丹皮酚對大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變的改善作用及其調(diào)節(jié)miR-802-5p 表達(dá)的作用機(jī)制

孫俊波, 高 達(dá), 趙逸菲, 許 華, 邱 帆, 趙 璐

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 河南省中醫(yī)院內(nèi)科，河南 鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 鄭州 450008）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是2 型糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，可導(dǎo)致視力永久性喪失［1］。有研究［2］顯示：在2 型糖尿病患者中微小RNA （microRNAs，miR） -802-5p 表達(dá)水平明顯升高，但其是否參與DR 進(jìn)展有待進(jìn)一步研究。丹皮酚具有抗炎，抗氧化和抗動脈粥樣硬化等的生物學(xué)和藥理學(xué)活性［3］。ZHANG 等［4］發(fā)現(xiàn)：丹皮酚可激活沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)蛋白1/核因子E2 相關(guān)因子2 （silent information regulator 1/nuclear ractor E2-related factor 2，Sirt1/Nrf2），通過其抗氧化作用改善糖尿病腎病發(fā)展。此外，研究［5］顯示：丹皮酚可通過上調(diào)miR-339-5p 的表達(dá)減輕高遷移率族蛋白B1 （high mobility group protein B1，HMGB1） 和I-κB 激酶β （inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase-β，IKK-β） 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，緩解小鼠膿毒癥，提示丹皮酚可能通過調(diào)控miRNAs 表達(dá)參與疾病進(jìn)展。但丹皮酚在DR 中的作用尚未見報(bào)道。因此，本研究構(gòu)建了DR 大鼠模型和高糖（high glucose，HG） 誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs），探討丹皮酚是否通過調(diào)節(jié)miR-802-5p 表達(dá)參與DR 進(jìn)展及其可能的作用機(jī)制，為臨床治療DR 提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物無特定病原體（specefic pathogen free，SPF） 級6 周齡SD 雄性大鼠40 只，體質(zhì)量（200 ± 20） g，由河南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物使用許可證號：SYXK （豫） 2020-0004。本研究獲河南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器HRMECs 購自美國ATCC 細(xì)胞庫。丹皮酚磺酸鈉注射液購自金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，主要成分為丹皮酚磺酸鈉，輔料為依地酸二鈉、亞硫酸氫鈉和甘油，規(guī)格2 mL （0.1 g），批號180202。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、1% 青-鏈霉素、0.25% 胰蛋白酶/EDTA 消化液和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?300 購自美國Sigma 公司，MEM 培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Hyclone 公司，蛋白裂解液購自北京Solarbio科技有限公司（貨號：R0010），色素上皮細(xì)胞衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）、 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、沉默調(diào)節(jié)蛋白6（silencing regulatory protein 6，SIRT6） 和β -actin一抗及相應(yīng)二抗購自購自英國Abcam 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 試劑盒購自南京Vazyme 生物科技有限公司（貨號：Q511-02），miRNA 分離純化試劑盒購自上海伯易生物科技有限公司，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS） 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） 檢測試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司，過氧化氫酶（catalase，CAT） ELISA 檢測試劑盒購自上海梵態(tài)生物科技有限公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） ELISA檢測試劑盒購自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，CCK-8 試劑盒購自美國MCE 公司（貨號： HY-K0301），Annexin Ⅴ-FITC 檢測試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司（貨號：FA101-01）。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。高通量RT-qPCR 儀（瑞士Roche 公司），Western blotting系統(tǒng)（北京六一儀器廠DYY-7C），臺式低溫高速離心機(jī)（日本KUBOTA 公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman 公司），凝膠成像分析儀（廣州瑞豐實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 大鼠DR 模型構(gòu)建和分組40 只大鼠隨機(jī)分為對照組、DR 模型組、 15 mg·kg－1丹皮酚組和30 mg·kg－1丹皮酚組，每組10 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。造模前禁食8 h。除對照組外其余3組大鼠一次性腹腔注射1% STZ 溶液（STZ 溶于0.1 mol·L－1、pH 4.2 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液） 60 mg·kg－1構(gòu)建糖尿病大鼠模型，對照組大鼠注射等量生理鹽水。1 周后采用尾部靜脈針取血檢測大鼠空腹血糖水平。飼養(yǎng)期間每天更換小鼠墊料、飲水和飼料。以空腹血糖≥16.7 mmol·L－1且尿糖陽性者判定為造模成功，對于建模不成功的，補(bǔ)充大鼠，保證每組10 只。成功建立糖尿病模型后，采用微量進(jìn)樣器于大鼠顳側(cè)角膜緣后2 mm 處，經(jīng)睫狀體平坦部進(jìn)入玻璃體腔，緩慢注0.05 μg 乙烯基鱗片膠泥留針10 s。4 周后，眼底熒光造影檢查，出現(xiàn)血管迂曲擴(kuò)張、背景熒光增強(qiáng)和新生血管熒光滲漏等視為DR 大鼠造模成功。對照組和DR 模型組大鼠皮下注射8 mL·kg－1體質(zhì)量生理鹽水，15和30 mg·kg－1丹皮酚組大鼠皮下注射15 和30 mg·kg－1丹皮酚磺酸鈉注射液，每日1 次，共2 周。治療期間大鼠自由飲水和進(jìn)食。在末次給藥第2 天，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，處死后取出雙側(cè)眼球保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)將大鼠眼球浸入4 %多聚甲醛中固定，取視網(wǎng)膜組織進(jìn)行石蠟包埋，制備厚度約為3 μm 的石蠟切片，脫蠟水化后進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和分組將HRMECs 復(fù)蘇后，置于含10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素（100 U·mL－1青霉素和100 U·mL－1鏈霉素） 的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)，每2～3 d 更換1 次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞匯合至80% 時(shí)，采用胰蛋白酶消化重懸后按照3∶1 的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每24 h更換1 次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞匯合至70% 時(shí)，采用不同劑量（0、5、25、50、70 和100 mg·L－1） 丹皮酚分別處理細(xì)胞24 h 后檢測各組細(xì)胞活性。隨后，采用不同劑量（0、 5、 25、 50、 70 和100 mg·L－1）丹皮酚分別處理HG （33 mmol·L－1葡萄糖） 干預(yù)24 h 的細(xì)胞，并檢測細(xì)胞活性。確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中丹皮酚最適作用劑量。

1.6 CCK-8 法檢測各組細(xì)胞活性將各組細(xì)胞按照每孔1×105的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，采用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，置于37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng)。每組設(shè)5 個復(fù)孔，待細(xì)胞長至80% 融合時(shí)，于轉(zhuǎn)染后48 h加入20 μL CCK-8 溶液。培養(yǎng)24 h，用酶標(biāo)儀在波長450 nm 處檢測各組細(xì)胞的吸光度（A） 值，取平均數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性=處理組A 值/對照組A 值×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率HRMECs分為對照組、HG 組和HG+ 25 mg·L－1丹皮酚組，將各組細(xì)胞按照每孔1×105個的密度接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板12 h 后換液，進(jìn)行24 h 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。預(yù)冷PBS 緩沖液洗滌，加入預(yù)冷75% 乙醇，4 ℃固定4 h 以上。離心棄上清，PBS 緩沖液洗滌后，加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞。加入5 μL Annexin Ⅴ-EGFP 孵育15 min，再加入5 μL PI 混勻。室溫下避光反應(yīng)5～15 min。于1 h 內(nèi)，在FC-500 流式細(xì)胞儀上使用Beckman CXP 軟件檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組利用Lipofectamine?3000 分別將miR-802-5p mimic 和miR-802-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染進(jìn)HRMECs 中，以NC mimic 和NC inhibitor 陰性對照序列作為對照，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000 制造商說明書進(jìn)行。

HRMECs 分為以下各組：①對照組，細(xì)胞不做任何處理；②HG 組，細(xì)胞用33 mmol·L－1葡萄糖刺激24 h； ③HG+NC inhibitor 組，細(xì) 胞 用33 mmol·L－1葡萄糖刺激24 h 后轉(zhuǎn)染miR-802-5p inhibitor 陰性對照； ④HG+miR-802-5p inhibitor組，細(xì)胞用33 mmol·L－1葡萄糖刺激24 h 后轉(zhuǎn)染miR-802-5p inhibitor； ⑤HG+ 丹皮酚組，細(xì)胞用33 mmol·L－1葡萄糖刺激24 h 后添加25 mg·L－1丹皮酚繼續(xù)培養(yǎng)。⑥HG+丹皮酚+NC mimic 組，細(xì)胞用33 mmol·L－1葡萄糖刺激24 h后轉(zhuǎn)染miR-802-5p mimic 陰性對照，24 h 后添加25 mg·L－1丹皮酚；⑦HG+ 丹皮酚+miR-802-5p mimic 組，細(xì)胞用33 mmol·L－1葡萄糖刺激24 h 后轉(zhuǎn)染miR-802-5p mimic，24 h 后添加25 mg·L－1丹皮酚。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，裂解細(xì)胞收集蛋白，用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.9 RT-qPCR 法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織和HRMECs 中miR-802-5p 表達(dá)水平收集大鼠視網(wǎng)膜組織和各組HRMECs，采用miRNA 純化試劑盒分離純化miRNA，采用miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用miRNA qPCR 分析試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。miR-802-5p： 上游引物5′-GAATGTTGCTCGGTGA-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′； 內(nèi)參基因U6：上游引物5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。采用Applied Biosystems 7900HT qPCR 系統(tǒng)按照以下參數(shù)進(jìn)行qPCR：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸15 s，進(jìn)行35 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用2－ΔΔCt法計(jì)算大鼠視網(wǎng)膜組織和HRMECs 中miR-802-5p 表達(dá)水平。

1.10 熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-802-5p 與SIRT6 的結(jié)合將HRMECs 按照1×105cm－2密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合至80% 時(shí)，采用Lipofectamine?3000 將擴(kuò)增的SIRT6 3′ UTRWT （野生型） 和SIRT6 3′UTR-MUT （突變型）分別轉(zhuǎn)染入重組質(zhì)粒psicheck-2 中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒psicheck-2-SIRT6 3′ UTR-WT 和psicheck-2-SIRT6 3′ UTR-MUT，分別與miR-802-5p mimic 和NC mimic共轉(zhuǎn)染入HRMECs中，分為miR-802-5p+SIRT6 3′ UTR-WT、miR-802-5p+SIRT6 3′ UTRMUT 、 NC mimic+SIRT6 3′ UTR-WT 和NC mimic+SIRT6 3′ UTR-MUT 組。采用多功能酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞中螢火蟲與海腎熒光比值，代表熒光素酶活性。

1.11 RNA 免疫沉淀法檢測miR-802-5p 與SIRT6的結(jié)合使用RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞，并將100 μL 裂解物與含有磁珠的RIPA 裂解緩沖液一起溫育，上述磁珠與SIRT6 抗體（SIRT6 抗體組） 或正常小鼠IgG （IgG 組） 結(jié)合（陰性對照）。然后將蛋白酶K 緩沖液添加到樣品中以消化蛋白質(zhì)。使用TRIzol 試劑從磁珠中分離結(jié)合的RNA ，采用RT-qPCR 法檢測純化的RNA。

1.12 Western blotting 法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織和HRMECs 中SIRT6、PEDF 和VEGF 蛋白表達(dá)水平大鼠視網(wǎng)膜組織蛋白上樣工作液制備：將0.01 g 視網(wǎng)膜組織與100 μL 蛋白裂解液置于玻璃勻漿器內(nèi)，研磨后離心，吸出上清液，采用RIPA 裂解液提取組織中總蛋白，然后采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定上清液的蛋白濃度，將一定量蛋白原液和5×蛋白上樣緩沖液按比例制備（1×蛋白上樣工作液）。HRMECs 蛋白上樣工作液制備：將各組細(xì)胞按照每孔1×105的密度接種于6 孔板，24 h 后換液，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。RIPA 裂解液提取總蛋白，24 h 后采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。隨后各取30 μL 樣品進(jìn)行SDS-PAGE，再將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗VEGF （1∶10 000，ab150375）、 兔 抗PEDF（1∶10 000，ab157207）、兔抗SIRT6 （1∶2 000，ab191385） 和兔抗GAPDH （1∶2 500，ab9485）一抗，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶1 000） 37 ℃孵育45 min，用ECL 液顯影，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測，結(jié)果采用Image-Pro Plus 6 軟件（Media Cybernetics） 進(jìn)行分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參照GAPDH蛋白灰度值比值作為目的蛋白表達(dá)水平。

1.13 ELISA 法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織和HRMECs 中ROS 水平和CAT 及SOD 活性將視網(wǎng)膜組織研磨成組織勻漿，3 500 r·min－1離心15 min，取離心后上清液，－20 ℃冰箱中保存。將HRMECs 消化重懸，3 500 r·min－1離心5 min，取上清，－20 ℃冰箱中保存。采用ELISA 法檢測待檢樣本中ROS 水平（mmol·g－1） 和CAT 及SOD活性（U·mg－1），實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠視網(wǎng)膜組織和細(xì)胞中miR-802-5p 表達(dá)水平，SIRT6、VEGF 和PEDF 蛋白表達(dá)水平，ROS 水平，CAT 和SOD 活性，各組細(xì)胞活性、凋亡率和熒光素酶活性符合正態(tài)分布，均以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中miR-802-5p 表達(dá)水平與對照組比較，DR 模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中miR-802-5p 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與DR模型組比較，15 和30 mg·kg－1丹皮酚組大鼠視網(wǎng)膜組織中miR-802-5p 表達(dá)水平呈劑量依賴性降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中miR-802-5p 表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of miR-802-5p in retina tissue of rats in various groups

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SIRT6、PEDF 和VEGF 蛋白表達(dá)水平與對照組比較，DR 模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中SIRT6 和PEDF 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），VEGF 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與DR 模型組比較，15和30 mg·kg－1丹皮酚組大鼠視網(wǎng)膜組織中SIRT6 和PEDF 蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性升高（P＜0.01），VEGF蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性降低（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SIRT6、PEDF 和VEGF 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B－D）Fig.2 Electrophoregram (A) and histogram(B-D) of expressions of SIRT6, PEDF and VEGF proteins in retina tissue of rats in various groups

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中ROS 水平及CAT 和SOD 活性與對照組比較，DR 模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中ROS 水平明顯升高（P＜0.01），CAT 和SOD 活性明顯降低（P＜0.01）； 與DR 模型組比較，不同劑量丹皮酚組ROS 水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），CAT 和SOD 活性明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），且30 mg·kg－1丹皮酚組治療效果優(yōu)于15 mg·kg－1丹皮酚組。見表1。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中ROS 水平和CAT 及SOD 活性Tab.1 Levels of ROS and activities of CAT and SOD in retina tissue of rats in various groups (n=4，x±s）

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)外核層細(xì)胞排列規(guī)則，未見新生血管生成；DR 模型組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)不清晰，神經(jīng)纖維層伴水腫，內(nèi)外核層細(xì)胞排列疏松，有新生血管生成；不同劑量丹皮酚組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)較清晰，內(nèi)外核層細(xì)胞排列較整齊，新生血管生成均較模型組有明顯改善，且30 mg·kg－1丹皮酚組改善效果優(yōu)于15 mg·kg－1丹皮酚組。見圖3。

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×400）Fig.3 Pathomorphology of retina tissue of rats in various groups（HE，×400）

2.5 各組細(xì)胞活性和凋亡率與0 mg·L－1丹皮酚組比較，50、70 和100 mg·L－1丹皮酚組細(xì)胞活性呈劑量依賴性降低（P＜0.05 或P＜0.01）（圖4A）。與0 mg·L－1丹皮酚組比較，HG 組細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.01）；與HG 組比較，HG+5、25、50、70 和100 mg·L－1丹皮酚組細(xì)胞活性明顯升高（P＜0.05）（圖4B）。因此，選取對細(xì)胞無明顯毒性且高效的25 mg·L－1丹皮酚進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對照組比較，HG 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與HG 組比較，HG+丹皮酚組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。見圖5。

圖4 CCK-8 法檢測各組細(xì)胞活性Fig.4 Viabilities of cells in various groups detected by CCK-8 assay

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.6 HG 處理后各組細(xì)胞中miR-802-5p 表達(dá)水平與對照組比較，HG 組細(xì)胞中miR-802-5p 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與HG+NC inhibitor組比較，HG+miR-802-5p inhibitor組細(xì)胞中miR-802-5p表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見圖6。

圖6 各組細(xì)胞中miR-802-5p 表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of miR-802-5p in cells in various groups

2.7 miR-802-5p 靶向結(jié)合SIRT6miR-802-5p 與SIRT6 的結(jié)合序列見圖7A。熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示：與NC mimic+SIRT6 3′ UTR-WT 組比較，miR-802-5p+SIRT6 3′ UTR-WT 組熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01）； 與NC mimic+SIRT6 3′ UTR-MUT 組比較，miR-802-5p+SIRT6 3′ UTR-MUT 組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7B。RNA 免疫共沉淀結(jié)果顯示： SIRT6 抗體組miR-802-5p 的富集明顯高于IgG 組（P＜0.01）。見圖7C。

圖7 miR-802-5p 靶向結(jié)合SIRT6Fig.7 Target binding of miR-802-5p and SIRT6

2.8 各組細(xì)胞中SIRT6、PEDF 和VEGF 蛋白表達(dá)水平 與對照組比較，HG 組細(xì)胞中SIRT6 和PEDF 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），VEGF蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與HG+ NC inhibitor 組比較，HG+ miR-802-5p inhibitor 組細(xì)胞中SIRT6 和PEDF 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），VEGF 蛋白水平明顯降低（P＜0.01）。見圖8。

圖8 各組細(xì)胞中SIRT6、PEDF 和VEGF 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B—D）Fig.8 Electrophoregram (A) and histogram(B－ D) of expressions of SIRT6, PEDF and VEGF proteins in cells in various groups

2.9 各組細(xì)胞中ROS 水平和CAT 及SOD 活性與對照組比較，HG 組細(xì)胞中ROS 水平明顯升高（P＜0.01），CAT 和SOD 活性明顯降低（P＜0.01）； 與HG+NC inhibitor 組 比 較，HG+miR-802-5p inhibitor 組細(xì)胞中ROS 水平明顯降低（P＜0.01），CAT 和SOD 活性明顯升高（P＜0.01）；與HG 組比較，HG+丹皮酚組細(xì)胞中ROS水平明顯降低（P＜0.01），CAT 和SOD 活性明顯升高（P＜0.01）； 與HG+ 丹皮酚+NC mimic 組比較，HG+丹皮酚+ miR-802-5p mimic 組細(xì)胞中ROS 水平明顯升高（P＜0.01），CAT 和SOD 活性明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組細(xì)胞中ROS 水平和CAT 及SOD 活性Tab.2 Levels of ROS and activities of CAT and SOD in cells in various groups (n=4，x±s）

3 討 論

糖尿病是一種復(fù)雜的代謝性疾病，在世界范圍內(nèi)具有高發(fā)病率，并伴有各種并發(fā)癥，DR 是其主要并發(fā)癥之一［1］。越來越多的證據(jù)［6-7］ 表明：miRNA 可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)過程（細(xì)胞增殖、遷移和凋亡） 來調(diào)節(jié)DR 進(jìn)展。ZHAO 等［8］ 研究表明： miR-219-5p 通過調(diào)節(jié)肝受體類似物1 （liver receptor homolog-1，LRH-1） /Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)人視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE） 細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響DR 發(fā)展。GU 等［9］研究發(fā)現(xiàn)：抑制miR-590-3p 表達(dá)通過靶向核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1 （NLR family pyrin domain containing 1，NLRP1），并通過白細(xì)胞介素1β （interleukin-1β，IL-1β） 介導(dǎo)的正反饋環(huán)激活NADPH 氧化酶4 （NADPH oxidase 4，NOX4） /ROS/硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxininteracting protein，TXNIP） /NLRP3 通路促進(jìn)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生焦亡。一項(xiàng)研究［2］已經(jīng)從人類Ⅱ型糖尿病中鑒定出高表達(dá)的miR-802-5p，然而miR-802-5p 是否參與DR 的發(fā)病機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果表明： miR-802-5p 在HG 刺激的HRMECs 中表達(dá)上調(diào)。此外，PEDF 是絲氨酸蛋白酶抑制劑超基因家族的成員，具有新生血管抑制作用［10］，而VEGF 能夠介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致新生血管形成［11］。楊潔等［12］研究表明：VEGF 在DR 中表達(dá)上調(diào)，而miR-429 可通過下調(diào)VEGF 的表達(dá)來抑制DR 的進(jìn)展。ZHENG 等［13］研究顯示： 過表達(dá)miR-429 后，HG 誘導(dǎo)的HRMEs中PEDF 蛋白表達(dá)水平升高，VEGF 蛋白表達(dá)水平降低，HRMECs 細(xì)胞損傷得到改善，與本研究結(jié)果有類似之處。本研究結(jié)果顯示：miR-802-5p 表達(dá)抑制后，HG 刺激的HRMECs 中PEDF 表達(dá)上調(diào)，VEGF 表達(dá)下調(diào)。

SIRT6 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD） 依賴性組蛋白脫酰酶，可調(diào)節(jié)衰老、應(yīng)激反應(yīng)、癌癥、能量代謝、神經(jīng)變性和DNA 修復(fù)［14-15］。SILBERMAN 等［16］研究發(fā)現(xiàn)：SIRT6 缺陷引起視網(wǎng)膜傳播受阻，伴隨有糖酵解基因和谷氨酸受體表達(dá)的變化以及視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平升高，加速DR 進(jìn)展。ZORRILLA-ZUBILETE 等［17］研究發(fā)現(xiàn)： 過表達(dá)SIRT6 通過抑制VEGF 表達(dá)改善小鼠DR 引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平。本研究采用靶基因預(yù)測網(wǎng)站Starbase 預(yù)測結(jié)果顯示：miR-802-5p 與SIRT6 有可以互補(bǔ)結(jié)合的序列，可能是miR-802-5p 促進(jìn)SIRT6 表達(dá)下調(diào)的分子基礎(chǔ)。因此，推測miR-802-5p可能通過靶定抑制SIRT6 表達(dá)加速HRMECs 損傷和DR 大鼠進(jìn)程。

丹皮酚是一種簡單的酚類化合物，可從牡丹皮中提取，具有廣泛的抗炎、抗腫瘤、抗高血壓和抗氧化等生物和藥理活性［18-19］。研究［20］顯示：丹皮酚能夠阻滯小腸黏膜刷狀緣上皮細(xì)胞對于葡萄糖的吸收，同時(shí)促進(jìn)脂肪細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞對于葡萄糖的攝取和利用，從而降低血糖水平。CHEN 等［21］研究顯示：丹皮酚可降低STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖水平，并降低高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 和VEGF 的表達(dá)。此外，最近研究［22］顯示：丹皮酚有較強(qiáng)的抗氧化能力。ROS 是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，ROS 水平可反映細(xì)胞脂過氧化的程度［23］； SOD 同樣能夠反映細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平［24］。CAT 是存在于機(jī)體內(nèi)的一種重要的過氧化物分解酶，可使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能［25］。楊倩等［26］研究發(fā)現(xiàn)：蝦青素可有效改善HG 及低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，提高組織內(nèi)抗氧化應(yīng)激酶CAT 和SOD 活性，發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜組織細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果顯示：丹皮酚干預(yù)HG刺激的HRMECs 能夠增強(qiáng)細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡；與HG 組或DR 模型組大鼠比較，丹皮酚組細(xì)胞或組織中ROS 水平和VEGF 蛋白表達(dá)水平明顯降低，CAT 和SOD 活性及PEDF 蛋白表達(dá)水平明顯升高。此外，SUN 等［27］研究顯示：丹皮酚可通過 下調(diào)miR-155 表達(dá) 抑制Janus 激酶1 （Janus kinase 1，JAK1） /信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活蛋白1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1） 通路激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞表面標(biāo)志物因子和細(xì)胞分泌的炎癥因子分泌，而轉(zhuǎn)染miR-155 mimic 能夠拮抗丹皮酚對細(xì)胞因子分泌的影響。本研究結(jié)果顯示： 丹皮酚干預(yù)HG 刺激的HRMECs 能夠下調(diào)其miR-802-5p 的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-802-5p mimic 能夠拮抗丹皮酚對VEGF 表達(dá)的抑制作用以及對PEDF 表達(dá)的促進(jìn)作用，加速細(xì)胞損傷。

綜上所述，丹皮酚可有效改善大鼠DR，其機(jī)制可能與調(diào)控miR-802-5p/SIRT6 表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果為丹皮酚和miR-802-5p 參與DR 進(jìn)展提供了新的證據(jù)，并為DR 的治療提供了理論依據(jù)。