miR-150-5p 在糖尿病腎病模型小鼠腎組織中的表達(dá)和對(duì)小鼠足細(xì)胞MPC5 損傷的影響及其機(jī)制

朱 妤, 王晶晶, 吳 芳

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院 國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)科，浙江 杭州 310003；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心腎臟內(nèi)科，浙江 杭州 310003）

目前，糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）已經(jīng)成為導(dǎo)致嚴(yán)重終末期腎病的最常見(jiàn)原因之一［1］。DN 的主要腎臟臨床特征包括腎小球功能障礙、腎小球硬化和腎小球?yàn)V過(guò)功能障礙等。其中，足細(xì)胞損傷在早期DN 的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用［2］。足細(xì)胞主要位于腎小球基底膜的外表面，是一種構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障的高度分化的上皮細(xì)胞，增殖能力弱。已有研究［3］證實(shí)：足細(xì)胞損傷可導(dǎo)致DN 患者出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿和腎小球?yàn)V過(guò)率（glomerular filtration rate，GFR）下降。因此，干預(yù)導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能會(huì)延緩DN的進(jìn)展。

微小RNA （microRNAs，miRNAs） 是一類(lèi)短單鏈（含21～25 個(gè)核苷酸） 的非編碼RNA，其可通過(guò)與靶mRNA 的3′- 非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR） 互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［4］。目前，已發(fā)現(xiàn)多種miRNAs 與包括DN 在內(nèi)的多種腎臟疾病有關(guān)［5-6］。有研究［7］表明： miR-150-5p 可以抑制血管內(nèi)皮生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 及其受體的表達(dá)，而敲除miR-150-5p 可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［8］表明：眼內(nèi)注射miR-150-5p 模擬物（mimic） 可明顯降低病理性新生血管的生成。在腎臟疾病的小鼠中，敲除miR-150-5p 可加重腎損傷［9］。Targetscan軟件（http：//www.targetscan.org/vert_80/） 分析顯示：miR-150-5p 與腦酸溶性蛋白1 （brain acid soluble protein 1，BASP1） 的3′-UTR 區(qū)存在潛在的結(jié)合序列。已有研究［10-11］表明：DN 患者的腎組織中BASP1 表達(dá)水平增加，且與腎小管上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。研究［12］顯示：BASP1 在發(fā)育成熟的小鼠腎組織中主要表達(dá)于足細(xì)胞。miR-150-5p 可能在DN 腎損傷中起重要作用，但miR-150-5p 是否通過(guò)調(diào)節(jié)足細(xì)胞中BASP1 的表達(dá)影響DN 的發(fā)生發(fā)展尚不明確。本研究探討miR-150-5p 和BASP1 對(duì)高糖（high glucose，HG） 環(huán)境誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的影響以及二者的關(guān)系，為闡明DN 的進(jìn)展及其機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、主要試劑和儀器20 只7～8 周齡SPF 級(jí)雄性昆明小鼠（體質(zhì)量20～25 g） 購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （浙） 2019-0001。小鼠足細(xì)胞系MPC5 購(gòu)自通派（上海） 生物科技有限公司。D-葡萄糖、鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 和干擾素-γ （interferon-γ，IFN-γ）（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司），胎牛血清（美國(guó)HyClone 公司），RPMI-1640 培養(yǎng)基、1% 青霉素/鏈霉素雙抗和Lipofectamine 2000 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司），Bradford 蛋白分析試劑盒（美國(guó)Bio-Rad 公司），BASP1 抗體（美國(guó)Abcam 公司），突觸足蛋白（synaptopodin） 抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司），GAPDH 和HRP-羊抗兔IgG 抗體（上海碧云天生物科技有限公司），Alexa Fluor 488 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 和Alexa Fluor 594 標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（美國(guó)Proteintech 公司），CCK-8 活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），活性氧（reactive oxygen，ROS） 和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒（上海心語(yǔ)生物科技有限公司），miRcute miRNA 提取分離試劑盒、SYBR Green SuperReal PreMix Plus 試劑盒和快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖校ū本┨旄萍加邢薰荆?，一步法PrimeScript miRNA cNDA 合成試劑盒（日本TaKaRa 公司），miR-150-5p mimic、miRNA 陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-150-5p 抑制物（miR-150-5p inhibitor）、BASP1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pc-DNA3.1-BASP1）、 陰性對(duì)照質(zhì)粒（pc-DNA3.1-SC） 和pmirGLO 雙螢光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）。Synergy H4 Hybrid 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司），微垂直電泳-電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司），7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems 公司），BX53 顯微鏡（日本Olympus 公司），LSM 980 with Airyscan激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)ZEISS公司），CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.2 小鼠DN 模型構(gòu)建和分組小鼠飼養(yǎng)在條件可控的SPF 級(jí)動(dòng)物房（溫度22 ℃～25 ℃，濕度55%～70%，12 h 光照/黑暗交替循環(huán)），在給予特殊飲食前可自由飲水?dāng)z食。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后，隨機(jī)選取8 只小鼠作為對(duì)照組，其余12 只小鼠用于構(gòu)建DN 模型。按照參考文獻(xiàn)［13］ 方法：DN 模型組小鼠采用高脂飲食喂養(yǎng)5 周后，連續(xù)3 d 腹腔注射STZ （50 mg·kg－1·d－1），采用血糖儀監(jiān)測(cè)尾靜脈血的空腹血糖水平，空腹血糖水平＞300 mg·dL－1后再給予高脂飲食喂養(yǎng)12 周，出現(xiàn)多飲、 多食、多尿、體質(zhì)量下降、空腹血糖＞300 mg·dL－1和持續(xù)性蛋白尿時(shí)則表明DN 模型構(gòu)建成功。本研究中DN 模型組小鼠全部造模成功。對(duì)照組小鼠采用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，且不注射STZ。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法觀察各組小鼠腎組織中BASP1 蛋白表達(dá)情況各組小鼠麻醉后處死，并收集腎臟組織。腎臟組織經(jīng)4% 多聚甲醛固定和石蠟包埋后制成4 μm 厚的切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇梯度水合后，3% H2O2室溫孵育10 min 封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗滌5 min×2 次，10%山羊血清37 ℃封閉30 min，室溫孵育BASP1 抗體（1∶200） 30 min，PBS 緩沖液洗滌5 min×3 次。37 ℃孵育生物素化的二抗（1∶100） 40 min，PBS緩沖液洗滌5 min×3 次。37 ℃孵育SAB 復(fù)合物（1∶200） 40 min，PBS 緩沖液洗滌5 min×3 次。DAB 顯色后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水和透明后，顯微鏡下觀察BASP1 蛋白表達(dá)情況。

1.4 免疫熒光染色法觀察各組小鼠腎組織中BASP1 與足細(xì)胞共定位情況取各組小鼠腎組織的石蠟切片（厚度4 μm），脫蠟至水，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶（步驟同“1.3”），室溫分別孵育BASP1 抗體（1∶100） 和synaptopodin 抗體（足細(xì)胞標(biāo)記物，1∶100） 30 min 后再4 ℃過(guò)夜，PBS 緩沖液洗滌5 min×3 次。分別室溫避光孵育Alexa Fluor 488 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 和Alexa Fluor 594 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體（1∶200） 45 min，PBS 緩沖液洗滌5 min×3 次?？篃晒獯銣鐒┓馄?，激光共聚焦顯微鏡下觀察BASP1 與足細(xì)胞共定位情況。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和處理MPC5 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1% 青霉素/鏈霉素和10 U·mL－1IFN-γ的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。將MPC5 細(xì)胞接種在不含IFN-γ的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)2 周以誘導(dǎo)分化成熟，分為對(duì)照組（5.5 mmol·L－1D-葡萄糖）和不同時(shí)間HG組，不同時(shí)間HG 組采用30 mmol·L－1D-葡萄糖分別處理足細(xì)胞12、24、48 和72 h。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-150-5p 與BASP1 的靶向關(guān)系通過(guò)Targetscan 預(yù)測(cè)miR-150-5p 與BASP1 的假定結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑⑴cmiR-150-5p 預(yù)測(cè)的假定結(jié)合序列的BASP1-3′-UTR 進(jìn)行點(diǎn)突變后，采用PCR 擴(kuò)增。將BASP1 的野生型（WT） 3′-UTR 和BASP1 的突變體（MUT） 3′-UTR 克 隆 到 表 達(dá) 熒 光 素 酶 的pmirGLO 載體下游，分別構(gòu)建BASP1-WT 或BASP1-MUT 熒光素酶載體。使用Lipofectamine 2000 將miR-150-5p mimic 或miR-NC 和BASP1-WT 或BASP1-MUT 熒光素酶載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入足細(xì)胞中。48 h后，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)分析各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性×100%。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組將已誘導(dǎo)分化成熟的足細(xì)胞分為正常條件+miR-NC （Con+NC） 組、 HG條件+miR-NC （HG+NC） 組、 HG 條件+miR-150-5p mimic （HG+mimic） 組、 HG 條件+miR-150-5p mimic+pc-DNA3.1-SC （HG+mimic+SC）組和HG 條件+miR-150-5p mimic+pc-DNA3.1-BASP1 （HG+mimic+BASP1） 組。用Lipofectamine 2000 試劑分別將miR-NC、 miR-150-5p mimic、 pc-DNA3.1-SC 和 pc-DNA3.1-BASP1 轉(zhuǎn)染相應(yīng)各組足細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，采用HG （30 mmol·L－1D-葡萄糖） 繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.8 RT-qPCR 法檢測(cè)各組小鼠腎組織和各組細(xì)胞中miR-150-5p 表達(dá)水平采用miRcute miRNA 提取分離試劑盒提取各組小鼠腎組織和各組細(xì)胞中miRNA 富集的小RNA，然后通過(guò)一步法PrimeScript miRNA cNDA 合成試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將上述cDNA 和各自的引物序列，采用SYBR ?Green PCR Master Mix 在7500 RTqPCR 系統(tǒng)上進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。引物序列：miR-150-5p，正 向 引 物5′-CATGGCCCTGTCTCCCAAC-3′，反向引物5′-GGCCTGTACCAGGGTCTGA-3′； U6，正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。以U6 為內(nèi)參對(duì)照，采用2－△△Ct法計(jì)算miR-150-5p 表達(dá)水平。miR-150-5p 表達(dá)水平＝實(shí)驗(yàn)組組織和細(xì)胞中miR-150-5p 表達(dá)水平/對(duì)照組組織和細(xì)胞中miR-150-5p 表達(dá)水平×100%。

1.9 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中BASP1蛋白表達(dá)水平采用RIPA 裂解緩沖液裂解各組細(xì)胞，并提取總蛋白。通過(guò)Bradford 蛋白分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每樣本取等量（60 μg） 蛋白在12%SDS-PAGE 凝膠電泳，將電泳分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。采用5% 脫脂奶粉封閉后，將膜分別與BASP1 抗體（1∶2 000） 和GAPDH 抗體（1∶8 000） 在4 ℃條件下孵育過(guò)夜。采用TBST 洗滌5 min×3 次后，將其與HRP- 羊抗兔IgG 抗體（1∶2 000） 室溫孵育2 h。采用TBST洗滌10 min×3 次后，采用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白條帶。以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算BASP1 蛋白表達(dá)水平。BASP1 蛋白表達(dá)水平=BASP1 蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值×100%。

1.10 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞活性將MPC5 細(xì)胞以5 000 個(gè)/孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按照“1.7” 分組方法處理后，每孔分別加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處各孔吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性=各處理組A值/（Con+NC）組A值×100%。

1.11 ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS 水平和LDH活性按照ELISA 分析試劑盒說(shuō)明書(shū)中的步驟，檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS 水平和LDH 活性。

1.12 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率取各組MPC5 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL－1，采用PBS 緩沖液洗滌后，重懸于500 μL 結(jié)合緩沖液中。依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和5 μL PI 試劑混勻，在室溫避光條件下染色15 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠腎組織和各組細(xì)胞中miR-150-5p 表達(dá)水平，各組細(xì)胞中BASP1 蛋白表達(dá)水平、相對(duì)熒光素酶活性、細(xì)胞活性、ROS 水平、LDH 活性和細(xì)胞凋亡率均符合正態(tài)分布，以±s表示，2組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2 組小鼠腎組織中和不同時(shí)間HG 組細(xì)胞中miR-150-5p 表達(dá)水平與對(duì)照組（99.64%±6.45%） 比較，DN 組小鼠腎組織中miR-150-5p 表達(dá)水平（37.42%±4.43%）明顯降低（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，不同時(shí)間HG 組細(xì)胞中miR-150-5p 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），且呈時(shí)間依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞中miR-150-5p 表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of miR-150-5p in MPC5 cells in various groups （n=4，±s，η/%）

表1 各組細(xì)胞中miR-150-5p 表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of miR-150-5p in MPC5 cells in various groups （n=4，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control HG (t/h)12 24 48 72 miR-150-5p expression level 100.76±8.25 83.65±3.78*71.93±6.84**49.29±9.88**25.63±3.02**

2.2 2 組小鼠腎組織中BASP1 蛋白表達(dá)情況和不同時(shí)間HG 組細(xì)胞中BASP1 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，DN 組小鼠腎組織的腎小球中BASP1 富集表達(dá)，足細(xì)胞減少（足細(xì)胞標(biāo)記物Synaptopodin的熒光強(qiáng)度減弱），BASP1與腎小球足細(xì)胞存在共定位，且足細(xì)胞中BASP1 表達(dá)強(qiáng)度升高（Synaptopodin 與BASP1 共定位的細(xì)胞中BASP1 熒光表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)）。見(jiàn)圖1 和2。與對(duì)照組比較，隨著HG 處理時(shí)間延長(zhǎng)，不同時(shí)間HG 組MPC5 細(xì)胞中BASP1 蛋白表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖1 2 組小鼠腎組織BASP1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（Bar=50 μm）Fig.1 Results of BASP1 immunohistochemical staining in kidney tissue of mice in two groups（Bar=50 μm）

圖3 各組細(xì)胞中BASP1蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.3 Electrophoregrams（A）and histogram(B) of expressions of BASP1 protein in cells in various groups

圖2 2 組小鼠腎組織BASP1 免疫熒光染色結(jié)果（Bar=50 μm）Fig.2 Results of BASP1 immunofluorescence staining in kidney tissue of mice in two groups（Bar=50 μm）

2.3 BASP1 與miR-150-5p 的靶向關(guān)系BASP1-3′-UTR 區(qū)存在與miR-150-5p 堿基互補(bǔ)結(jié)合的序列（圖4A）。與miR-NC+BASP1-3′-UTR WT 組比較，miR-150-5p mimic+BASP1-3′-UTR WT 組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01）；與miR-NC+BASP1-3′-UTR MUT 組 比 較，miR-150-5p mimic+BASP1-3′-UTR MUT 組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4B）。與miR-NC 組比較，miR-150-5p mimic 組細(xì)胞中BASP1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），miR-150-5p inhibitor 組細(xì)胞中BASP1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

圖4 預(yù)測(cè)的BASP1-3′-UTR 區(qū)與miR-150-5p 結(jié)合位點(diǎn)（A）和各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性（B）Fig.4 Predicted binding sites of BASP1-3′-UTR region and miR-150-5p (A) and relative luciferase activities in cells in various groups (B)

圖5 各組細(xì)胞中BASP1 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.5 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of BASP1 protein in cells in various groups

2.4 各組細(xì)胞活性、細(xì)胞中ROS 水平及LDH 活性和細(xì)胞凋亡率與Con+NC 組比較，HG+NC 組細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.01），細(xì)胞中ROS 水平及LDH 活性和細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.01）；與HG+NC 組 比 較，HG+mimic 組 和HG+mimic+SC 組細(xì)胞活性明顯升高（P＜0.01），細(xì)胞中ROS 水平及LDH 活性和細(xì)胞凋亡率均明顯降低（P＜0.01），HG+mimic組與HG+mimic+SC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）； 與HG+mimic+SC 組比較，HG+mimic+BASP1 組細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.01），細(xì)胞中ROS水平及LDH活性和細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞活性、細(xì)胞中ROS 水平及LDH 活性和細(xì)胞凋亡率Tab.2 Cell viabilities, ROS levels,LDH activities,and apoptotic rates of cells in various groups （n=3，-x±s，η/%）

3 討 論

DN 作為糖尿病患者最重要的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率隨著糖尿病發(fā)病率的升高呈逐年上升趨勢(shì)，且已經(jīng)成為終末期腎病的第二大病因［1］。由于DN患者存在一系列復(fù)雜的代謝紊亂，一旦進(jìn)展為終末期腎病，治療將十分困難。因此，迫切需要尋找針對(duì)DN 的有效治療靶點(diǎn)來(lái)為臨床治療提供策略。足細(xì)胞在維持腎小球結(jié)構(gòu)及其濾過(guò)功能方面具有重要作用，但由于其分裂能力有限，其受損后對(duì)腎臟功能的影響難以恢復(fù)［14］。近來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)［5，15-16］表明：miRNAs 在調(diào)節(jié)足細(xì)胞功能方面發(fā)揮了重要作用。研究［15］顯示：miR-30s 缺失可致足細(xì)胞損傷并導(dǎo)致蛋白尿。另有研究［16］顯示：在糖尿病患者中miR-150-5p、miR-146a 和miR-424 表達(dá)水平均降低。miR-150-5p 也被證明在肥胖患者體內(nèi)呈低表達(dá)［8］。本研究結(jié)果顯示：miR-150-5p 在DN 小鼠的腎組織和HG 刺激下的MPC5 細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而引入外源性miR-150-5p mimic 則可通過(guò)減少細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來(lái)減輕HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。在早期的DN 病理改變中，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是足細(xì)胞耗竭消失的主要原因［17-19］。本研究證實(shí)：過(guò)表達(dá)miR-150-5p 可抑制HG 誘導(dǎo)的MPC5 細(xì)胞的活性降低和凋亡。因此，上調(diào)miR-150-5p 的表達(dá)可能是延緩DN 的重要策略之一。

miRNAs 一般通過(guò)負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［4，20］。本研究結(jié)果顯示： BASP1 是miR-150-5p 的靶基因。BASP1 在腎組織中表達(dá)，且其高表達(dá)能促進(jìn)DN 小鼠腎小管進(jìn)一步損傷［11］。本研究結(jié)果顯示：BASP1 在DN 小鼠的腎組織中高表達(dá)，其表達(dá)與腎小球足細(xì)胞存在共定位，且足細(xì)胞中BASP1 表達(dá)升高，該結(jié)果同樣在HG 刺激的MPC5 細(xì)胞中得到驗(yàn)證。另外，本課題組前期研究［21］顯示：在DN 模型中，足細(xì)胞特異性BASP1敲除能降低足細(xì)胞損傷；在細(xì)胞模型中，BASP1過(guò)表達(dá)能促進(jìn)HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示： miR-150-5p 過(guò)表達(dá)能降低MPC5 細(xì)胞中BASP1 的表達(dá)；在HG 條件下，BASP1 上調(diào)可抑制miR-150-5p 對(duì)MPC5 細(xì)胞的保護(hù)作用。本研究結(jié)果說(shuō)明：miR-150-5p 通過(guò)下調(diào)BASP1 的表達(dá)來(lái)抑制HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

綜上所述，miR-150-5p 在DN 小鼠的腎組織以及HG 刺激的足細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而外源性上調(diào)miR-150-5p 可通過(guò)靶向BASP1 來(lái)減輕HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。