北五味子乙素對(duì)大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用及其PI3K/Akt/P27kip1 信號(hào)通路機(jī)制

劉春旭, 孫紅霞, 胡 波, 姜恩平

（1.北華大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，吉林 吉林 132011；3.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，廣東 東莞 523808）

以心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblast，CFb）增殖和膠原過度沉積為特征的心臟間質(zhì)重構(gòu)是心肌纖維化發(fā)生的主要因素。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ） 作用于CFb 上的血管緊張素Ⅰ型受體，通過激活一系列細(xì)胞信號(hào)通路導(dǎo)致心肌纖維化［1-2］。研究［3-4］顯示：作為經(jīng)典的信號(hào)通路，磷酯酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） /蛋白激酶B （protein kinase B，即Akt） 在細(xì)胞增殖、遷移、分化和血管生成等方面發(fā)揮重要作用，并參與肺、肝臟、腎臟和胰腺等多種器官的纖維化過程。采用醛固酮、AngⅡ和他汀類藥物干預(yù)CFb 的實(shí)驗(yàn)［5］結(jié)果顯示：PI3K/Akt 信號(hào)通路參與其病理生理過程。P27kip1 蛋白作為細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)節(jié)因子能影響細(xì)胞周期的變化，研究［6-7］顯示：P27 （P27kip1） 在左室肥厚中起重要作用并參與心血管細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)。五味子乙素（Schisandrin，SchB） 是北五味子中含量最高的聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素，五味子具有收斂固澀、益氣養(yǎng)津和安神寧心等諸多藥理學(xué)作用［8］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究［9］結(jié)果表明： SchB 具有抑制CFb 增殖和膠原蛋白分泌作用。本研究通過在細(xì)胞水平上觀察SchB 對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CFb 增殖、細(xì)胞周期和Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、PI3K、Akt 及P27kip1 蛋白表達(dá)的影響，以闡明其是否通過PI3K/Akt/P27kip1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路拮抗AngⅡ誘導(dǎo)CFb 的增殖作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器出生1～3 d 的SD 大鼠乳鼠，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK- （ 吉）2007-0003。SchB （成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)：61281-37-6），胰蛋白酶購自杭州浦泰生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco 公司，AngⅡ和四氮唑鹽（MTT） 購自美國Sigma 公司，PI3K 抑制劑LY249002、化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL）和PI3K、 Akt、 磷酸化Akt （phosphorylation Akt，p-Akt） 及P27kip1 單克隆抗體購自賽默飛世爾科技公司，IMDM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司。MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱購自日本松下公司，酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN 公司，CX33 倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司，Attune NxT 流式細(xì)胞儀購自美國Invitrogen 公司，超凈工作臺(tái)購自山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)取出生1～3 d 的SD 大鼠心室組織，胰酶消化，收集細(xì)胞，置于含100 mL·L－1胎牛血清的IMDM 培養(yǎng)基中，在5% CO2、37 ℃及飽和濕度條件下培養(yǎng)60～90 min。采用差速貼壁法，分離CFb，加入含100 mL·L－1胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)倒置顯微鏡、透射電鏡和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)，纖維連接蛋白染色陽性和α - 平滑肌肌動(dòng)蛋白染色陰性，鑒定為所需的CFb，純度達(dá)98%，生長(zhǎng)近融合時(shí)按1∶3 傳代，實(shí)驗(yàn)采用2～4 代細(xì)胞。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞分為5 組。對(duì)照組：IMDM培養(yǎng)基不加藥物；模型組：培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1 μmol·L－1的AngⅡ； LY294002 組： 培養(yǎng)基中加入0.1 μmo·L－1AngⅡ和10 μmol·L－1LY294002；SchB 組：培養(yǎng)基中同時(shí)加入10 μmol·L－1SchB 和0.1 μmol·L－1AngⅡ；LY294002+SchB 組：培養(yǎng)液 中 加 入0.1 μmol·L－1Ang Ⅱ、 10 μmol·L－1LY294002 （ AngⅡ刺 激 前30 min 給 藥） 和10 μmol·L－1SchB。

1.4 MTT 比色法檢測(cè)各組CFb 增殖抑制率各組細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組8 復(fù)孔，藥物干預(yù)24 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入5 g·L－1MTT 10 μL，待形成藍(lán)紫色的結(jié)晶沉淀后加入DMSO 150 μL 使沉淀降解，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A） 值，采用只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零；根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組的A 值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=［1－ （實(shí)驗(yàn)孔A 值－空白孔A 值） /（對(duì)照孔A 值－空白孔A 值）］ ×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期CFb 百分率作用24 h 后，收集各組細(xì)胞，－20 ℃、70%乙醇過夜后，冰浴，離心，重懸于PBS 緩沖液，取適量細(xì)胞懸液加入RNA 酶，37 ℃水浴30 min，加入碘化丙啶染液，暗處冰浴30 min。上機(jī)前采用300 目尼龍網(wǎng)過濾。根據(jù)碘化丙啶所標(biāo)記的DNA含量確定細(xì)胞所處的周期。計(jì)算不同細(xì)胞周期CFb胞百分率。以增殖指數(shù)（proliferation index，PI）表示CFb 的增殖活性，計(jì)算公式：PI=（S+G2/M） /（G0/G1+S+G2/M） ×100%。采用Cell Quest 軟件獲取數(shù)據(jù)，采用Modifit LT 軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.6 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組CFb 中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平將傳代培養(yǎng)的CFb放入預(yù)先放置有幾張7 mm×7 mm 蓋玻片的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。各種處理因素作用24 h 后，將生長(zhǎng)有CFb 的蓋玻片取出后采用PBS 緩沖液洗滌2 次，冷丙酮固定10 min，晾干后用中性樹脂固定于載玻片上。采用SP 法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。陽性反應(yīng)呈棕黃色細(xì)密顆粒，陰性對(duì)照采用PBS緩沖液取代一抗染色為陰性。采用全自動(dòng)圖像分析儀，在每組隨機(jī)選擇4～6 個(gè)高倍視野自動(dòng)計(jì)數(shù)約100 個(gè)細(xì)胞，采用Media Cybernetics 公司的Image-ProPlus 5.0 圖像分析軟件分析各組CFb 中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的平均A 值，以平均A 值代表Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)各組CFb 中PI3K、Akt、p-Akt 和P27kip1 蛋白表達(dá)水平各處理因素分別作用于24 h 后，收集各組細(xì)胞，蛋白提取采用12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，100 V 、20 mA 電轉(zhuǎn)移2 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%BSA 封閉2 h，加入1∶1 000 稀釋的小鼠抗大鼠PI3K、p-Akt/Akt 和P27kip1 單克隆抗體（一抗），4 ℃孵育過夜，用1∶200 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體（二抗），室溫孵育2 h，洗膜，ECL 曝光顯影，顯色后采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析，以各目的蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組CFb 增殖抑制率，不同細(xì)胞周期CFb 百分率和PI，各組CFb 中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、PI3K、Akt、p-Akt 和P27kip1 蛋白表達(dá)水平經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組CFb 增殖抑制率與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，LY294002 組、 SchB 組和LY294002+SchB 組細(xì)胞增殖抑制率明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 各組CFb 增殖抑制率Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of CFb in various groups （n=7，±s）

表1 各組CFb 增殖抑制率Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of CFb in various groups （n=7，±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model LY294002 SchB LY294002+SchB Inhibitory rate of proliferation（η/%）0 53.56±7.32*33.70±5.28△29.74±4.77△48.27±5.39△△

2.2 各組不同細(xì)胞周期CFb 百分率和PI與對(duì)照組比較，模型組G0/G1期CFb 百分率明顯降低（P＜0.01），S 期CFb 百分率和PI 明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，LY294002 組、SchB 組和LY294002+SchB 組G0/G1期CFb 百分率明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），S 期CFb 百分率和PI 明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）； 與LY294002 組比較，LY294002+SchB 組G0/G1期CFb 百分率明顯升高（P＜0.05），S 期CFb 百分率和PI 明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組不同細(xì)胞周期CFb 百分率和PITab.2 Percentages of CFb at different cell cycles and PI in various groups （n=7，±s，η/%）

表2 各組不同細(xì)胞周期CFb 百分率和PITab.2 Percentages of CFb at different cell cycles and PI in various groups （n=7，±s，η/%）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group；＃P＜0.05 compared with LY294002 group.

G r o u p C o n t r o l M o d e l L Y 2 9 4 0 0 2 S c h B L Y 2 9 4 0 0 2+S c h B P e r c e n t a g e o f C F b G 0/G 1 8 3.2±3.6 7 3.6±7.4*7 8.4±3.2△8 5.1±2.6△△9 2.7±4.7△△#S 1 0.4±3.2 2 0.7±6.5*1 5.8±2.5△1 2.3±2.6△5.3±1.8△△＃G 2/M 6.5±1.6 5.7±1.9 5.8±2.3 2.6±2.3 2.0±3.2 P I 1 6.8±3.8 2 6.4±4.2*2 1.6±4.3△1 4.9±4.2△7.3±3.1△△#

2.3 各組CFb 中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組CFb 中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，LY294002 組、 SchB 組和LY294002+SchB 組CFb 中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與LY294002 組比較，LY294002+SchB 組CFb 中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見表3和圖1。

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組CFb 中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)情況(×400)Fig.1 Expressions of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen proteins in CFb in various groups detected by immunocytochemical staining method (×400)

表3 各組CFb 中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of typeⅠcollagen and typeⅢcollagen proteins in CFb in various groups （n=7，±s）

表3 各組CFb 中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of typeⅠcollagen and typeⅢcollagen proteins in CFb in various groups （n=7，±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group；＃P＜0.05 compared with LY294002 group.

Group Control Model LY294002 SchB LY294002+SchB TypeⅠcollagen 0.66±0.13 1.57±0.15*0.83±0.19△0.68±0.07△△0.47±0.06△△＃Type Ⅲcollagen 0.59±0.08 1.29±0.14*0.53±0.17△0.47±0.04△△0.37±0.05△△＃

2.4 各組CFb 中PI3K、Akt、p-Akt 和P27kip1 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組CFb 中PI3K 和p-AKT 蛋 白 表達(dá) 水 平 明顯 升 高（P＜0.01），P27kip1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，LY294002 組、SchB 組和LY294002+SchB 組CFb 中PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），P27kip1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與LY294002 組比較，LY294002+SchB 組CFb 中PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），P27kip1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。各組CFb 中Akt 蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中PI3K、Akt、p-Akt 及P27kip1 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B－D）Fig.2 Electrophoregram(A) and histogram(B-D) of expressions of PI3K,Akt,p-Akt and P27kip1 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

心肌纖維化以CFb 轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞進(jìn)而過度增殖和膠原蛋白分泌增加為主要特征，并參與心室重塑。在眾多促CFb 增殖信號(hào)通路中，PI3K/Akt 發(fā)揮重要作用。研究［10-13］顯示：PI3K/Akt 信號(hào)通路參與AngⅡ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和阿霉素等所致的心肌肥厚和纖維化過程。本研究結(jié)果顯示：正常狀態(tài)下，CFb 中PI3K 和Akt 表達(dá)水平相對(duì)較低，經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后，PI3K 和p-Akt 表達(dá)水平明顯升高，采用PI3K 抑制劑LY294002 作用后，PI3K/Akt 蛋白表達(dá)水平明顯降低，下游纖維化指標(biāo)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)CFb的增殖、遷移和轉(zhuǎn)化受到抑制，提示PI3K/Akt 信號(hào)通路介導(dǎo)并參與了AngⅡ誘導(dǎo)CFb 增殖過程［5］。

P27 蛋白是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)控G1/S 期調(diào)控點(diǎn)阻滯細(xì)胞于G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖［7，14-15］。有文獻(xiàn)［7，16-20］報(bào)道： P27kip1 上調(diào)在AngⅡ誘導(dǎo)的心血管細(xì)胞肥大中起重要作用，AngⅡ通過激活PI3K 和信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STATs） 等信使分子，進(jìn)而控制下游一系列蛋白酶的激活和失活，抑制P27kip1 蛋白的合成，加速其降解，使P27kip1 蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞得以通過G1/S 限制點(diǎn)進(jìn)入S 期，完成分裂增殖過程。

SchB 是五味子中含量較高的活性單體成分之一，本課題組前期研究［21-22］顯示：SchB 具有鎮(zhèn)靜催眠、清除氧自由基、抗氧化抗衰老和降脂保肝等諸多藥理學(xué)作用，同時(shí)SchB 也能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFb 增殖，但有關(guān)作用機(jī)制尤其是信號(hào)通路報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，PI3K抑制劑LY294002 能明顯抑制AngⅡ促使的CFb 增殖和Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維分泌，降低PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)，上調(diào)P27kip1 蛋白表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期使細(xì)胞增殖受阻，表明AngⅡ誘導(dǎo)CFb 增殖作用是通過激活PI3K/AKT/P27 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的；SchB 組CFb 增殖受到抑制，膠原蛋白分泌減少，PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平降低，P27kip1 蛋白表達(dá)水平升高，說明SchB 能夠通過抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路，提高下游信號(hào)分子P27kip1 表達(dá)，抑制CFb 增殖和膠原的沉積；LY294002 與SchB 共同作用后，可使AngⅡ刺激下的CFb 增殖進(jìn)一步降低，同時(shí)膠原表達(dá)水平明顯下降，細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞百分率明顯升高，S 期細(xì)胞百分率明顯降低，說明上述阻斷作用進(jìn)一步加強(qiáng)，但與對(duì)照組比較，各項(xiàng)指標(biāo)未恢復(fù)到正常水平。本研究中，與LY294002 組比較，LY294002+SchB 組PI3K、 p-Akt 和P27kip1 蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在LY294002基礎(chǔ)上，SchB 可能通過其他途徑阻斷PI3K/Akt 通路的激活，也可能是SchB 與LY294002 協(xié)同通過阻斷PI3K 和Akt 蛋白表達(dá)從而抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)CFb 增殖和膠原分泌作用，表明細(xì)胞中PI3K 和Akt 活性受到抑制后，AngⅡ誘導(dǎo)的CFb 增殖受阻；與模型組比較，LY294002 組和SchB 組細(xì)胞中PI3K 和Akt 蛋白表達(dá)水平雖有不同程度降低，但與對(duì)照組比較，各項(xiàng)指標(biāo)未降到正常水平。本研究結(jié)果提示：SchB 只是部分阻斷PI3K/Akt 通路的激活，除PI3K/Akt 參與AngⅡ促CFb 增殖過程外，可能還有其他的通路存在［23-26］。

綜上所述，AngⅡ通過作用于CFb 的AT1 受體，激活PI3K/Akt 通路，抑制下游信號(hào)分子P27kip1 蛋白表達(dá)，促進(jìn)CFb 增殖和膠原合成，誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生。SchB 通過部分抑制PI3K/Akt 通路的激活，提升P27kip1 蛋白表達(dá)水平，降低CFb 增殖和膠原蛋白的合成及分泌，拮抗AngⅡ的部分生物活性，通過阻斷PI3K/Akt 信號(hào)通路及調(diào)控P27kip1 蛋白表達(dá)使細(xì)胞周期停滯于靜止期，使細(xì)胞增殖受阻，從而抑制心肌纖維化的發(fā)生。