N-乙酰半胱氨酸對尼古丁誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細胞凋亡的作用及其機制

崔磊華, 侯玉帛, 蘇 暢, 李明賀, 聶 鑫

（1.溫州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周科，浙江 溫州 325000；3.吉林大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科，吉林 長春 130021）

牙周炎是以牙周結(jié)締組織破壞和牙槽骨吸收為特點的慢性炎癥性疾病，是成人失牙的主要原因之一［1］。研究［2］顯示： 吸煙是牙周炎的高危因素，戒煙可降低其發(fā)病率，緩解牙周組織損傷。尼古丁是煙草中主要的成癮性成分，隨著尼古丁替代療法在戒煙治療中的廣泛應(yīng)用，尼古丁對人類健康的影響受到越來越多的關(guān)注［3］。研究［4］顯示：尼古丁可破壞機體骨代謝平衡，已成為骨折愈合、骨質(zhì)疏松、類風濕性關(guān)節(jié)炎等骨代謝相關(guān)疾病的危險因素。研究［5-6］證實：尼古丁可協(xié)同牙周局部炎癥反應(yīng)加劇牙周骨組織破壞。然而部分吸煙患者牙周組織表現(xiàn)為輕微炎癥反應(yīng)卻伴隨重度牙槽骨吸收，因此探討尼古丁對骨穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的調(diào)控機制，對維護吸煙者牙周健康具有重要意義。

研究［7-8］顯示：慢性牙周炎患者牙周骨組織破壞程度與局部氧化應(yīng)激反應(yīng)呈正相關(guān)關(guān)系，而煙草燃燒過程中生成的過量活性氧簇可直接攻擊牙周組織細胞，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細胞損傷。線粒體通過氧化呼吸鏈的電子漏還原氧分子形成線粒體來源活性氧簇（mitochondria-derived reactive oxygen species，mitoROS），是機體ROS 的主要來源，同時也是ROS 主要攻擊的靶點，兩者導(dǎo)致的惡性循環(huán)進一步加劇組織的損傷［9］。研究［10-11］顯示：心肌細胞和海馬神經(jīng)元細胞等在尼古丁刺激下，細胞中線粒體受損，產(chǎn)生大量mitoROS，引發(fā)線粒體功能障礙，激活線粒體途徑的細胞凋亡，導(dǎo)致組織細胞損傷。研究［12］證實：線粒體氧化應(yīng)激及功能障礙在氯化鈷誘導(dǎo)人牙周膜干細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，應(yīng)用ROS 清除劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC） 可緩解上述細胞損傷，但目前尚無關(guān)于線粒體氧化應(yīng)激在尼古丁誘導(dǎo)成骨細胞凋亡中作用的相關(guān)報道。本研究擬通過體外細胞模型實驗觀察ROS 清除劑NAC 對尼古丁誘導(dǎo)MC3T3-E1 細胞凋亡的影響，探討其可能的作用機制，為吸煙相關(guān)牙周炎患者的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1 細胞（美國ATCC 細胞庫）。胎牛血清（美國Gibco 公司），高糖培養(yǎng)基、 0.25% 胰酶和青/鏈霉素（美國Hyclone 公司），噻唑藍（MTT）和NAC （美國Sigma 公司），Annexin Ⅴ-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司），蛋白裂解液和BCA 蛋白定量檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），B 細胞淋巴瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、 Bcl-2 相 關(guān)X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax） 和β-肌動蛋白（β-actin） 抗體（美國CST 公司），MitoSOX Red 熒光測定試劑盒、山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗（美國Invitrogen 公司）。凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad 公司），熒光顯微鏡（德國Leica 公司），低溫高速離心機和流式細胞儀（美國Beckman 公司）。

1.2 MC3T3-E1 細胞的培養(yǎng)將復(fù)蘇的MC3T3-E1 細胞置于含10% 胎牛血清和1% 雙抗（青/鏈霉素） 的α-MEM 培養(yǎng)基中，并在5% CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 傳代1 次，選取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 MTT 法檢測MC3T3-E1 細胞增殖活性將MC3T3-E1 細胞以5×104mL－1密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板24 h 后，用不同濃度（0、 1.0、 2.5、5.0 和7.5 mmol·L－1） 尼古丁處理細胞24 h，棄上清，每孔加入100 μL 無血清培養(yǎng)基和20 μL MTT工作液，置于5% CO2、37 ℃和飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，采用酶標儀在490 nm 波長處檢測各孔吸光度（A） 值，根據(jù)公式計算細胞增殖活性。細胞增殖活性=（實驗孔A 值－空白孔A 值） /（對照孔A 值－空白孔A 值） ×100%。計算尼古丁半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50） 值。進一步依據(jù)尼古丁的IC50 值，將MC3T3-E1 細胞分為對照組、 尼古?。?4.25 mmol·L－1） 組和尼古丁（4.25 mmol·L－1） +不同濃度NAC （2.5、 5.0 和7.5 mmol·L－1） 組，處理細胞24 h 后，檢測各組細胞A 值，計算各組細胞增殖活性，確定NAC 最適作用濃度應(yīng)用于后續(xù)實驗。每組實驗均重復(fù)3次。

1.4 MitoSOX 熒光染色法檢測各組細胞中mitoROS 水平將MC3T3-E1 細胞以5×104mL－1密度接種于48 孔細胞培養(yǎng)板，分為對照組、尼古?。?.25 mmol·L－1） 組、 NAC （5.0 mmol·L－1）組和尼古丁（4.25 mmol·L－1） +NAC（5.0 mmol·L－1） 組，每組3 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗滌細胞1 次后，加入終濃度100 nmol·L－1MitoSOX，37 ℃避光孵育15 min，PBS 緩沖液洗滌后利用熒光顯微鏡觀察并拍照，采用Image J 軟件計算各組細胞平均熒光強度，以各組細胞熒光強度代表mitoROS 水平。每組實驗均重復(fù)3次。

1.5 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率將MC3T3-E1 細胞以5×104mL－1密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，細胞分組同“ 1.4”，每組3 個復(fù)孔，24 h 后，用不含EDTA 胰酶消化收集各組細胞，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，預(yù)冷PBS 緩沖液洗滌細胞2 次，離心后加入含AnnexinⅤ-FITC和PI 染液的Binding buffer 緩沖液混懸細胞，避光孵育10 min，上機檢測，并計算各組細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/（凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù)） ×100%。每組實驗均重復(fù)3次。

1.6 Western blotting 法檢測各組細胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表達水平將MC3T3-E1 細胞以5×104mL－1密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，細胞分組同“1.4”，每組3 個復(fù)孔，24 h 后收集各組細胞，采用蛋白裂解液裂解提取細胞總蛋白，BCA 法進行蛋白定量檢測后，煮沸變性。經(jīng)過10% SDSPAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、 5% 脫脂牛奶室溫搖床封閉1 h，1×TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜?；厥找豢梗?×TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入二抗室溫孵育1 h，用ECL檢測液發(fā)光顯影定影后，采用凝膠成像儀對各組MC3T3-E1 細胞中目的蛋白條帶灰度值進行分析。目的蛋白表達水平以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值表示，同時計算Bax/Bcl-2 比值。

1.7 統(tǒng)計學分析采用Graphpad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組細胞增殖活性、細胞中mitoROS 水平、細胞凋亡率和細胞中Bax/Bcl-2 比值均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組MC3T3-E1細胞增殖活性與0 mmol·L－1尼古丁組比較，1.0、 2.5、 5.0 和7.5 mmol·L－1尼古丁組MC3T3-E1 細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05），并呈濃度依賴性，尼古丁的IC50值為（4.25±0.03） mmol·L－1。與對照組比較，尼古丁組細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05）；與尼古丁組比較，尼古丁+2.5、5.0 和7.5 mmol·L－1NAC組MC3T3-E1 細胞增殖活性明顯升高（P＜0.05），以尼古丁+5.0 mmol·L－1NAC 組細胞增殖活性升高最為明顯。故采用4.25 mmol·L－1尼古丁和5.0 mmol·L－1NAC 進行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 不同濃度尼古丁(A) 和NAC（B）處理后各組細胞增殖活性Fig.1 Proliferation activities of MC3T3-E1 cells after treated with different concentrations of nicotine(A) and NAC（B）

2.2 各組細胞中mitoROS 水平與對照組比較，尼古丁組細胞中mitoROS 水平明顯升高（P＜0.05）；與尼古丁組比較，NAC 組和尼古丁+NAC組細胞中mitoROS 水平明顯降低（P＜0.05）。見圖2 和3。

圖2 各組MC3T3-E1 細胞MitoSOX 熒光染色情況（×200）Fig.2 MitoSOX fluorescence staining of MC3T3-E1 cells in various groups(×200)

圖3 各組細胞中mitoROS 水平Fig.3 MitoROS levels in cells in various groups

2.3 各組細胞凋亡率對照組、尼古丁組、NAC組和尼古丁+NAC 組細胞凋亡率分別為（2.10±0.01） % 、（10.60±0.66） % 、（2.85±0.24） %和（6.90±0.48） %。與對照組比較，尼古丁組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與尼古丁組比較，NAC 組和尼古丁+NAC 組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），但尼古丁+NAC 組細胞凋亡率仍高于對照組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.4 各組細胞中Bax/Bcl-2 比值與對照組（1.293+0.035） 比較，尼古丁組細胞中Bax/Bcl-2比值（1.544+0.123） 升高（P＜0.05）； 與尼古丁組比較，尼古丁+NAC 組細胞中Bax/Bcl-2 比值（1.19+0.03） 降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of Bcl-2 and Bax proteins in cells in various groups

3 討 論

目前我國總吸煙人數(shù)已超過3.12 億，流行病學研究［13-16］顯示：吸煙人群牙周炎患病率是非吸煙人群的4 倍，并伴牙周組織破壞加重和治療效果和預(yù)后差等特點。研究［17-18］證實：尼古丁作為煙草中主要的毒性成分，可通過沉積在牙齒和牙槽骨表面，直接促進牙槽骨吸收；間接進入血液循環(huán)系統(tǒng)，通過增加氧化應(yīng)激反應(yīng)、 激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 信號通路、升高NF- κB 受體配體激活因子（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）/骨保護素（osteoprotegerin，OPG） 水平及釋放大量炎癥介質(zhì)等破壞機體骨組織穩(wěn)態(tài)。其次，研究［19］顯示：電子煙（也稱尼古丁傳送系統(tǒng)） 作為新型煙草制品其尼古丁含量高達320.5 mmol·L－1，其使用率在全世界呈流行趨勢，在青少年人群中的增長尤為明顯，極大危害青少年的牙周及全身健康，因此研究尼古丁在調(diào)控機體骨穩(wěn)態(tài)中的作用具有重要意義。

研究［20］證實：在吸煙者唾液和血液中尼古丁濃度分別可高達9.6 和1.2 mmol·L－1，而0～10 mmol·L－1尼古丁可呈濃度依賴性誘導(dǎo)人牙周膜細胞凋亡，抑制成骨細胞分化，促進破骨細胞形成，釋放炎癥介質(zhì)，破壞骨代謝平衡，參與牙周組織骨破壞。牙周膜細胞是具有成纖維及成骨分化等多項潛能的細胞群，在維持牙周軟、硬組織骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示：尼古丁可呈濃度依賴性抑制前成骨細胞（MC3T3-E1 細胞） 增殖活性，并促進細胞凋亡，導(dǎo)致細胞損傷。

牙周炎發(fā)病機制復(fù)雜，成骨細胞凋亡水平與牙周炎骨破壞有密切關(guān)聯(lián)，而線粒體氧化應(yīng)激與細胞內(nèi)各種凋亡信號密切相關(guān)［21-22］。研究［23］表明：尼古丁可呈濃度依賴性激活細胞中ROS，促進人牙齦成纖維細胞凋亡，抑制牙齦組織自我修復(fù)能力；尼古丁可通過誘導(dǎo)細胞內(nèi)H2O2生成，增加促凋亡蛋白甲基乙二醛水平，促進人成骨細胞凋亡，參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展［24］；3 mmol·L－1以上尼古丁可引起大鼠牙齦成纖維細胞內(nèi)線粒體腫脹和空泡化［25］。為研究線粒體氧化應(yīng)激在尼古丁誘發(fā)成骨細胞凋亡中的作用，本研究采用MitoSOX 熒光探針檢測細胞中mitoROS 水平，結(jié)果表明：4.25 mmol·L－1尼古丁可明顯增加MC3T3-E1 細胞中mitoROS 水平。NAC 是一種含巰基的還原劑，可通過促進細胞中谷胱甘肽的合成，清除ROS，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激保護細胞的作用［26］。本研究進一步應(yīng)用NAC 處理MC3T3-E1 細胞，結(jié)果顯示：NAC 不僅可緩解尼古丁誘導(dǎo)的細胞增殖抑制作用，還可明顯降低尼古丁誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細胞中mitoROS 水平、細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達水平的升高。研究［9］顯示：線粒體氧化應(yīng)激水平的增高往往伴隨線粒體功能障礙如線粒體腫脹、膜電位下降、ATP 衰竭和呼吸鏈受損，導(dǎo)致細胞色素C和內(nèi)外膜間促凋亡因子的釋放，進而激活線粒體途徑細胞凋亡。本研究結(jié)果表明：線粒體氧化應(yīng)激參與尼古丁誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細胞凋亡過程，NAC可逆轉(zhuǎn)上述損傷，然而線粒體功能障礙是否參與尼古丁介導(dǎo)的成骨細胞氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡尚需進一步研究。

綜上所述，本研究從線粒體分子生物學層面闡釋了尼古丁在誘導(dǎo)成骨細胞凋亡中的作用，并探討了其可能的分子生物學機制，為吸煙相關(guān)牙周炎防治提供了新的靶點和思路。