lncRNA-NORAD 表達對食管癌Eca-109 細胞生物學行為的影響及其機制

周超鋒, 周世繁, 田 青, 王 賽, 李洪霖, 馬純政

（河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450002）

食管癌是一種高侵襲性腫瘤。目前食管癌主要有2 種組織學類型，即食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cancer，ESCC） 和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，ECA）。ESCC 作為食管癌的主要組織學類型主要發(fā)生在亞洲，占食管癌的90% 以上。由于缺乏可行的診斷策略，目前確診時的食管癌患者多為晚期，其5 年生存率非常低［1］。長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 是一個長度為200 個核苷酸的非編碼RNA 轉錄體家族，與各種類型癌癥的病理發(fā)展有關［2］。研究［3］顯示：lncRNA 生物學功能豐富，廣泛參與生物體各類重要生理過程。研究［4］表明：lncRNA 參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展，lncRNA-尿路上皮癌胚抗原1 （urothelial carcinoma antigen 1，UCA1） 在食管癌中作為性別決定基因相關HMG盒基因4 （sex determination gene associated with HMG box gene 4，Sox4） 的競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA） 促進細胞增殖。lncRNA- 漿細胞瘤轉化遷移基因1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1） 的高表達通過誘導上皮- 間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT） 促進食管癌的侵襲［5］。DNA 損傷誘導的非編碼RNA （non-coding RNA activated by DNA damage，NORAD） 是一種保守的lncRNA，在不同癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的生物學功能。NORAD通過抑制miR-202-5p參與結直腸癌進展［6］，通過調控miR-214/蛋白激酶B （protein kinase B，PKB） /哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）軸促進胃癌細胞增殖，抑制胃癌細胞凋亡［7］。近年來越來越多的研究［8-9］顯示： miR-26a-5p 參與了胰腺導管腺癌、肝癌和結直腸癌等的發(fā)展，而且在骨肉瘤U2OS 細胞和骨髓干細胞中NORAD 與miR-26a-5p 具有靶向作用。然而，NORAD 與miR-26a-5p 在食管癌中的研究甚少，且NORAD是否通過miR-26a-5p 發(fā)揮作用尚不清楚。本文作者分析NORAD 在食管癌細胞中的表達模式和生物學功能，探討食管癌的發(fā)病機制，為尋找食管癌有價值的治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源收集在本院行手術治療的45 例食管癌患者癌組織和40 例食管癌患者的癌旁正常組織標本。研究對象納入標準：術前未接受放化療等任何形式的抗腫瘤治療，且經過病理診斷確診為食管癌的患者，排除有食管癌家族史和經過放化療等治療的患者。本研究通過本院倫理委員會審批（審批號：20190723016），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 細胞、主要試劑和儀器食管癌Eca-109 細胞和人正常食管鱗狀上皮Het-1A 細胞購于北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司。青-鏈霉素購于北京拜爾迪生物技術有限公司（貨號：30-002-CI），MTT檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司（貨號：C0009S），DMEM 培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號：PM150210B），NORAD小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）、pcDNA-3.1 （+）、 pcDNA-NORAD 和Unc-51 樣自噬激活激酶1 （Unc-51 - like autophagy activates kinase 1，ULK1） siRNA 質粒由北京擎科生物公司合成，模擬物對照（mimics NC）、 抑制劑對照（inhibitor NC）、 miR-26a-5p 抑制劑（miR-26a-5p inhibitor） 和miR-26a-5p 模擬物（miR-26a-5p mimics） 購于上海GenePharma 公司，ULK1 抗體購自英國Abcam 公司（貨號：229909）。熒光定量PCR 儀購于美國Bio-Rad 公司（貨號：CFX96）。

1.3 雙熒光素酶報告基因實驗檢測NORAD 與miR-26a-5p 的靶向關系采用miRanda 數據庫檢測NORAD 與miR-26a-5p 的結合位點，將NORAD 結合位點的野生序列（NORAD WT） 和突變序列（NORAD MUT） 雙熒光素酶報告載體pmirGLO分別與miR-26a-5p mimics 和mimics NC 共轉染至Eca-109 細胞，檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.4 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-26a-5p 與ULK1 的靶向關系采用TargetScan 數據庫檢測miR-26a-5p 與ULK1 的結合位點，再將含有ULK1結合位點的野生序列（ULK1 WT） 和突變序列（ULK1 MUT） 雙熒光素酶報告載體分別與miR-26a-5p mimics 和mimics NC 共轉染至Eca-109細胞，檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.5 細胞培養(yǎng)和轉染取出4 ℃放置的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌Eca-109 細胞和人正常食管鱗狀上皮Het-1A 細胞，所有培養(yǎng)瓶中均加入10% 胎牛血清及100 U·mL－1青-鏈霉素，于37 ℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿中長滿的Eca-109 細胞按照5×104/孔的密度接種到12 孔細胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)12 h，棄培養(yǎng)基，用無胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基覆蓋細胞，按照Turbofect 試劑說明書步驟，將不同的質粒分別轉染至Eca-109 細胞，轉染48 h 后采用實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 法檢測細胞轉染效率，收集有效細胞用于后續(xù)實驗。

根據實驗目的和轉染質粒的不同，Eca-109 細胞分為siRNA NC 組 和NORAD siRNA 組，inhibitor NC 組和miR-26a-5p inhibitor 組；雙熒光素酶報告基因實驗檢測NORAD 與miR-26a-5p 的靶向關系后，將Eca-109 細胞分為pcDNA-3.1（+） + mimics NC 組、pcDNA-NORAD+mimics NC 組、pcDNA-3.1 （+） +miR-26a-5p mimics 組和pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics 組； 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-26a-5p 與ULK1 的靶向關系后，將Eca-109 細胞分為siRNA NC 組和ULK1 siRNA 組，siRNA NC+inhibitor NC 組、NORAD siRNA+inhibitor NC 組、 siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor 組和NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor 組。

1.6 RT-qPCR 法檢測食管癌患者癌組織、癌旁正常組織和不同細胞中NORAD mRNA、miR-26a-5p和ULK1 mRNA 表達水平取癌組織和癌旁正常組織，收集各組對數生長期細胞，采用TRIzol 技術提取組織和細胞中總RNA，紫外分光光度法檢測RNA 質量和水平，利用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，實驗重復3 次，以GAPDH 為內參，采用2－△△Ct法計算目的基因mRNA 相對表達水平。引物序列：NORAD 上游引物5′-TCCCATCACCATCTTCCAGG-3′（237 bp），NORAD下游引物5′-CCGTTGTCGTCAGGACTAGGTAGG-3′（224bp）；miR-26a-5p 上游引物5′-ATGGTTCGTGGGTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3′ （168 bp） ，miR-26a-5p 下游引物5′-GCAGGGTCCGAGGTATTCG-3′ （153 bp）； GAPDH 上游引物5′-CAAGGACCTCTACGCCAACAC-3′ （135 bp），GAPDH 下游引物5′-TGGAGGCGCGATGATCTT-3′（126 bp）。

1.7 MTT 法檢測各組細胞活性將各組細胞按照1×105mL－1的密度分別接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后，再向孔內加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，結晶充分溶解后，采用酶標儀測定波長570 nm 處的吸光度（A） 值，計算各組細胞活性。細胞活性=實驗組A 值/對照組A 值×100%。

1.8 Transwell 法檢測各組細胞中侵襲細胞數收集各組對數期轉染成功的Eca-109 細胞，調整細胞懸液密度為1×105mL－1，采用基質凝膠涂覆Transwell 上室，靜置12 h，Transwell 上室中加入細胞懸液（不含胎牛血清），Transwell 下室中加入培養(yǎng)基（含20% 胎牛血清），在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出上室，用PBS 緩沖液洗滌后置于4% 多聚甲醛中固定10 min，再用PBS 緩沖液洗滌3 次，結晶紫溶液染色，用蒸餾水漂洗，倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，計數細胞數，取平均值，即侵襲細胞數。

1.9 Western blotting 法檢測各組細胞中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和ULK1蛋白表達水平采用裂解液裂解各組細胞，提取各組細胞蛋白，測定所提取的蛋白濃度。采用沸水使細胞蛋白充分變性，冷卻后取適量的蛋白凝膠進行SDS-PAGE 電泳實驗，電泳結束后，通過濕轉儀器將蛋白轉印到PVDF 膜上，利用PBST （含5%脫脂奶粉） 在4 ℃條件下孵育，膜上加入一抗，孵育2 h，在PVDF 膜上加入稀釋的二抗，1 h 后用TBST 清洗后加入ECL 顯影，采用Image J 軟件進行灰度值分析，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。不同組織和各組細胞中NORAD mRNA、miR-26a-5p 和ULK1 mRNA 表達水平，各組細胞活性、侵襲細胞數、細胞熒光素酶活性及E-cadherin、N-cadherin 和ULK1 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以x±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，2 組間樣本均數比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 食管癌組織和細胞中NORAD mRNA、miR-26a-5p 和ULK1 mRNA 表達水平食管癌組織中NORAD 和ULK1 mRNA 表達水平（2.12±0.35和2.18±0.34） 明顯高于癌旁正常組織（1.11±0.65 和1.09±0.66）（P＜0.01），Eca-109 細胞中NORAD 和ULK1 mRNA 表達水平（2.07±0.34和1.93±0.25） 明顯高于Het-1A 細胞（1.31±0.21 和1.35±0.27）（P＜0.01）。食管癌組織中miR-26a-5p 表達水平（0.49±0.48） 明顯低于癌旁正常組織（1.16±0.44）（P＜0.01），Eca-109 細胞中miR-26a-5p 表達水平（0.51±0.15） 明顯低于Het-1A 細胞（1.28±0.46）（P＜0.01）。

2.2 沉默NORAD 實驗各組細胞中NORAD mRNA 表達水平、細胞活性、侵襲細胞數和細胞中E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表達水平與siRNA NC 組比較，NORAD siRNA 組細胞中NORAD mRNA 表達水平和細胞活性明顯降低（P＜0.01），侵襲細胞數明顯減少（ P＜0.01 ），細胞中E-cadherin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），N-cadherin 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。見表1 和圖1 及2。

表1 沉默NORAD 實驗各組細胞中NORAD mRNA 表達水平、細胞活性和侵襲細胞數Tab.1 Expression levels of NORAD in cells,cell viabilities and number of invasion cells in various groups in silencing experiment (n=9，±s）

表1 沉默NORAD 實驗各組細胞中NORAD mRNA 表達水平、細胞活性和侵襲細胞數Tab.1 Expression levels of NORAD in cells,cell viabilities and number of invasion cells in various groups in silencing experiment (n=9，±s）

*P＜0.01 compared with siRNA NC group.

Group SiRNA NC NORAD siRNA NORAD mRNA 1.18±0.57 0.50±0.43*Cell viability(η/%)68.53±3.68 42.75±6.25*Number of invasion cells 80.56±7.58 35.82±8.26*

圖1 沉默NORAD 實驗Transwell 法檢測各組細胞侵襲情況(結晶紫, ×200）Fig.1 Invasion of cells in various group detected by Transwell assay in NORAD silencing experiment(Crystal violet,×200）

2.3 NORAD 與miR-26a-5p 的靶向關系采用miRcode 數據庫預測NORAD 與miR-26a-5p 的結合位點（圖3）。與NORAD WT+mimics NC 組比較，NORAD WT+miR-26a-5p mimics 組細胞熒光素 酶 活 性 明 顯 降 低（P＜0.01）； 與NORAD MUT+mimics NC 組 比 較，NORAD MUT+miR-26a-5p mimics 組細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明NORAD 與miR-26a-5p之間具有靶向關系。見圖4。

圖3 NORAD 與miR-26a-5p 的結合位點Fig.3 Binding sites of NORAD and miR-26a-5p

圖4 雙熒光素酶報告基因實驗檢測NORAD 與miR-26a-5p 靶向關系時各組細胞熒光素酶活性Fig.4 Luciferase activities of cells in various groups in dual luciferase reporter gene assay for detecting target relationship between NORAD and miR-26a-5p

2.4 沉默miR-26a-5p 實驗各組細胞中miR-26a-5p表達水平、細胞活性、侵襲細胞數和細胞中E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表達水平與inhibitor NC 組比較，miR-26a-5p inhibitor 組細胞中miR-26a-5p 表達水平明顯降低（P＜0.01），細胞活性明顯升高（P＜0.01），侵襲細胞數明顯增加（P＜0.01），細胞中E-cadherin 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），N-cadherin 蛋白表達表達水平明顯升高（P＜0.01）。見表2 和圖5 及6。

圖2 沉默NORAD 實驗Western blotting 法檢測各組細胞中E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.2 Electrophoregram(A) and histogram (B) of expressions of E-cadherin and N-cadherin proteins in cells in various groups detected by Western blotting methods in NORAD silencing experiment

表2 沉默miR-26a-5p 實驗中各組細胞中miR-26a-5p 表達水平、細胞活性和侵襲細胞數Tab.2 Expression levels of miR-26a-5p in cells,cell viabilities and number of invasion cells in various groups in miR-26a-5p silencing experiment (n=9，±s）

表2 沉默miR-26a-5p 實驗中各組細胞中miR-26a-5p 表達水平、細胞活性和侵襲細胞數Tab.2 Expression levels of miR-26a-5p in cells,cell viabilities and number of invasion cells in various groups in miR-26a-5p silencing experiment (n=9，±s）

*P＜0.01 compared with inhibitor NC group.

Group Inhibitor NC MiR-26a-5p inhibitor miR-26a-5p 1.16±0.28 0.52±0.26*Cell viability(η/%)62.86±4.53 85.28±5.36*Number of invasion cells 50.58±7.26 98.29±6.56*

圖5 沉默miR-26a-5p 實驗Transwell 法檢測各組細胞侵襲情況(結晶紫, ×200）Fig.5 Invasion of cells in various groups detected by Transwell assay in miR-26a-5p silencing experiment(Crystal violet ,×200）

圖6 沉默miR-26a-5p 實驗Western blotting 法檢測各組細胞中E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.6 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of E-cadherin and N-cadherin in cells in various groups detected by Western blotting method in miR-26a-5p silencing experiment

2.5 上調NORAD 和miR-26a-5p 實驗各組細胞活性、侵襲細胞數和細胞中E-cadherin 及N-cadherin蛋白表達水平與pcDNA-3.1（+）+mimics NC組比較，pcDNA-NORAD+mimics NC 組細胞活性明顯升高（P＜0.01）、 侵襲細胞數明顯增加（P＜0.01），pcDNA-3.1 （+） +miR-26a-5p mimics 組細胞活性明顯降低（P＜0.01）、侵襲細胞數明顯減少（P＜0.01）；與pcDNA-3.1 （+） +miR-26a-5p mimics 組 比 較，pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics 組細胞活性明顯升高（P＜0.01），侵襲細胞數明顯增加（P＜0.01）。與pcDNA-3.1 （+） +mimics NC 組比較，pcDNA-NORAD+mimics NC組細胞中E-cadherin 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）、 N-cadherin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），pcDNA-3.1 （+） +miR-26a-5p mimics 組細胞中E-cadherin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）、 N-cadherin 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）；與pcDNA-3.1 （+） +miR-26a-5p mimics組比較，pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics 組細胞中E-cadherin 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），N-cadherin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。見表3 和圖7 及8。

圖7 上調NORAD 和miR-26a-5p 實驗Transwell 法檢測各組細胞侵襲情況(結晶紫, ×200）Fig.7 Invasion of cells in various groups detected by Transwell assay in up-regulated NORAD and miR-26a-5p experiment（Crystal violet ,×200）

表3 上調NORAD 和miR-26a-5p 實驗中各組細胞活性和侵襲細胞數Tab.3 Cell viabilities and number of invasion cells in various groups in up-regulated NORAD and miR-26a-5p experiment(n=9，±s）

表3 上調NORAD 和miR-26a-5p 實驗中各組細胞活性和侵襲細胞數Tab.3 Cell viabilities and number of invasion cells in various groups in up-regulated NORAD and miR-26a-5p experiment(n=9，±s）

*P＜0.01 compared with pcDNA-3.1（+）+mimics NC group ；△P＜0.01 compared with pcDNA-3.1（+）+miR-26a-5p mimics group.

Group PcDNA-3.1(+)+mimics NC PcDNA-NORAD+mimics NC PcDNA-3.1(+)+miR-26a-5p mimics PcDNA-NORAD+miR-26a-5pmimics Cell viability(η/%)45.36±5.63 82.48±6.58*23.46±6.36*60.82±6.72△Number of invasion 60.82±6.72 120.56±7.85*30.58±7.83*62.65±7.25△

2.6 miR-26a-5p 與ULK1 的靶向關系采用TargetScan 數據庫預測miR-26a-5p 與ULK1 的結合位點見圖9。與ULK1 WT+mimics NC 組比較，ULK1 WT+ miR-26a-5p mimics 組細胞熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01）；與ULK1 MUT+mimics NC 組比較，ULK1 MUT+miR-26a-5p mimics 組細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明miR-26a-5p 與ULK1 之間具有靶向關系。見圖10。

圖9 miR-26a-5p 與ULK1 的結合位點Fig.9 Binding sites of miR-26a-5p and ULK1

圖10 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-26a-5p 與ULK1 靶向關系時各組細胞熒光素酶活性Fig.10 Luciferase activities of cells in various groups in dual luciferase reporter gene assay for detecting target relationship between miR-26a-5p and ULK1

2.7 沉默ULK1 實驗各組細胞中ULK1 mRNA 表達水平、細胞活性、侵襲細胞數和細胞中E-cadherin及N-cadherin 蛋白表達水平與siRNA NC 組比較，ULK1 siRNA 組細胞中ULK1 mRNA 表達水平和細胞活性明顯降低（P＜0.01），侵襲細胞數明顯減少（P＜0.01），細胞中E-cadherin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），N-cadherin 蛋白表達水平降低（P＜0.01）。見表4 和圖11 及12。

圖11 沉默ULK1 實驗Transwell 法檢測各組細胞侵襲情況（結晶紫，×200）Fig.11 Invasion of cells in various groups detected by Transwell assay in ULK1 silencing experiment (Crystal violet, ×200)

表4 沉默ULK1 實驗各組細胞中ULK1 mRNA 表達水平、細胞活性和侵襲細胞數Tab.4 Expression levels of ULK1 mRNA in cells, cell viabilities, and number of invasion cells in various groups in ULK1 silencing experiment (n=9，±s）

表4 沉默ULK1 實驗各組細胞中ULK1 mRNA 表達水平、細胞活性和侵襲細胞數Tab.4 Expression levels of ULK1 mRNA in cells, cell viabilities, and number of invasion cells in various groups in ULK1 silencing experiment (n=9，±s）

*P＜0.01 compared with siRNA NC group.

Group SiRNA NC ULK1 siRNA ULK1 mRNA 1.26±0.44 0.54±0.32*Cell viability(η/%)82.56±4.52 43.89±6.27*Number of invasion cells 70.62±5.75 38.65±6.28*

圖8 上調NORAD 和miR-26a-5p 實驗Western blotting法檢測各組細胞中E-cadherin及N-cadherin蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.8 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of E-cadherin and N-cadherin in cells in various groups detected by Western blotting method in up-regulated NORAD and miR-26a-5p experiment

2.8 上調NORAD 下調miR-26a-5p 實驗各組細胞中ULK1 mRNA 和蛋白表達水平與siRNA NC+inhibitor NC 組（0.96±0.05 和0.72±0.05） 比較，NORAD siRNA+inhibitor NC 組細胞中ULK1 mRNA 和蛋白表達水平（0.48±0.08 和0.23±0.02） 明顯降低（P＜0.01），siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor 組細胞中ULK1 mRNA 和蛋白表達水平（1.75±0.62 和1.48±0.31） 明顯升高（P＜0.01）； 與siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor 組比較，NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor 組細胞中ULK1 mRNA 和蛋白表達水平（0.89±0.06 和0.75±0.28） 明顯降低（P＜0.01）。見圖13。

圖13 上調NORAD 下調miR-26a-5p 實驗Western blotting 法檢測各組細胞中ULK1 蛋白表達電泳圖Fig.13 Electrophoregram of ULK1 protein in cells in various groups detected by western blotting method in up-regulated mRNA down-regulated miR-26a-5p experiment

圖12 沉默ULK1 實驗Western blotting 法檢測各組細胞中E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.12 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of E-cadherin and N-cadherin in cells in various groups detected by Western blotting method in ULK1 silencing experiment

3 討 論

lncRNA 是一類轉錄本長度超過200 個核苷酸且無蛋白編碼功能的RNA 分子，在基礎轉錄機制中對基因轉錄、RNA 剪接和表觀遺傳等調控方面均發(fā)揮不同的作用。近年來，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的lncRNA 已被發(fā)現(xiàn)，并成為腫瘤診療研究的熱點［10-12］。研究［13］顯示： lncRNA-肌動蛋白絲相關蛋白1-反義RNA1 （actin filamentassociated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1）過表達促進胃癌細胞增殖和侵襲。也有研究［14］顯示： lncRNA- 煙酰胺核苷酸轉氫酶反義RNA1（nicotinamide nucleotide transhydrogenase-antisense RNA1，NNT-AS1） 通過NNT-AS1/miR-3666/E2F 轉錄因子2 （E2F transcription factor 2，E2F2）軸調控肺癌的進展。同源盒A11 反義RNA（homeobox A11 antisense RNA，HOXA11-AS） 能通過與miRNA 和zeste 2 多梳抑制復合物2 亞基增強子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2） 蛋白等相互作用促進腫瘤增殖和轉移等惡性生物學行為［15］。研究［13-15］表明：lncRNA 與腫瘤的發(fā)展有密切關聯(lián)。NORAD在非小細胞肺癌、結直腸癌、宮頸癌和胃癌等發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用。有研究［16］表明：NORAD 參與了結直腸癌和胃癌的進展，且食管鱗狀細胞癌中NORAD 的表達與不良預后有關聯(lián)。但NORAD 調控Eca-109 細胞的作用機制目前尚未見相關報道。本研究結果顯示：NORAD 在Eca-109細胞和食管癌組織中的表達水平明顯升高，與NORAD 在結直腸癌和胃癌等組織中的表達一致，均在癌細胞中出現(xiàn)了高表達，考慮到NORAD 在其他癌癥中發(fā)揮的癌基因作用，推測NORAD 在食管癌中也可能具有同樣的生物學功能。本研究進一步探討NORAD 對Eca-109 細胞增殖、 侵襲和EMT的影響及其作用機制，結果顯示：采用siRNA 技術沉默NORAD 可以明顯抑制Eca-109 細胞的增殖，NORAD 在食管癌發(fā)展過程中作為癌基因發(fā)揮重要作用，是一個潛在的治療靶點。

lncRNA 通過ceRNA 與miRNA 相互作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，進而調控癌癥進展［17］。lncRNA-核仁小分子RNA 宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1） 通過海綿化miR-145-5p 上調異黏蛋白（metadherin，MTDH） 表達，促進非小細胞肺癌進展［18］。lncRNA- 癌癥易感性候選基因11 （cancer susceptibility 11，CASC11） 通過miRNA-150 促進膀胱癌細胞增殖［19］。異丙酚通過減輕lncRNAHOXA11 基因反義RNA （HOXA11 antisense RNA，HOXA11-AS） 對miRNA let-7i 的抑制，促進結直腸癌細胞凋亡［20］。本文作者研究了NORAD 與miR-26a-5p 的關系，通過miRcode 數據庫分析確定了NORAD 與miR-26a-5p 之間具有結合位點，進一步證明miR-26a-5p 是NORAD 的下游靶向基因。為了研究NORAD 與miR-26a-5p之間的調控關系，推測NORAD 可以海綿化miR-26a-5p，降低miR-26a-5p 的作用。本研究結果表明： NORAD 的生物學功能是通過調控miR-26a-5p實現(xiàn)的，過表達NORAD通過miR-26a-5p影響Eca-109 細胞的增殖、侵襲和EMT。研究［21］顯示：lncRNA-H19/miR-194/ PFTAIRE 蛋白激酶1 （PFTAIRE protein kinase 1，PFTK1） 軸調控胰腺癌細胞增殖和遷移。本研究結果表明：miR-26a-5p與ULK1 具有靶向關系。ULK1 是自噬相關基因，也是哺乳動物細胞自噬通路的關鍵基因，通過上游信號傳導，與其他下游自噬相關蛋白相互耦合，形成不同復合體對自噬進行調節(jié)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。研究［22］顯示：磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-activated proteinkinase，AMPK） /ULK1 通路介導了胃癌細胞的自噬。自噬蛋白ULK1 在人肝癌細胞中調控叉頭框蛋白M1（forkhead box M1，F(xiàn)OXM1） 信號通路［23］。本研究結果顯示：ULK1 在Eca-109 細胞中表達水平升高，下調ULK1 能夠抑制Eca-109 細胞的增殖、侵襲和EMT，表明沉默NORAD 通過miR-26a-5p/ULK1 軸抑制食管癌細胞增殖。

綜上所述，本研究證明了NORAD 通過miR-26a-5p/ULK1 軸調節(jié)Eca-109 細胞的增殖、侵襲和EMT，從而促進食管癌的進展。本研究對食管癌進展的分子機制有了新的認識，為食管癌患者的治療提供了一個潛在的治療靶點。