北柴胡多糖對D-gal 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

侯俊宇, 李明慧, 許夢然, 葛俊宏, 申 野, 李 坦, 孫 新

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院生物制藥教研室，吉林 吉林 132013；3.北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院社會醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生教研室，吉林 吉林 132013）

隨著我國人口老齡化速度加快和程度加深，衰老相關(guān)疾病的研究已成為熱點(diǎn)［1］。隨著年齡的增長，以腎單位丟失和腎小球?yàn)V過率下降為特征的衰老現(xiàn)象，稱為腎臟衰老。腎臟細(xì)胞衰老作為腎臟衰老和損傷的早期及晚期階段的中心過程，在衰老負(fù)荷增加的過程中引起腎臟更嚴(yán)重的氧化損傷、炎癥和纖維化，造成腎小管上皮增殖明顯減少和腎臟修復(fù)能力降低，從而導(dǎo)致慢性腎臟疾病的發(fā)生［2-5］。研究［6-7］表明：除抑制腎小管間質(zhì)的損傷、纖維化和炎癥外，維持腎臟的氧化應(yīng)激平衡亦能夠延緩慢性腎臟疾病的進(jìn)展。

北柴胡（Bupleurum Chinense DC.） 主要分布于中國東北地區(qū)，北柴胡多糖（Bupleurum chinensepolysaccharides，BCP） 是其主要生物活性成分之一，具有抗炎、抗氧化和抗衰老等藥理作用［8-11］。近年來，多種植物多糖被應(yīng)用于抑制腎臟的氧化應(yīng)激的研究之中，如青錢子多糖和沙棗多糖等［12-13］。然而，有關(guān)BCP 抑制腎臟衰老和改善腎臟氧化應(yīng)激平衡的機(jī)制尚不清楚。本研究通過綜合測定BCP 體外抗氧化活性，采用D- 半乳糖（D-galactose，D-gal） 誘導(dǎo)人腎臟近曲小管HK-2細(xì)胞構(gòu)建腎臟氧化損傷模型，探討B(tài)CP 改善腎臟氧化應(yīng)激環(huán)境進(jìn)而保護(hù)腎臟的作用機(jī)制，為BCP的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

HK-2 細(xì)胞（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物有限公司）。北柴胡干燥根（長白山特色植物種植基地），乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠），氯仿（天津凱信化學(xué)工業(yè)有限公司），正丁醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），胎牛血清、 高糖DMEM （DMEM-H） 培養(yǎng)基、F-12 細(xì)胞培養(yǎng)液、水溶性維生素E、D-gal 和二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma 公司），葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、Bradford 蛋白檢測試劑盒、FRAP 總抗氧化能力檢測試劑盒和衰老相關(guān)β - 半乳糖苷酶（senescence-associated β -galactosidase，SA- β -gal）染色試劑盒（碧云天生物科技有限公司），抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），MTT （美國Amresco 公司），其他化學(xué)試劑均為分析純。EZ 臺式凍干機(jī)（美國SIM公司），KQ-250E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），TDL-5-R 低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），MDF-U4086S －80 ℃超低溫冰箱（日本SANYO 公司），Infinite M200 PRO 酶標(biāo)儀（美國Beckman 公司），MCO-18AI CUVL-PC 二氧化碳培養(yǎng)箱（日本Panasonic 公司），TH4-200 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 BCP 的提取和純化

將500 g 柴胡干燥根用體積分?jǐn)?shù)為80% 的乙醇浸泡24 h，過濾后晾干用蒸餾水在80 ℃條件下提取3 次，每次3 h。將提取液過濾并離心，上清液通過減壓蒸發(fā)濃縮處理，加入3 倍體積的乙醇密封后在4 ℃下沉淀過夜。離心獲取沉淀后經(jīng)過減壓蒸發(fā)干燥，得到北柴胡粗提取多糖。將干燥的沉淀以5% 比例溶解在蒸餾水中，－80 ℃冷凍后在室溫下解凍，12 000 r·min－1離心6 min 后，棄去蛋白后將上清于－80 ℃條件下凍存，經(jīng)反復(fù)凍融至無蛋白沉淀析出；將氯仿和正丁醇分析純按4∶1 比例配制Sevag 溶液，以糖溶液2 倍體積的比例混合，充分振蕩1 h 后4 000 r·min－1離心15 min，回收上層糖溶液，重復(fù)操作直至中間層無蛋白析出；最后采用相對分子質(zhì)量為3 500 的透析袋流水透析24 h，冷凍干燥后得純化BCP。根據(jù)以下公式計算BCP得率［14］： BCP 得率＝mBCP/m北柴胡×100%，mBCP為BCP 質(zhì)量，m北柴胡為原北柴胡干燥根質(zhì)量。

1.3 苯酚硫酸法測定BCP 多糖含量

采用苯酚硫酸法測定BCP 總糖和葡萄糖含量［15］。取干燥葡萄糖配制濃度為100 mg·L－1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，配制成濃度為0、10、20、40、60、80 和100 mg·L－1葡萄糖溶液各1 mL； 在濃度為100 mg·L－1的BCP 溶液中先后加入15% 三氯乙酸（TCA） 1 mL 和5% TCA 5 mL 并研磨充分，3 000 r·min－1離心后向上清中加入6 mol·L－1鹽酸（HCl） 2 mL，水浴加熱（96 ℃、2 h） 后用流水冷卻至室溫，加入2 mL 氫氧化鈉（6 mol·L－1） 搖勻，記為樣品1；未經(jīng)處理的100 mg·L－1BCP 溶液為樣品2，將樣品1、樣品2 和不同濃度葡糖糖溶液依次加入6% 苯酚0.5 mL，濃硫酸2.5 mL，充分振蕩置于沸水中加熱10 min 后再室溫靜置30 min，于波長490 nm 處檢測吸光度（A） 值。以A 值為Y 軸，葡萄糖濃度為X 軸，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別將樣品1 和樣品2 的A 值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，所得X 值與BCP 濃度的比值即為BCP 的總糖含量和BCP 的葡萄糖含量。

1.4 BCP 的體外抗氧化活性檢測

1.4.1 檢測BCP 的羥自由基清除率 首先配制濃度均為6 mmol·L－1的硫酸亞鐵（FeSO4）、水楊酸和H2O2溶液，將BCP 和維生素E 分別稀釋為不同濃度（50、100、200、400、800 和1 600 mg·L－1），在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)組：依次加入不同濃度BCP 或維生素E、 FeSO4、 水楊酸和H2O2，每孔50 μL； 對照組： 依次加入不同濃度BCP 或維生素E、 FeSO4、 蒸餾水和H2O2，每孔50 μL；空白組：依次加入蒸餾水、 FeSO4、水楊酸和H2O2，每孔50 μL，按公式計算羥自由基清除率［16］。羥自由基清除率=［1－ （A1－A2） ／A0］ ×100%，A1為不同濃度BCP 或維生素E 加入FeSO4、水楊酸和H2O2后測得的A 值；A2為不同濃度BCP 或維生素E 加入FeSO4、蒸餾水和H2O2后測得的A 值；A0為蒸餾水加入水楊酸、FeSO4和H2O2后測得的A 值。

1.4.2 FRAP 法檢測BCP 的總抗氧化能力FRAP 總抗氧化能力檢測試劑盒的原理：抗氧化物能夠?qū)erric-triPyridyltriazine （Fe3+-TPTZ）還原為藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，通過測定其變色反應(yīng)后A 值的大小評估樣品中的總抗氧化能力。配制不同濃度（50、100、200、400、800 和1 600 mg·L－1）BCP 和維生素E 溶液，根據(jù)FRAP 試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后將各濃度BCP 及維生素E 的A 值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計算，即可得到BCP 的總抗氧化能力［17］。

1.4.3 檢測BCP 的抗超氧陰離子活性 采用抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒檢測BCP 清除超氧陰離子的能力，當(dāng)被測樣品中含有超氧陰離子抑制劑時，會使反應(yīng)體系呈現(xiàn)的紫紅色變淺，通過以維生素C 為標(biāo)準(zhǔn)，在波長550 nm 處測定樣品中的A 值，計算超氧陰離子活性。取濃度為0.15 g·L－1的維生素C 作為標(biāo)準(zhǔn)品，BCP、維生素E 均配制為1、5、10、15、20 和25 g·L－1濃度，配制抗超氧陰離子工作液，將工作液與樣品溶液在EP 管中混勻后，37 ℃恒溫水浴40 min 后加入顯色劑，室溫靜置10 min，檢測其A 值，按照公式計算抗超氧陰離子活性［18］?？钩蹶庪x子活性（U·g－1）=（對照A值－測定A值）／（對照A值－標(biāo)準(zhǔn)A值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.15 g·L－1）×1 000 mL×樣本測試前的稀釋倍數(shù)。

1.5 MTT 法檢測各組HK-2 細(xì)胞增殖率

1.5.1 不同濃度BCP 組HK-2 細(xì)胞增殖率 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中DMEM-H/F-12 培養(yǎng)基培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞（ 每孔7 000 個細(xì)胞，200 μL），分為對照組，25、 50、 100、 200 和400 mg·L－1BCP 組，并設(shè)空白組，各組設(shè)置6 個平行復(fù)孔，在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜。處理24 h 后，每孔加入5 g·L－1MTT 20 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，棄去上清，加入DMSO（150 μL/孔），搖床混勻后，采用酶標(biāo)儀在波長490 nm 處檢測A 值。根據(jù)公式計算各組細(xì)胞增殖率，確定BCP 最適作用濃度。細(xì)胞增殖率＝（A1－A0）／（A2－A0）×100%，A1代表實(shí)驗(yàn)組測定的A值，A2代表對照組測定的A 值，A0代表空白組測定的A 值。

1.5.2 不同作用時間不同濃度D-gal 組HK-2 細(xì)胞增殖率 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中DMEM-H/F-12 培養(yǎng)基培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞（ 每孔7 000 個細(xì)胞，200 μL），分為對照組，5、 10、20、40、80 和100 g·L－1D-gal 組，并設(shè)空白組，各組設(shè)置6 個平行復(fù)孔，D-gal 組分別處理6、 12、24 和48 h 后，每孔加入5 g·L－1MTT 20 μL，置于培養(yǎng)箱孵育4 h 后，棄去上清，加入DMSO（150 μL/孔），搖床混勻后，采用酶標(biāo)儀在波長490 nm 處檢測A 值。根據(jù)公式（同 “1.5.1”） 計算各組細(xì)胞增殖率，確定D-gal 最適作用時間和濃度。

1.5.3 各組HK-2 細(xì)胞增殖率 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中DMEM-H/F-12 培養(yǎng)基培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的HK-2 細(xì)胞（每孔7 000 個細(xì)胞，200 μL），分為對照組、D-gal 組和不同濃度（25、50、100、200 及400 mg·L－1） BCP+D-gal 組，并設(shè)空白組，各組設(shè)置6個平行復(fù)孔，采用20 g·L－1D-gal 預(yù)處理HK-2細(xì)胞24 h 后，25、 50、 100、 200 和400 mg·L－1BCP+D-gal 組加入含不同濃度BCP 的完全培養(yǎng)液再處理細(xì)胞24 h，每孔加入5 g·L－1MTT 20 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，小心吸取上清，每孔加入150 μL DMSO，搖床混勻后，采用酶標(biāo)儀在波長490 nm 處測定A 值，根據(jù)公式（同 “1.5.1”）計算各組細(xì)胞增殖率。

1.6 SA-β-gal 染色法觀察各組HK-2 細(xì)胞染色情況并計算衰老細(xì)胞百分率

采用SA-β-gal 染色試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行檢測。HK-2 細(xì)胞分為對照組、 D-gal 組、 BCP+D-gal 組和維生素E+D-gal 組。將HK-2 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔15×104個細(xì)胞），正常培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%～70%，除對照組外其余各組細(xì)胞中加入40 g·L－1D-gal （至終濃度為20 g·L－1）處理24 h，然后BCP 組細(xì)胞中加入200 mg·L－1BCP處理，維生素E 組細(xì)胞中加入200 mg·L－1維生素E 處理。處理完成后吸去上清液，用PBS 緩沖液（1 mL/孔） 清洗細(xì)胞2 次，加入固定液室溫固定15 min，PBS 緩沖液清洗3 次（每次3 min），加入染色工作液并將6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板密封在不含CO2的37 ℃培養(yǎng)箱過夜孵育，熒光顯微鏡下觀察各組HK-2 細(xì)胞染色情況。一次計數(shù)3 個隨機(jī)同一視野內(nèi)SA-β-gal 染色陽性細(xì)胞（藍(lán)色） 和所有細(xì)胞的數(shù)量后分別取平均數(shù)（重復(fù)操作3 次），衰老細(xì)胞百分率為SA-β-gal 染色陽性細(xì)胞數(shù)與同視野下細(xì)胞總數(shù)比值的百分率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。BCP 的葡萄糖含量、羥自由基清除率、總抗氧化能力和抗超氧陰離子活性，各組細(xì)胞增殖率和衰老細(xì)胞百分率均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BCP 得率和含量

采用水提醇沉法，得到的水溶性粗多糖為深褐色粉末，質(zhì)量為29.9 g。粗提取水溶性多糖的比重為干料的5.98%。經(jīng)反復(fù)凍融處理并結(jié)合Sevag 法脫蛋白后，對純化BCP 進(jìn)一步分析其抗氧化活性。

計算并得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程y=0.007 8x－0.029 4，R2=0.995 5。當(dāng)BCP 濃度為100 mg·L－1時，樣品1 的A 值為0.43±0.01，根據(jù)公式計算，提取的BCP 總糖含量為60.12%±2.01%；樣品2 的A 值為0.11±0.02，根據(jù)公式計算，BCP 的葡萄糖含量為（17.96±1.93） % 。見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 BCP 的抗氧化活性

2.2.1 BCP 的羥自由基清除率 50～1 600 mg·L－1BCP 和維生素E 的羥自由基清除率呈濃度依賴性增加。與相同濃度維生素E 組比較，不同濃度BCP 組羥自由基清除率明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度BCP 組和維生素E 組羥自由基清除率Fig.2 Hydroxyl radical scavenging rates in different concentrations of BCP groups and vitamin E groups

2.2.2 BCP 的總抗氧化能力 FRAP 標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.000 5x+1.125 3，R2=0.993 9，將不同濃度BCP 組的A 值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，BCP 和維生素E在50～1 600 mg·L－1范圍內(nèi)的總抗氧化能力呈濃度依賴性增強(qiáng)。與相同濃度維生素E 組比較，不同濃度BCP 組總抗氧化能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。見圖3。

圖3 不同濃度BCP 組和維生素E 組FRAP 標(biāo)準(zhǔn)曲線（A）和總抗氧化能力（B）Fig.3 FRAP standard curve(A) and total antioxidant capacities(B) in different concentrations of BCP groups and vitamin E groups

2.2.3 BCP 的抗超氧陰離子活性 1～25 g·L－1BCP 和1～25 g·L－1維生素E 的抗超氧陰離子活性呈濃度依賴性增加。與相同濃度維生素E 組比較，不同濃度BCP 組抗超氧陰離子活性明顯增加（P＜0.05）。見圖4。

圖4 不同濃度BCP組和維生素E組抗超氧陰離子活性Fig.4 Anti-superoxide anion activities in different concentrations of BCP groups and vitamin E groups

2.3 各組HK-2 細(xì)胞增殖率

處理HK-2 細(xì)胞24 h 后，與對照組比較，25～400 mg·L－1BCP 組細(xì)胞增殖率呈濃度依賴性升高（P＜0.05），且200 mg·L－1BCP 組HK-2 細(xì)胞增殖率最高。見圖5。

圖5 不同濃度BCP 組HK-2 細(xì)胞增殖率Fig.5 Proliferation rates of HK-2 cells in different concentrations of BCP groups

加入5～100 g·L－1D-gal 分別處理HK-2 細(xì)胞6、12、24 和48 h 后，與對照組比較，不同濃度D-gal組HK-2 細(xì)胞增殖率明顯降低，且呈時間-濃度依賴性降低（P＜0.05），D-gal 濃度為20 g·L－1、作用時間為48 h 時，細(xì)胞增殖率降低至對照組的64.77%。本研究選用20 g·L－1D-gal 處理48 h 作為D-gal 誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的條件。見表1。

表1 不同作用時間不同濃度D-gal 組HK-2 細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of HK-2 cells in different concentrations of D-gal groups at different time (n=3，±s，η/%）

表1 不同作用時間不同濃度D-gal 組HK-2 細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of HK-2 cells in different concentrations of D-gal groups at different time (n=3，±s，η/%）

*P＜0.05 compared with control group.

Group Control D-gal(g·L－1)5 10 20 40 80 100 Proliferation rate of HK-2 cells(t/h) 6 100.00±2.97 93.59±3.94*89.97±1.64*85.82±2.18*81.03±2.79*75.13±2.16*69.64±3.20*12 100.00±2.08 92.39±1.88*87.59±1.35*85.92±1.68*81.01±1.24*71.06±0.93*64.30±1.27*24 100.00±0.02 90.87±2.02*82.72±2.27*74.41±1.57*68.42±1.60*58.92±0.78*53.36±1.09*48 100.00±0.04 85.28±3.54*75.90±2.04*64.77±1.31*58.24±3.44*37.08±1.07*27.81±0.81*

與對照組比較，D-gal 組HK-2 細(xì)胞增殖率明顯降低（P＜0.05）； 與D-gal 組比較，100～400 mg·L－1BCP+D-gal 組HK-2 細(xì)胞增殖率呈濃度依賴性升高（P＜0.05 或P＜0.01），且200 和400 mg·L－1BCP 對D-gal 誘導(dǎo)后的HK-2 細(xì)胞損傷保護(hù)作用最明顯，考慮減弱藥物毒性作用的因素，因此選擇200 mg·L－1作為BCP 后續(xù)相關(guān)研究的處理劑量。見圖6。

圖6 各組HK-2 細(xì)胞增殖率Fig.6 Proliferation rates of HK-2 cells in various groups

2.4 各組HK-2 細(xì)胞中衰老細(xì)胞百分率

與對照組比較，D-gal 組細(xì)胞中SA-β-gal 染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，衰老細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.05）；與D-gal 組比較，BCP+D-gal 組和維生素E+D-gal 組細(xì)胞中SA-β-gal 染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，衰老細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.05）。見圖7 和8。

圖7 各組HK-2 細(xì)胞中衰老細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)Fig.7 Morphology of senescent cells of HK-2 cells in various groups

3 討 論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體受到多因素的有害刺激（衰老過程） 時，體內(nèi)高活性分子如活性氧簇（reactive oxygen species，ROS） 等產(chǎn)生過多，氧化系統(tǒng)產(chǎn)生大量自由基如超氧陰離子、H2O2、羥自由基和脂質(zhì)過氧化物，自由基不斷增加的累積趨勢以及自由基清除機(jī)制的障礙或減弱導(dǎo)致細(xì)胞的抗氧化能力降低，進(jìn)而引起不同程度的細(xì)胞毒性反應(yīng)，造成DNA、蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì)的過氧化，使細(xì)胞功能受損和活力減退，最終導(dǎo)致組織損傷，引起相關(guān)疾病［19-22］。本研究通過提取BCP，測定BCP 的體外抗氧化活性，同時利用20 g·L－1D-gal 構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型，采用SA-β-gal 染色實(shí)驗(yàn)探討B(tài)CP對D-gal 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

本研究采用水提醇沉法提取BCP，粗提取多糖得率為5.98%，與盧嬌嬌［23］和TONG 等［11］的研究結(jié)果（5.6% 和6.3%） 相近；通過Seavg 法得到純化BCP，葡萄糖含量為17.96%±1.93%，略高于關(guān)皎等［24］研究結(jié)果（15.76%±0.04%）；檢測羥自由基清除率、總抗氧化能力和抗超氧陰離子活力的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：同等濃度條件下，BCP 的抗氧化水平均明顯高于維生素E。

圖8 各組HK-2 細(xì)胞中衰老細(xì)胞百分率Fig.8 Percentages of senescent cells of HK-2 cells in various groups

研究［25-26］顯示：D-gal 能夠被半乳糖氧化酶分解成過氧化氫和醛糖，最終生成超氧陰離子。本研究結(jié)果表明：BCP 具有較明顯的抗氧化活性和促進(jìn)細(xì)胞增殖能力，與相關(guān)研究［27-28］結(jié)論一致。同時，本研究結(jié)果顯示：BCP 在明顯增強(qiáng)HK-2 細(xì)胞活性和促進(jìn)細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改善了D-gal 處理48 h 模擬的氧化應(yīng)激環(huán)境，保護(hù)HK-2 細(xì)胞維持細(xì)胞正?；钚约吧砉δ?。衰老狀態(tài)的特征在于大量溶酶體蛋白的上調(diào)和溶酶體含量的增加，SA-β-gal 活性被用作替代標(biāo)記物，用于檢測衰老細(xì)胞的溶酶體含量［29］。本研究結(jié)果顯示：BCP 具有較明顯的抗衰老作用。細(xì)胞在衰老過程中會不斷產(chǎn)生ROS 并引起積聚，而過多的ROS 破壞氧化應(yīng)激平衡，影響細(xì)胞正常的生理結(jié)構(gòu)及功能［30］，因此本研究推測：BCP 通過延緩細(xì)胞衰老，恢復(fù)細(xì)胞活性，減緩ROS 對細(xì)胞所產(chǎn)生的損害，進(jìn)而對氧化應(yīng)激所致的HK-2 細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

研究［31］表明： BCP 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中通過抑制p53 和p16 信號通路的激活改善了D-gal 誘導(dǎo)衰老小鼠的腎臟指數(shù)下降。TONG 等［11］研究發(fā)現(xiàn)：對從BCP 中分離出的一種糖添加硫酸基團(tuán)修飾，其抗氧化能力明顯提升，抑制了過氧化氫誘導(dǎo)的小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。NEZU 等［32］研究表明：轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 的激活，在保護(hù)腎臟減輕氧化損傷的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但是BCP 在延緩腎臟衰老的過程中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究證實(shí)：BCP 具有較強(qiáng)體外抗氧化活性，能夠通過抗衰老作用抑制D-gal 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞氧化損傷。本研究為探索BCP 抑制氧化應(yīng)激的作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，為長白山特色藥物北柴胡的開發(fā)和利用提供了參考依據(jù)。