Bax 抑制因子1 過表達對急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機制

萬朝輝, 曾 良, 周 輝

（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬第三醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421900）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI） 是一種全球性的危重病，近些年，中國AMI 的發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升。AMI 發(fā)生的主要原因是冠狀動脈粥樣硬化引起血管阻塞和斑塊破裂，且發(fā)生過度炎癥，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和凋亡。研究［1-2］顯示：細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在心肌組織缺血區(qū)，容易觸發(fā)AMI 后心臟重構(gòu)和心力衰竭。因此，預(yù)防和減少心肌細(xì)胞凋亡可改善AMI 后心功能不全和心臟重構(gòu)，是AMI 治療的關(guān)鍵點。B 細(xì)胞淋巴瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2） 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax） 抑制劑1 （Bax inhibitor-1，BI-1） 基因定位于人類12 號染色體上，是一個單拷貝和高度保守的基因。研究［3］表明：BI-1 具有抗凋亡功能。BI-1 過表達可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠神經(jīng)評分，降低腦組織含水量［4］。研究［5］顯示：BI-1 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜的細(xì)胞內(nèi)膜生理功能有關(guān)，且BI-1 對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護作用。但BI-1 是否對AMI 心肌組織有保護作用目前尚無相關(guān)報道。本研究通過探討過表達BI-1 對AMI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，闡明其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 清潔級8 周齡SD 雄性大鼠60 只，體質(zhì)量180～220 g，購于湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （湘） 2014-0012。大鼠在18 ℃～26 ℃和相對濕度40%～70% 的SPF 環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，通風(fēng)換氣每小時8～12 次，自由飲食和攝水。BI-1 過表達質(zhì)粒（GV345） 和空載質(zhì)粒的構(gòu)建及其腺病毒包裝等均由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水酶3（cysteinyl aspartate specific proteinases-3，Caspase-3）活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TUNEL 凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗BI-1、 肌醇依賴酶1 （inositolrequiring kinase-1，IRE1）、磷酸化IRE1 （phospho rylated IRE1，p-IRE1）、Bcl-2、Bax 和β-actin 單克隆抗體購自英國ABCAM 公司，鼠抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 （glucose-regulated protein 78 ，GRP78）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） 和磷酸化JNK （phosphorylated JNK ，p-JNK） 單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司。Vevo 2100 超聲系統(tǒng)購自加拿大VisualSonics 公司，多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo 公司，2500 凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司，7500 熒光定量PCR 儀購自美國ABI公司。

1.2 實驗動物模型制備、實驗動物分組和處理采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法建立AMI 動物模型［6］。腹腔注射35 mg·kg－1戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，行頸部切口，連接呼吸機，以正壓通氣，呼吸比1∶2，潮氣量8 mL，呼吸頻率120 min－1。待大鼠呼吸平穩(wěn)后，行胸部切口，暴露心臟后結(jié)扎冠狀動脈左前降支。當(dāng)心電圖記錄儀上ST 段向上抬高呈弓背型，心率緩慢，結(jié)扎部位下方或左心室變白，說明AMI 模型制作成功。60 只大鼠隨機分為假手術(shù)組、 模型組、 空載腺病毒（Ad-NC） 組和BI-1腺病毒（Ad-BI-1） 組，每組15 只。模型組大鼠采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法建立AMI 動物模型； Ad-NC 組和Ad-BI-1 組大鼠在建模后于心肌梗死區(qū)域選擇3 個位點，分別注射10 μL 腺病毒包裝的空載質(zhì)?；駼I-1 過表達質(zhì)粒溶液（2×1010PFU·mL－1）；假手術(shù)組大鼠行切口后，只穿線不結(jié)扎冠狀動脈左前降支，同時與模型組大鼠在心肌梗死區(qū)域的相同位置注射等量生理鹽水。術(shù)后72 h待檢測心功能后，處死大鼠，取心臟置于－ 80 ℃冰箱中凍存待檢測。

1.3 大鼠心功能指標(biāo)檢測術(shù)后72 h，所有大鼠均腹腔注射35 mg·kg－1戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，用Vevo 2100 超聲系統(tǒng)檢測大鼠在3 個連續(xù)心動周期中的左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、 左室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD） 和左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD） 值。

1.4 TTC 染色法檢測大鼠心肌梗死面積百分率取凍存的大鼠心臟，沿左心室橫軸方向從心尖到結(jié)扎點，每隔2 mm 切片，每片1 mm，立刻置于1% TTC 溶液中避光孵育15 min，完成染色后洗去多余染料，拍照后，采用Image J 軟件統(tǒng)計分析梗死區(qū)面積與切片面積比值，即心肌梗死面積百分率。正常心肌組織呈紅色，梗死區(qū)心肌組織呈灰白色。

1.5 比色法檢測大鼠心肌組織中Caspase-3 活性取冷凍的結(jié)扎線以下部分大鼠左心室心肌組織，制備成組織勻漿后，根據(jù)Caspase-3 活性檢測試劑盒說明書操作，采用多功能酶標(biāo)儀檢測大鼠心肌組織中Caspase-3 活性。

1.6 TUNEL 法檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡率取冷凍的結(jié)扎線以下大鼠左心室部分心肌組織，4% 多聚甲醛固定，30% 蔗糖溶液脫水，制作成冰凍切片，滴加0.5% Triton X-100 溶液室溫孵育5 min，根據(jù)TUNEL 試劑盒操作步驟加50 μL TUNEL 檢測液、5 μL TdT 酶和45 μL 熒光標(biāo)記液，37 ℃避光孵育1 h，用PBS 緩沖液洗滌3 次后，滴加DAPI避光染核10 min，加入抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光為凋亡細(xì)胞。隨機觀察5 個陽性視野，計數(shù)100 個細(xì)胞，計算凋亡細(xì)胞所占百分率，即細(xì)胞凋亡率。

1.7 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測大鼠心肌組織中BI-1 mRNA 表達水平取適量凍存的結(jié)扎線以下大鼠左心室心肌組織，采用Trizol 法提取心肌組織中總RNA。利用一步法將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，進行RT-qPCR 擴增。BI-1：上游引 物5′-AGTTCTCCCAGATATCTCGCTC-3′，下 游引物5′-ATGGCCAGGATGACCATC-3′；β-actin ：上游引物5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游引物5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′。反應(yīng)程序：95 ℃、15 s，60 ℃、35 s，共40 個循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算大鼠心肌組織中BI-1 mRNA 表達水平。

1.8 Western blotting 法檢測大鼠心肌組織中相關(guān)蛋白表達水平取適量凍存的結(jié)扎線以下大鼠左心室心肌組織，加入預(yù)冷的RIPA 裂解液制備成組織勻漿，提取總蛋白。95 ℃蛋白變性后，取30 μg 蛋白在12 %的SDS-PAGE 膠上電泳分離，濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗兔抗BI-1 （1∶1 000）、p-IRE1 （1∶1 000）、IRE1 （1 ∶1 000）、 Bax （1 ∶500）、 Bcl-2（1 ∶500） 和β -actin （1∶5 000），鼠抗GRP78（1∶1 000）、p-JNK （1∶500） 和JNK （1∶1 000），4 ℃孵育過夜。用TBST 洗滌3 次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次后，加入增強型化學(xué)發(fā)光劑，曝光顯影，置入凝膠電泳儀中拍照并分析蛋白灰度值。采用Image-Pro 6.0 軟件計算各泳道蛋白灰度值，目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值，同時計算p-IRE1/IRE1 和p-JNK/JNK 比值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組大鼠心功能指標(biāo)LVEF、LVFS、LVEDD 和LVESD，心肌梗死面積，心肌組織中Caspase-3 活性和心肌細(xì)胞凋亡率，心肌組織中BI-1 mRNA 和蛋白表達水平，心肌組織中Bcl-2、Bax、 GRP78 蛋白表達水平和p-IRE1/IRE1 及p-JNK/JNK 比值均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEF 和LVFS 明顯降低（P＜0.05），LVEDD 和LVESD 明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Ad-BI-1 組大鼠LVEF 和LVFS 明顯升高（P＜0.05），LVEDD 和LVESD 明顯降低（P＜0.05），而Ad-NC 組大鼠上述各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)Tab.1 Indicators of heart function of rats in various groups （n=15，±s）

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)Tab.1 Indicators of heart function of rats in various groups （n=15，±s）

*P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

G r o u p S h a m o p e r a t i o n M o d e l A d-N C A d-B I-1 L V E F（η/%）8 2.1 3±2.2 6 4 6.5 2±7.5 5*4 8.0 3±4.6 7 6 6.1 5±5.0 2△L V F S（η/%）5 1.0 9±5.8 5 2 3.7 5±4.4 7*2 5.2 1±6.1 2 3 7.8 9±3.2 5△L V E D D（d/m m）5.0 8±0.3 9 7.5 2±0.6 1*7.3 8±0.8 2 5.9 5±0.4 5△L V E S D（d/m m）2.7 9±0.2 4 5.8 2±0.5 7*5.6 4±0.4 8 3.6 3±0.3 8△

2.2 各組大鼠心肌梗死面積百分率和心肌組織中Caspase-3 活性與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積百分率和心肌組織中Caspase-3 活性明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Ad-BI-1 組大鼠心肌梗死面積百分率和心肌組織中Caspase-3 活性明顯降低（P＜0.05），而Ad-NC 組大鼠上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心肌梗死面積百分率和心肌組織中Caspase-3活性Tab.2 Percentages of myocardial infarction areas and Caspase-3 activities in myocardium tissue of rats in various groups (n=15，±s）

表2 各組大鼠心肌梗死面積百分率和心肌組織中Caspase-3活性Tab.2 Percentages of myocardial infarction areas and Caspase-3 activities in myocardium tissue of rats in various groups (n=15，±s）

*P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

Group Sham operation Model Ad-NC Ad-BI-1 Percentage of myocardial infarction area (η/%)0.00±0.00 32.05±3.64*31.67±4.15 16.88±5.82△Caspase-3 activity[λB/(U·mg－1)]0.69±0.12 8.58±0.55*8.14±0.83 4.43±0.67△

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達水平與假手術(shù)組（1.53%±0.88%） 比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率（33.73%±4.68%） 明顯升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），Bax 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Ad-BI-1 組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率（15.40%±4.39%） 明顯降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），Bax 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），而Ad-NC 組大鼠上述各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1 和2。

圖1 各組大鼠心肌組織TUNEL 染色結(jié)果（×200）Fig.1 TUNEL staining results of myocardium tissue of rats in various groups（×200）

2.4 各組大鼠心肌組織中BI-1 mRNA 和蛋白表達水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中BI-1 mRNA 和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Ad-BI-1 組大鼠心肌組織中BI-1 mRNA 和蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），而Ad-NC 組大鼠心肌組織中BI-1 mRNA 和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3 和4。

圖3 各組大鼠心肌組織中BI-1 mRNA 表達水平Fig.3 Expression levels of BI-1 mRNA in myocardium tissue of rats in various groups

2.5 各組大鼠心肌組織中GRP78 蛋白表達水平和p-IRE1/IRE1 及p-JNK/JNK 比值與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中GRP78 蛋白表達水平和p-IRE1/IRE1 及p-JNK/JNK 比值明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Ad-BI-1 組大鼠心肌組織中GRP78 蛋白表達水平和p-IRE1/IRE1 及p-JNK/JNK 比值明顯降低（P＜0.05），而Ad-NC 組大鼠上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織中GRP78、p-IRE1、IRE1、p-JNK 和JNK 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.5 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of GRP78，p-IRE1，IRE1，p-JNK，and JNK proteins in myocardium tissue of rats in various groups

3 討 論

AMI 是世界范圍內(nèi)主要的心血管疾病致死原因。在中國，每年有70 多萬患者死于AMI［7］。AMI 能引起心臟供血不足，導(dǎo)致心肌壞死。研究［8-10］顯示：檢測大鼠在連續(xù)心動周期中LVEF、LVFS、LVEDD 和LVESD，若LVEF 和LVFS 降低，且LVEDD 和LVESD 升高，說明大鼠心功能出現(xiàn)異常。另外，AMI 的嚴(yán)重程度與心肌梗死面積呈正相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果表明：AMI 造模后，大鼠心功能出現(xiàn)異常，心肌梗死面積百分率明顯升高，說明成功建立AMI 大鼠模型。Caspases 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用，其中Caspase-3 是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子。在凋亡早期，Caspase-3 被激活，裂解胞漿底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11-12］。本研究結(jié)果顯示：AMI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高，凋亡蛋白Caspase-3 活性明顯升高，且抗凋亡蛋白Bcl-2 表達下調(diào)而促凋亡蛋白Bax 表達上調(diào)，說明AMI 大鼠發(fā)生心肌細(xì)胞嚴(yán)重凋亡情況。

BI-1 在正常細(xì)胞和組織中均有表達，包括心臟、大腦、胎盤、肝臟、骨骼肌、腎臟和胰腺組織［13-14］，且在細(xì)胞凋亡率高的部位優(yōu)先表達，表明局部細(xì)胞凋亡活動受到機體凋亡途徑的嚴(yán)格調(diào)控［15-16］。研究［17-19］顯示：BI-1 基因敲除可促進蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬組織的損傷并提高神經(jīng)元的凋亡率；過表達BI-1 能使缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織相對梗死面積縮小，神經(jīng)元變性減弱，有效改善缺氧缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能，且沉默BI-1表達能逆轉(zhuǎn)其保護作用；在非酒精性脂肪性肝病患者中，肝組織活檢顯示BI-1 下調(diào)；在非酒精性脂肪肝小鼠中，BI-1 基因敲除后出現(xiàn)異常的肝組織炎癥和損傷。本研究結(jié)果表明：過表達BI-1 能明顯改善AMI 大鼠心功能，有效降低心肌梗死面積百分率，并抑制心肌組織Caspase-3 活性，降低心肌細(xì)胞凋亡率，表明BI-1 通過抗凋亡作用在AMI 發(fā)展過程中起保護作用。

圖2 各組大鼠心肌組織中Bcl-2 和Bax 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.2 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of Bcl-2 and Bax proteins in myocardium tissue of rats in various groups

圖4 各組大鼠心肌組織中BI-1 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.4 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expression of BI-1 protein in myocardium tissue of rats in various groups

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過未折疊蛋白的積累觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)，導(dǎo)致促凋亡級聯(lián)的激活，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在過度和長期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，由于大量錯誤折疊的蛋白質(zhì)的積累，不飽和蛋白反應(yīng)轉(zhuǎn)向凋亡途徑，其中GRP78、JNK 和IRE-1 蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡調(diào)控途徑中的關(guān)鍵因子［15，20］。研究［17］顯示： BI-1 是一種進化上保守的蛋白，由含6 個基因的跨膜Bax 抑制劑基序編碼，是一種新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)新生大鼠腦損傷后細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)劑，并且BI-1 的保護作用是通過抑制IRE1α 信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的。BI-1 可通過調(diào)節(jié)IRE1-JNK 通路影響蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷程度［16］。上述研究結(jié)果表明：BI-1 通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，影響一些疾病的發(fā)展，但BI-1 對AMI 心肌細(xì)胞的凋亡的影響及其可能的機制尚未見報道。本研究結(jié)果顯示：過表達BI 能明顯抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑相關(guān)因子的表達，進而抑制細(xì)胞凋亡，說明BI-1 可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑活性，減輕AMI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，過表達BI-1 能有效緩解AMI 后大鼠心功能，減輕心肌細(xì)胞損傷，其機制可能與過表達BI-1 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑活性有關(guān)。