示： pcDNA3.1-NR1D1 轉(zhuǎn)染組在相對(duì)分子質(zhì)量67 000 處有明顯的條帶；與對(duì)照組比較，pcDNA3.1-NR1D1 轉(zhuǎn)染組NR1D1 蛋白表達(dá) 水 平明顯升 高（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 2 組HEK293T 細(xì)胞中NR1D1 mRNA（A）和蛋白（B）表達(dá)水平及NR1D1 蛋白表達(dá)電泳圖（C）Fig.3 Expression levels of NR1D1 mRNA(A) and protein(B) and electrophoregram(C) of expressions of NR1D1 protein in HEK293T cells in two groups

2.4 小鼠NR1D1 CDS 相似性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

采用DNAStar 軟件對(duì)小鼠NR1D1 CDS 進(jìn)行相似性分析（圖4），小鼠NR1D1 CDS 與人、大鼠、中國(guó)倉(cāng)鼠、黑猩猩、兔、犬、豬、馬、牛、綿羊、山羊、家貓和斑馬魚(yú)等不同物種的相似性分別為90.0%、 94.8%、 86.5%、 90.0%、 89.6%、88.3%、 89.7%、 89.8%、 88.8%、 89.1%、89.1%、89.7% 和65.1%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示：小鼠NR1D1 基因與中國(guó)倉(cāng)鼠、大鼠的遺傳距離最近，與斑馬魚(yú)的遺傳距離最遠(yuǎn)，進(jìn)化樹(shù)的形態(tài)與動(dòng)物分類(lèi)學(xué)基本保持一致。見(jiàn)圖5。

圖4 小鼠與其他物種NR1D1 基因序列相似性比對(duì)Fig.4 Similarity alignment of NR1D1 gene between mice and other species

圖5 小鼠NR1D1 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of mouse NR1D1 gene

2.5 小鼠NR1D1 蛋白理化性質(zhì)分析

利用ExPASy 在線(xiàn)工具中的ProtParam 對(duì)小鼠NR1D1 進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示：小鼠NR1D1 蛋白理論分子質(zhì)量為66 802.05，分子式為C2886H4553N845O914S34，原子總數(shù)是9 232 個(gè)，等電點(diǎn)（pI） 為8.66，屬于堿性蛋白； 該蛋白含有615 個(gè)氨基酸，其中絲氨酸含量最高（14.0%），色氨酸含量最低（0.5%）（表2）；在水中以波長(zhǎng)280 nm 預(yù)測(cè)消光系數(shù)為33 765，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為63.20，脂肪族系數(shù)為64.24。

表2 小鼠NR1D1 蛋白氨基酸組成Tab.2 Amino acid composition of mouse NR1D1 protein

2.6 小鼠NR1D1 蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)

利用ExPASy 在線(xiàn)工具中的ProtScale 對(duì)小鼠NR1D1 氨基酸序列的親/疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，小鼠NR1D1 氨基酸序列最低分值為－2.822 （位于第212 位氨基酸），親水性最強(qiáng)； 最高分值為2.633（位于第543 位氨基酸），疏水性最強(qiáng)；該蛋白整條肽鏈大部分屬于親水區(qū)域，表現(xiàn)為親水性，由此推測(cè)小鼠NR1D1 蛋白為親水性蛋白。見(jiàn)圖6。

圖6 小鼠NR1D1 蛋白親/疏水性Fig.6 Hydrophilicity/hydrophobicity prediction of mouse NR1D1 protein

2.7 小鼠NR1D1 蛋白信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用SingalP 5.0 程序?qū)π∈驨R1D1 氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)（圖7），該蛋白不存在信號(hào)肽。利用TMHMM Serverv.2.0 程序?qū)π∈驨R1D1 進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖8），該蛋白不存在跨膜區(qū)。

圖7 小鼠NR1D1 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.7 Signal peptide prediction of mouse NR1D1 protein

圖8 小鼠NR1D1 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Transmembrane structure prediction of mouse NR1D1 protein

2.8 小鼠NR1D1 蛋白化學(xué)修飾位點(diǎn)

采用PhosphoSitePlus?在線(xiàn)生物資源系統(tǒng)分析小鼠NR1D1 蛋白，該蛋白存在12 個(gè)磷酸化位點(diǎn)和10 個(gè)泛素化位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)至少有1 篇文獻(xiàn)數(shù)據(jù)支撐，且具有鋅指蛋白C4 型區(qū)域（zinc finger C4 type，zf-C4） 和激素受體的配體結(jié)合域。見(jiàn)圖9。

圖9 小鼠NR1D1 蛋白化學(xué)修飾位點(diǎn)Fig.9 Chemical modification sites of mouse NR1D1 protein

2.9 小鼠NR1D1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)SOPMA 在線(xiàn)程序?qū)π∈驨R1D1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖10）。小鼠NR1D1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是無(wú)規(guī)則卷曲（54.63%），α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別占26.50%、12.68% 和6.18%。通過(guò)SWISS-MODEL 程序?qū)υ摰鞍兹?jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖11），小鼠NR1D1 蛋白含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等復(fù)雜結(jié)構(gòu)。通過(guò)pyMOL 軟件對(duì)小鼠和人的NR1D1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，原子位置均方根偏差 （root-mean-square deviation，RMSD） 為0.561，表明二者三級(jí)結(jié)構(gòu)差異較小。

圖10 小鼠NR1D1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 Secondary structure prediction of mouse NR1D1 protein

圖11 小鼠NR1D1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.11 Tertiary structure prediction of mouse NR1D1 protein

3 討 論

生物鐘基因是維持內(nèi)源生物鐘系統(tǒng)節(jié)律性振蕩的基礎(chǔ)。哺乳動(dòng)物核心生物鐘基因有近20 種，主要包括BMAL1、 CLOCK、 PER1/PER2/PER3（PERs）、 隱花色素1 （cryptochrome-1，CRY1） /隱花色素2 （cryptochrome-2，CRY2）（CRYs）、NR1D1/NR1D2 （REV-ERBα/REV-ERBβ） 和視黃酸相關(guān)的孤兒受體（RAR-related orphan receptor，ROR） α/β/γ 等，通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯形成多個(gè)反饋環(huán)路來(lái)調(diào)節(jié)生物鐘基因和生物鐘控制基因的節(jié)律性表達(dá)［17］。生物鐘核心轉(zhuǎn)錄因子BMAL1 和CLOCK 以異源二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合特定DNA 順勢(shì)作用元件E-box 以激活PERs 和CRYs基因的轉(zhuǎn)錄，隨后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不斷累積的PERs 和CRYs 蛋白進(jìn)入細(xì)胞核直接抑制BMAL1-CLOCK的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。其次，在核心反饋環(huán)的外圍，BMAL1/CLOCK 通過(guò)E-box 元件促進(jìn)NR1D1 和RORα 的轉(zhuǎn)錄，而NR1D1 和RORα 蛋白分別通過(guò)與BMAL1 啟動(dòng)子特異序列REV-ERBα/RORα 結(jié)合序列直接結(jié)合，反過(guò)來(lái)分別抑制和促進(jìn)BMAL1 的轉(zhuǎn)錄［18-20］。因此，NR1D1 作為核心生物鐘基因在維持機(jī)體生物鐘系統(tǒng)的穩(wěn)定方面起到重要作用［21］。

NR1D1 基因既是生物鐘系統(tǒng)的重要組成部分又是能量代謝中的狀態(tài)依賴(lài)性調(diào)節(jié)因子，通過(guò)調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，維持機(jī)體代謝的穩(wěn)態(tài)［22-24］。大量研究［25-26］表明：NR1D1 基因缺失會(huì)引起小鼠代謝功能障礙，導(dǎo)致脂肪組織沉積、膽汁酸增加和肌肉氧化能力受損，引起相關(guān)代謝性疾病的發(fā)生。NR1D1 通過(guò)抑制載脂蛋白C3 的表達(dá)，降低了膽固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory elementbinding proteins，SREBPs） 的蛋白水解活性，進(jìn)而抑制膽固醇和脂肪酸合成中關(guān)鍵功能酶的活性，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂［27］。NR1D1 缺陷小鼠的線(xiàn)粒體數(shù)量減少、線(xiàn)粒體功能障礙以及生物合成能力不足，導(dǎo)致骨骼肌氧化能力受損而表現(xiàn)出嚴(yán)重的跑步能力下降，因此NR1D1 被認(rèn)為是一種新型骨骼肌氧化能力調(diào)節(jié)因子［28］。研究［29-30］顯示：NR1D1 還可抑制肝受體類(lèi)似物1 （liver receptor homologue-1，LRH-1），從而抑制細(xì)胞色素P450 家族7 亞科多肽1（cytochrome P450，family 7，subfamily A，polypeptide 1，CYP7A1） 催化膽汁酸合成和膽固醇分解，引起膽固醇代謝異常，并確定了NR1D1/LRH-1 軸是一種新的CYP7A1 表達(dá)和膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)通路，提示后期以NR1D1/LRH-1 軸為靶點(diǎn)可為膽固醇代謝障礙相關(guān)疾病的治療提供一種新的途徑。此外，NR1D1 可以調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答，并且還可以通過(guò)抑制自噬小體的形成和溶酶體降解來(lái)調(diào)節(jié)自噬過(guò) 程［31-32］。CHANDRA 等［33］發(fā)現(xiàn)：NR1D1 對(duì)單核細(xì)胞中白細(xì)胞介素10 （interleukin-10，IL-10） 表達(dá)有抑制作用，加速胞內(nèi)溶酶體的成熟，導(dǎo)致細(xì)菌在單核細(xì)胞內(nèi)無(wú)法生存，證明NR1D1 通過(guò)抑制IL-10 轉(zhuǎn)錄增加了巨噬細(xì)胞的殺菌能力。

NR1D1 基因在肝臟、脂肪和大腦等組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)的模式［34］，尤其在肝臟中表現(xiàn)為明顯的節(jié)律性變化。肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，本研究采用小鼠肝臟組織擴(kuò)增NR1D1 基因的CDS 序列，為后續(xù)研究NR1D1 基因與代謝之間的關(guān)系提供了理論依據(jù)。蛋白功能由氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)決定，對(duì)小鼠NR1D1 蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析可為進(jìn)一步研究NR1D1 蛋白的生理功能奠定基礎(chǔ)。NR1D1 蛋白是一種疏水堿性蛋白質(zhì)，具有12 個(gè)磷酸化位點(diǎn)和10 個(gè)泛素化位點(diǎn)，上述化學(xué)修飾位點(diǎn)可能決定了NR1D1 蛋白的相關(guān)重要生理功能。NR1D1 蛋白通過(guò)特異性鋅指結(jié)構(gòu)對(duì)特定DNA 序列進(jìn)行識(shí)別，從而對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。小鼠和人NR1D1 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)差異較小，后續(xù)可以對(duì)小鼠NR1D1 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究，為治療晝夜節(jié)律紊亂和糖脂代謝失調(diào)等相關(guān)疾病提供新的研究思路。

本研究成功構(gòu)建了pcDNA3.1-NR1D1 重組載體，并將其轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞，進(jìn)一步在mRNA 和蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證了NR1D1 的過(guò)表達(dá)。對(duì)小鼠NR1D1 CDS 區(qū)及其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析的結(jié)果顯示：NR1D1 CDS 區(qū)在小鼠、大鼠和人等多個(gè)物種中高度保守，且小鼠NR1D1 蛋白是一種疏水堿性蛋白質(zhì)，其含有12 個(gè)磷酸化位點(diǎn)和10 個(gè)泛素化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)包括無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角，與人的NR1D1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)比較差異較小。本研究結(jié)果為后續(xù)NR1D1 基因功能及其相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。