人參組培不定根蛋白對(duì)小鼠的抗疲勞作用及其機(jī)制

王曼瑩, 付寶玉, 徐曉浩, 李香竹, 陳 紅, 孫立偉, 趙大慶

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心，吉林 長春 130021；3.吉林省通化本草生物科技有限公司，吉林 通化 134000）

隨著生活及工作節(jié)奏的加快和工作壓力的增加，亞健康狀態(tài)人群數(shù)量逐年上升。疲勞是亞健康狀態(tài)最主要和最典型的表現(xiàn)，所占比例約為78.7%，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，成為近年來備受關(guān)注的問題之一［1］。當(dāng)機(jī)體長時(shí)間處于疲勞狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)就會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，加重疲勞狀態(tài)，導(dǎo)致機(jī)能下降甚至引發(fā)各種疾病。因此開發(fā)具有抗疲勞功能的保健食品對(duì)于人們生活和工作質(zhì)量的提高有重要意義。人參作為 “百草之王”，具有 “大補(bǔ)元?dú)狻?等功效。但近年來，長白山作為野山參的唯一產(chǎn)區(qū)，連年采挖使其儲(chǔ)量和產(chǎn)量均明顯減少，且由于野山參較長的成熟年限限制了其應(yīng)用［2］。人參組培不定根是野山參經(jīng)過組織培養(yǎng)得到的，在遺傳信息方面與野山參具有高度相似性，而且其生長速度快、周期短且易培養(yǎng)，人參組培不定根易于提取出與野山參相似的活性成分。許多人參提取物如皂苷、多糖［3］和蛋白［4］等均被報(bào)道具有抗疲勞作用。但是現(xiàn)階段關(guān)于人參組培不定根的研究報(bào)道多集中在體系建立［5］、工藝優(yōu)化［6］和品質(zhì)評(píng)價(jià)［7］等方面，關(guān)于人參組培不定根的活性研究僅發(fā)現(xiàn)其能保護(hù)四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4） 誘導(dǎo)的大鼠肝損傷［8］和緩解糖尿病大鼠的高血糖［9］。人參組培不定根蛋白（ginseng adventitious root protein，GARP） 作為人參組培不定根的重要組分，其抗疲勞作用的研究對(duì)于其開發(fā)應(yīng)用十分必要。本實(shí)驗(yàn)以野山參為原料，經(jīng)組織培養(yǎng)等方法得到人參組培不定根，提取GARP 后喂養(yǎng)疲勞模型小鼠，探討GARP 的抗疲勞作用，并通過小鼠成肌細(xì)胞（C2C12 細(xì)胞） 探討其相關(guān)作用通路，為GARP 的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器小鼠成肌C2C12 細(xì)胞購自美國ATCC 細(xì)胞庫。40 只昆明種清潔級(jí)小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK （吉）-2018-0001。人參組培不定根由通化本草生物科技有限公司提供。葡萄糖（分析純） 購自天津市濱?？频匣瘜W(xué)試劑有限公司，血乳酸（blood lactic acid，BLA）、 血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、 糖原、 谷胱甘肽（glutathione，GSH） 和總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，腺苷酸激活蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）、 磷酸化AMPK（phosphorylated AMPK，p-AMPK）、 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 （glucose transporter 4，GLUT4 ） 和β -Tubulin 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，羊抗兔和羊抗鼠抗體購自武漢博士德生物制品公司。Infinite M200 PRO 多功能酶標(biāo)儀購于瑞士TECAN 公司，UV765 紫外可見分光光度計(jì)購于上海精密科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)luorChem HD2 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購于美國ProteinSimple 公司。

1.2 GARP 的制備新鮮人參組培不定根用蒸餾水清洗，在10 倍體積的0.01 mol·L－1PBS 緩沖液（pH7.2） 中勻漿1 min，然后用300 目濾布進(jìn)行固液分離，8 500 r·min－1離心10 min，將溶液在相對(duì)分子質(zhì)量為10 000 的超濾膜上進(jìn)行超濾，然后通過0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥昆明種清潔級(jí)小鼠40 只，隨機(jī)分為對(duì)照組，低、中和高劑量（0.25、0.50 和1.00 g·kg－1） GARP 組，每組10 只；籠內(nèi)環(huán)境溫度為（25±5） ℃，相對(duì)濕度為55%，小鼠喂養(yǎng)普通飼料，自由進(jìn)食和飲水適應(yīng)1 周后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，GARP 組小鼠灌胃給予相應(yīng)劑量GARP，對(duì)照組小鼠給予等量蒸餾水，每天1 次，連續(xù)給藥30 d。

1.4 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)?zāi)┐喂辔附o藥30 min 后，各組小鼠于尾部負(fù)5% 體質(zhì)量的鉛塊，置于游泳箱中進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，水深35 cm，水溫（25±2） ℃，記錄小鼠自游泳開始到沉入水面下10 s 不能浮出水面為止的時(shí)間，即小鼠游泳時(shí)間［10］。

1.5 分光光度法檢測(cè)各組小鼠血清中BLA 和BUN 水平各組小鼠末次灌胃給藥30 min 后摘眼球取血，靜置1 h 后3 000 r·min－1離心10 min 分離血清。參照測(cè)試盒說明書中的方法，結(jié)合紫外可見光分光光度計(jì)在波長520 和530 nm 處檢測(cè)吸光度（A） 值，根據(jù)公式計(jì)算血清中BLA 和BUN 水平，BUN/BLA （mmol·L－1）=（測(cè)定A 值－ 空白A 值） /（標(biāo)準(zhǔn)A 值－空白A 值） ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)［11］。

1.6 分光光度法檢測(cè)小鼠肝組織中GSH 水平和SOD 活性小鼠末次灌胃給藥30 min 后脫頸處死，立即取出肝臟用冷藏的生理鹽水漂洗除去血液，用試紙擦干后制成10% 的肝組織勻漿，按照試劑盒說明書中的方法在波長405 和450 nm 處測(cè)定A 值。根據(jù)公式計(jì)算GSH 水平和SOD 活性。GSH 水平（mg·g－1）=（測(cè)定A 值－空白A 值） /（標(biāo)準(zhǔn)A值－空白A 值） ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×GSH 相對(duì)分子質(zhì)量×稀釋倍數(shù)/蛋白濃度；SOD 活性（U·mg－1）=（對(duì)照A 值－ 測(cè)定A 值） /對(duì)照A 值/50%× 反應(yīng)液體積/取樣量/蛋白濃度［12］。

1.7 分光光度法檢測(cè)各組小鼠肝糖原和肌糖原水平小鼠末次灌胃給藥30 min 后處死，解剖取出小鼠肝臟和肌肉組織，采用生理鹽水洗去血液并用濾紙吸干水分，按照糖原測(cè)試盒說明書制備組織勻漿，用紫外可見分光光度計(jì)于波長620 nm 處測(cè)定A 值并根據(jù)說明書公式計(jì)算出肝糖原和肌糖原水平［13］。糖原水平（mg·g－1組織）=（測(cè)定A 值/標(biāo)準(zhǔn)A 值） ×標(biāo)準(zhǔn)管含量×樣本稀釋倍數(shù)×10/1.11。

1.8 C2C12 細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化C2C12 細(xì)胞采用含10% FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80% 時(shí)，將原培養(yǎng)瓶中含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基吸走，用PBS 緩沖液漂洗細(xì)胞2 次（每次2 mL），用含2% 馬血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液對(duì)C2C12 細(xì)胞誘導(dǎo)5 d 后分化為肌管細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［14］。

1.9 分光光度法檢測(cè)各組細(xì)胞中GSH 水平、SOD活性和糖原水平C2C12 成肌細(xì)胞分化為肌管細(xì)胞后加入不同劑量（5、 10 和20 mg·L－1） GARP 處理，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，24 h后胰酶消化，1 000 r·min－1離心5 min，取細(xì)胞沉淀采用RIPA 裂解，離心取上清；按照GSH 和SOD 檢測(cè)試劑盒說明書中方法在波長405 和450 nm 處測(cè)定A 值［15］，根據(jù) “1.6”中的公式計(jì)算GSH 水平和SOD 活性；按照糖原檢測(cè)試劑盒說明書操作，用紫外可見分光光度計(jì)于波長620 nm 處測(cè)定A 值［16］，根據(jù) “1.7” 中的公式計(jì)算細(xì)胞中糖原水平。

1.10 苯酚硫酸法檢測(cè)各組細(xì)胞葡萄糖攝取能力細(xì)胞葡萄糖攝取是指其吸收培養(yǎng)液中葡萄糖的能力，使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入不同劑量GARP 處理24 h 后收集培養(yǎng)液，1 000 r·min－1離心5 min 后取上清備用，將試管置于40 ℃水浴鍋中15 min，迅速冷卻至室溫后于波長490 nm 處測(cè)定A 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式計(jì)算出樣品培養(yǎng)液的葡萄糖濃度，然后通過公式計(jì)算細(xì)胞葡萄糖攝取能力［17］葡萄糖攝取能力=培養(yǎng)液葡萄糖濃度－樣品葡萄糖濃度。

1.11 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中p-AMPK、AMPK 和GLUT4 蛋白表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，PBS 緩沖液漂洗、 胰酶消化后4 ℃裂解1 h，Bradford 法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度，SDS-PAGE 法分離得到蛋白條帶，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，孵育一抗p-AMPK （1∶1 000 稀釋）、AMPK（1∶1 000 稀釋）、 GLUT4 （1∶1 000 稀釋） 和β -tubulin （1∶5 000 稀釋） 置于4 ℃搖床過夜，TBST 漂洗PVDF 膜后室溫孵育相應(yīng)二抗，1 h 后漂洗PVDF 膜，加入ECL 發(fā)光液后放入化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。目標(biāo)蛋白表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-tubulin 條帶灰度值［18］。計(jì)算p-AMPK/AMPK 比值，以p-AMPK/AMPK 比值代表AMPK的磷酸化水平。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠游泳時(shí)間、血清中BLA 和BUN 水平、肝組織中GSH 水平、SOD 活性和糖原水平，C2C12 細(xì)胞中GSH 水平、SOD 活性、 糖原水平、 細(xì)胞糖攝取能力、 p-AMPK/AMPK 比值和GLUT4 蛋白表達(dá)水平均以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠游泳時(shí)間與對(duì)照組比較，低劑量GARP 組小鼠游泳時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中和高劑量GARP 組小鼠游泳時(shí)間明顯延長（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠游泳時(shí)間Tab.1 Swimming time of mice in various groups(n=10,±s，t/min)

表1 各組小鼠游泳時(shí)間Tab.1 Swimming time of mice in various groups(n=10,±s，t/min)

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control GARP（g·kg－1）0.25 0.50 1.00 Swimming time 13.10±1.18 15.23±1.60 18.51±0.72**16.74±0.58*

2.2 各組小鼠血清中BLA 和BUN 水平與對(duì)照組比較，低劑量GARP 組小鼠血清中BLA 和BUN水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中和高劑量GARP 組小鼠血清中BLA 和BUN 水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠血清中BLA 和BUN 水平Tab.2 Levels of BLA and BUN in serum of mice in variousgroups [n=10,±s,cB/(mmol·L－1)]

表2 各組小鼠血清中BLA 和BUN 水平Tab.2 Levels of BLA and BUN in serum of mice in variousgroups [n=10,±s,cB/(mmol·L－1)]

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control GARP（g·kg－1）0.25 0.50 1.00 BLA 9.01±0.15 8.19±0.29 7.04±0.38**7.28±0.38*BUN 56.29±1.69 53.86±1.29 41.88±1.36**43.99±1.22**

2.3 各組小鼠肝組織中GSH 水平和SOD 活性與對(duì)照組比較，不同劑量GARP 組小鼠肝組織中GSH 水平和SOD 活性明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠肝組織中GSH 水平和SOD 活性Tab.3 GSH levels and SOD activities in liver tissue of mice in various groups (n=10，±s）

表3 各組小鼠肝組織中GSH 水平和SOD 活性Tab.3 GSH levels and SOD activities in liver tissue of mice in various groups (n=10，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control GARP（g·kg－1）0.25 0.50 1.00 GSH[wB/（mg·g－1）]35.22±2.89 48.99±5.83*62.79±4.99**58.15±3.89**SOD[λB/（U·mg－1）]9.23±0.61 10.65±0.84*11.95±1.21*11.57±0.92*

2.4 各組小鼠肝糖原和肌糖原水平與對(duì)照組比較，不同劑量GARP 組小鼠肝糖原和肌糖原水平均明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠肝糖原和肌糖原水平Tab.4 Levels of liver glycogen and muscle glycogen of mice in various groups [n=10,x±s，wB/(mg·g－1)]

2.5 各組細(xì)胞中GSH 水平和SOD 活性與對(duì)照組比較，不同劑量GARP組細(xì)胞中GSH水平和SOD活性明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞中GSH 水平（A）和SOD 活性(B)Fig.1 GSH levels (A) and SOD activities (B) in cells in various groups

2.6 各組細(xì)胞中糖原水平和葡萄糖攝取能力與對(duì)照組比較，不同劑量GARP 組細(xì)胞中糖原水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），葡萄糖攝取能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞中糖原水平（A）和葡萄糖攝取能力（B）Fig.2 Glycogen levels (A) and glucose uptake (B) of cells in various groups

2.7 各組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK 比值和GLUT4蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，不同劑量GARP組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK 比值和GLUT4 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞中AMPK/GLUT4 通路蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.3 Electrophoregram（A）and histogram（B）of AMPK/GLUT4 pathway proteins in cells in various groups

3 討 論

疲勞是指機(jī)體在一定條件下，因長時(shí)間過度勞累或緊張的勞動(dòng)到達(dá)一定階段而引起的工作效率暫時(shí)下降的一種生理和心理現(xiàn)象［19］。研究［20］顯示：許多天然藥物如人參、冬蟲夏草和紅景天等均具有抗疲勞作用?？蛊谛Ч钪苯拥捏w現(xiàn)就是小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的增加，力竭游泳運(yùn)動(dòng)是常用的動(dòng)物模型，可以很好地評(píng)價(jià)小鼠的耐力水平［21］。本研究結(jié)果顯示：GARP 能延長小鼠的游泳時(shí)間，提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。

機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)消耗大量的能量和氧氣，產(chǎn)生乳酸堆積于肌肉中，使體內(nèi)正常代謝過程出現(xiàn)紊亂，影響內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，成為誘發(fā)疲勞的重要原因［22］。運(yùn)動(dòng)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的代謝參與到提供能量中，BUN 作為蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，反映了機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的情況，因此BUN 水平的變化可以作為評(píng)估機(jī)體承受負(fù)荷耐力的重要指標(biāo)［23］。本研究中，與對(duì)照組比較，中和高劑量GARP 組小鼠血清中BLA 和BUN 水平明顯降低，表明GARP 能使機(jī)體承受負(fù)荷的耐力有所增加。

氧化應(yīng)激也是造成疲勞的重要因素。當(dāng)劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，自由基產(chǎn)生并積累，導(dǎo)致生物膜機(jī)能被破壞，線粒體受到自由基攻擊，ATP 供給減少，肌肉工作能力減弱，從而產(chǎn)生疲勞［24］。GSH 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的三肽，能消除人體自由基，是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化水平的重要標(biāo)志物［25］；SOD 是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用［26］；GSH 和SOD 作為機(jī)體重要抗氧化物和抗氧化酶，對(duì)自由基的清除有重要意義。本研究結(jié)果表明：GARP 能促進(jìn)小鼠肝臟和C2C12 細(xì)胞中GSH的產(chǎn)生并提高SOD 活性，使機(jī)體清除自由基的能力增強(qiáng)，顯示出較強(qiáng)的抗氧化功效來對(duì)抗疲勞的產(chǎn)生。

葡萄糖是機(jī)體的直接能源物質(zhì)，可經(jīng)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP 為機(jī)體供能；糖原是機(jī)體的儲(chǔ)備能源，可在血糖降低條件下分解成葡萄糖來維持細(xì)胞的能量供給［27］；葡萄糖充足的條件下還能轉(zhuǎn)換為糖原儲(chǔ)存起來［28］。因此，葡萄糖攝取能力和糖原儲(chǔ)備量是評(píng)價(jià)骨骼肌耐力的重要指標(biāo)［29］。本研究結(jié)果顯示：GARP 能使小鼠肝糖原和肌糖原水平明顯提高，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也顯示GARP 能提高C2C12 細(xì)胞的糖攝取能力并增加糖原水平。GLUT4 是細(xì)胞膜上的一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)能力呈正相關(guān)關(guān)系［30］；AMPM 作為調(diào)控GLUT4 的重要蛋白，在糖代謝過程中起重要作用［31］。本研究結(jié)果顯示：GARP 對(duì)AMPK 的磷酸化和GLUT4蛋白表達(dá)均有促進(jìn)作用，能夠通過激活A(yù)MPK/GLUT4 通路來調(diào)控糖代謝。

綜上所述，采用組織培養(yǎng)等技術(shù)獲得的GARP可以延長小鼠的游泳時(shí)間，降低小鼠血清中BLA和BUN 水平，提高小鼠抗氧化能力并促進(jìn)糖原積累，具有抗疲勞作用，其機(jī)制可能是通過激活A(yù)MPK/GLUT4 通路、 促進(jìn)糖攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)并增強(qiáng)糖原儲(chǔ)備實(shí)現(xiàn)的。由于GARP 與野山參的基因具有高度相似性且生長周期短，可廣泛應(yīng)用于抗疲勞藥品及保健品的開發(fā)。