鼻咽癌斑馬魚移植瘤模型的構(gòu)建及姜黃素對(duì)CNE-2 細(xì)胞的抑制作用

王澤泰, 婁丹丹, 彭 燕, 朱道琦, 李愛(ài)武, 宮鳳英, 呂 英, 范 欽

（1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院分子生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院古中醫(yī)科，廣東 廣州 510515）

鼻咽癌是一種于我國(guó)南方地區(qū)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，目前的治療手段有放療、化療、手術(shù)和靶向治療等［1］，但放化療抵抗的產(chǎn)生和嚴(yán)重的不良反應(yīng)常導(dǎo)致鼻咽癌患者治療失?。?］。因此，尋找治療鼻咽癌新型有效藥物成為亟待解決的問(wèn)題。中藥具有多靶點(diǎn)效應(yīng)、不良反應(yīng)少和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，因而成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。

姜黃素是從姜黃根莖中提取的天然中藥單體，為姜黃的主要活性成分［3］，中醫(yī)認(rèn)為其具有破血消瘀作用?，F(xiàn)代研究［4］表明：姜黃素具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)放化療和抗腫瘤等多種藥理作用。目前姜黃素抗鼻咽癌的研究仍以細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠模型為主，因此建立更多的鼻咽癌動(dòng)物模型對(duì)研究鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和防治措施具有重要作用。

斑馬魚是一種原產(chǎn)于印度和巴基斯坦等國(guó)家的小型熱帶淡水魚，目前已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域公認(rèn)的脊椎動(dòng)物模型［5］。與經(jīng)典的小鼠/大鼠模型比較，主要有以下優(yōu)勢(shì)［6-7］：①體外受精、體外發(fā)育，易于獲得胚胎進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究和藥物實(shí)驗(yàn)；②胚胎透明，可直接觀察體內(nèi)器官，結(jié)合活體染料、抗體和核酸探針等方法，有利于了解體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)特性；③易于繁殖，產(chǎn)卵量大，發(fā)育較快，研究耗時(shí)短，實(shí)驗(yàn)通量高；④與哺乳動(dòng)物的生理、發(fā)育和代謝途徑相似，且與人類基因組同源性高，是預(yù)測(cè)疾病的良好模型?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，斑馬魚已被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和免疫學(xué)等多種研究領(lǐng)域。近幾年來(lái)，斑馬魚移植瘤動(dòng)物模型在腫瘤研究領(lǐng)域迅速興起，不僅可以用于研究腫瘤血管生成、細(xì)胞遷移和藥物反應(yīng)，還可以作為個(gè)性化癌癥治療的實(shí)時(shí)體內(nèi)平臺(tái)［8-9］，憑借高通量和低成本的特色在醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著不可替代的作用。

本研究以斑馬魚為動(dòng)物載體，建立鼻咽癌斑馬魚移植瘤模型，明確姜黃素對(duì)鼻咽癌的抑制作用，并研究了姜黃素對(duì)CNE-2 細(xì)胞增殖和遷移的影響，旨在探討鼻咽癌斑馬魚移植瘤模型能否準(zhǔn)確評(píng)價(jià)姜黃素的治療效果，為該模型應(yīng)用于腫瘤藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

人低分化鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞株（中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈(zèng)），37 ℃、5% 二氧化碳（CO2） 的孵育條件下，在含有10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每天換液，細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶70%～80% 時(shí)用0.25% 胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。AB 野生型斑馬魚，由國(guó)家斑馬魚資源中心提供。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)于28.5 ℃恒溫斑馬魚培養(yǎng)系統(tǒng)中，光照條件為14 h：10 h 明暗交替，每日2 次喂食孵化后的千年蟲。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)器材

RPMI 1640 培養(yǎng)基、 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 和胰酶（美國(guó)Gibco 公司），CCK-8試劑（中國(guó)Abbkine 公司），姜黃素（中國(guó)曼斯特公司），細(xì)胞膜紅色熒光染色劑CM-Dil （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。斑馬魚培養(yǎng)系統(tǒng)（中國(guó)海圣公司），斑馬魚注射儀（日本Nikon 公司）。

1.3 CM-DiI 染色檢測(cè)CNE-2 細(xì)胞熒光強(qiáng)度CNE-2 細(xì)胞分為對(duì)照組和CM-Dil 組，2 組細(xì)胞初始密度一致。CM-DiI 組細(xì)胞用胰酶消化后重懸吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，1 mL 細(xì)胞懸液加入5 μL 活細(xì)胞染色劑CM-DiI。置于5% CO2培養(yǎng)箱中孵育10～15 min。PBS 緩沖液清洗3 次后用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，連續(xù)5 d 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察熒光強(qiáng)度。每組重復(fù)3 次，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 人鼻咽癌斑馬魚模型的構(gòu)建

1.4.1 斑馬魚胚胎收集 挑選性成熟的AB 型斑馬魚4～5 對(duì)進(jìn)行繁殖，于次日將胚胎收集至培養(yǎng)皿中，每皿約100～200 個(gè)受精卵，用吸管吸干凈雜質(zhì)及未受精的乳白渾濁卵，置于28 ℃孵箱進(jìn)行孵育，每日更換培養(yǎng)液。

1.4.2 瓊脂板的制備 稱取1g 瓊脂糖粉在燒瓶中，加入100 mL 去離子水，微波爐加熱沸騰后倒進(jìn)干凈培養(yǎng)皿，待冷卻后制作成擺放斑馬魚的平板，以供顯微注射時(shí)用。

1.4.3 細(xì)胞染色 CNE-2 細(xì)胞用胰酶消化后重懸吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，取5 μL CM-Dil，加入到1 mL細(xì)胞懸液中。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育10～15 min，PBS 緩沖液洗3 次后用RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸，顯微鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為2×107mL－1，置于冰上備用。

1.4.4 斑馬魚胚胎的麻醉及注射 斑馬魚胚胎分為對(duì)照組、PBS 組和模型組。每皿取30 個(gè)受精后天數(shù)（days postfertilization，dpf） 為2 的斑馬魚胚胎，用0.001% 三卡因溶液麻醉后，用吸管輕輕吸至濕潤(rùn)的濃度為1.0% 的瓊脂板上，整齊均勻擺放以方便注射。將盛放斑馬魚胚胎的瓊脂板置于顯微鏡視野中央，將注射針插入到模型組斑馬魚胚胎的卵黃囊中，注入已染色的鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞，每個(gè)胚胎注射細(xì)胞懸液10 nL，約200 個(gè)細(xì)胞；對(duì)照組斑馬魚胚胎不進(jìn)行處理，PBS 組斑馬魚胚胎注射等量PBS 緩沖液。注射后立即于熒光顯微鏡下成像，評(píng)估是否注射成功。之后將注射成功的斑馬魚置于孵箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 HE 染色觀察斑馬魚移植瘤組織形態(tài)表現(xiàn)

取對(duì)照組（未注射CNE-2 細(xì)胞） 和模型組斑馬魚于10% 甲醛固定液中固定，4 ℃過(guò)夜，以保持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。洗滌脫水，浸蠟包埋后制備病理切片。蘇木素和伊紅（HE） 染色后封片，于顯微鏡下觀察模型組斑馬魚移植瘤組織形態(tài)表現(xiàn)，進(jìn)行圖像采集分析。

1.6 姜黃素體內(nèi)用藥濃度篩選

將3 dpf 的斑馬魚胚胎分為對(duì)照組（ 0 μ mol·L－1姜黃素組） 和不同濃度（0.625、1.250、2.500、5.000、7.500 和10.000 μmol·L－1）姜黃素組，每組30 條，姜黃素作用48 h 后統(tǒng)計(jì)各組斑馬魚死亡數(shù)和致畸數(shù)，并計(jì)算斑馬魚死亡率。

1.7 姜黃素干預(yù)后各組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度和發(fā)生移植瘤頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)

用飼養(yǎng)水將姜黃素終濃度調(diào)整至篩選出的工作濃度0、0.625、1.250、2.500 和5.000 μmol·L－1，0 μmol·L－1姜黃素組為對(duì)照組。將3 dpf 的斑馬魚模型置于上述配制好的姜黃素飼養(yǎng)水中，置于孵箱中48 h。分別選取3 和5 dpf （姜黃素作用48 h） 的斑馬魚模型于宏觀體式顯微鏡熒光狀態(tài)下拍照。利用Image J 軟件分析處理熒光圖片，對(duì)各組的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。統(tǒng)計(jì)各組發(fā)生移植瘤頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)。

1.8 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2 細(xì)胞，用含10%FBS 的完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104mL－1，96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種100 μL ，設(shè)空白組（不加細(xì)胞）、 對(duì)照組和10 及20 μmol·L－1姜黃素組，每組5 個(gè)復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)24 h 后終止培養(yǎng)，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。37 ℃孵育2 h 后，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 處的吸光度（A） 值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=（加藥組A 值－空白組A 值） /（對(duì)照組A 值－空白組A 值） ×100%。

1.9 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移率

細(xì)胞分組同“1.8”，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2 細(xì)胞，均勻接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入5×105個(gè)細(xì)胞。常規(guī)條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿板底時(shí)，用200 μL 移液器吸頭于6 孔板孔中心軸處劃1 條均勻直線。用PBS 緩沖液洗去劃落的細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞中加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，不同劑量姜黃素組細(xì)胞中分別加入含10 和20 μmol·L－1姜黃素的培養(yǎng)基。按0 和24 h 取樣，于倒置熒光顯微鏡下拍照，采用Image J 軟件處理分析記錄劃痕面積，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0 h 劃痕面積－24 h 劃痕面積） /0 h 劃痕面積×100%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度，各組斑馬魚存活數(shù)、畸形數(shù)和移植瘤熒光強(qiáng)度，各組細(xì)胞增殖率和遷移率均符合正態(tài)分布，以x±s表示，2組間樣本均數(shù)（2組細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度） 比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差不齊采用Tamhane’s T2 （M） 法分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CM-DiI 標(biāo)記后2 組細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度

體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)細(xì)胞膜紅色熒光染色劑CM-DiI 標(biāo)記，連續(xù)5 d 細(xì)胞計(jì)數(shù)，與對(duì)照組比較，CM-Dil 組細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.642，P＞0.05）（圖1）。顯微鏡下觀察：紅色熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞數(shù)的增加而增強(qiáng)（圖2），表明CM-Dil 染料對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，可用于體外活細(xì)胞標(biāo)記并反映細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

圖1 CM-DiI 標(biāo)記后各組CNE-2 細(xì)胞數(shù)Fig.1 Number of CNE-2 cells in various groups after CM-DiI labeling

圖2 CM-DiI 標(biāo)記后不同時(shí)間CNE-2 細(xì)胞熒光強(qiáng)度（×40）Fig.2 Fluorescence intensities of CNE-2 cells after CM-DiI labeling (×40)

2.2 各組斑馬魚存活數(shù)和體內(nèi)移植瘤熒光強(qiáng)度

在5 dpf 時(shí)，與對(duì)照組（71±1） 比較，PBS 組斑馬魚存活數(shù)（72±2） 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組和PBS 組比較，模型組斑馬魚存活數(shù)（58±3） 明顯減少（P＜0.01）。注射后第1、3 和5 天（即3、5 和7 dpf） 模型組斑馬魚體內(nèi)紅色熒光細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，熒光強(qiáng)度分別為（21.084±1.102）、（24.351±0.365） 和（28.572±1.36） 像素×106；與3 dpf 比較，7 dpf 模型組斑馬魚體內(nèi)移植瘤熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。提示CM-Dil 染料可用于體內(nèi)活細(xì)胞標(biāo)記反映細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。見(jiàn)圖3。

圖3 顯微注射后各組斑馬魚存活數(shù)和斑馬魚體內(nèi)移植瘤熒光強(qiáng)度Fig.3 Survival number and fluorescence intensity of transplanted tumor of zebrafish in various groups after microinjection

2.3 模型組斑馬魚移植瘤組織形態(tài)表現(xiàn)

與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚腫瘤組織生長(zhǎng)良好，無(wú)明顯壞死，細(xì)胞核形態(tài)大且明顯，邊緣清晰，細(xì)胞膜完整，偶有空泡。見(jiàn)圖4。

圖4 斑馬魚移植瘤組織形態(tài)表現(xiàn)Fig.4 Morphology of transplanted tumor tissue of zebrafishes

2.4 姜黃素體內(nèi)給藥濃度

斑馬魚暴露于含姜黃素的飼養(yǎng)水2 d，在濃度小于或等于5.000 μmol·L－1姜黃素處理組中，斑馬魚未發(fā)生死亡及毒性反應(yīng)，而姜黃素濃度增加至7.500 和10.000 μmol·L－1時(shí)，可誘發(fā)斑馬魚死亡以及畸形，死亡率分別為（16.7±3.3）% 和（46.7±3.3）%。見(jiàn)圖5 和表1。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將5.000 μmol·L－1作為最大安全濃度。選取0.625、1.250、2.500 和5.000 μmol·L－1姜黃素進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，用于評(píng)價(jià)姜黃素對(duì)鼻咽癌移植瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。

表1 不同濃度姜黃素作用48 h 后斑馬魚死亡率和畸形數(shù)Tab.1 Rates of death and number of deformity of zebrafishes after treated with different concentrations of curcumin for 48 h(n=30，±s）

表1 不同濃度姜黃素作用48 h 后斑馬魚死亡率和畸形數(shù)Tab.1 Rates of death and number of deformity of zebrafishes after treated with different concentrations of curcumin for 48 h(n=30，±s）

Group Control Curcumin（μmol·L－1）0.625 1.250 2.500 5.000 7.500 10.000 Number of death 0 0 0 0 0 5±1 14±1 Rate of death (η/%)0 0 0 0 0 16.7±3.3 46.7±3.3 Number of deformity 0 0 0 0 0 6±1 11±2

圖5 不同濃度姜黃素作用后斑馬魚的畸形情況Fig.5 Malformation of zebrafishes after treated with different concentrations of curcumin

2.5 姜黃素干預(yù)后各組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度

姜黃素干預(yù)48 h 后，顯微鏡下觀察各組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度。與對(duì)照組（0 μmol·L－1組） 比較，0.625 和1.250 μmol·L－1姜黃素組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2.500 和5.000 μmol·L－1姜黃素組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖6 和表2。

表2 姜黃素作用48 h 后各組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度Tab.2 Fluorescence intensities of transplanted tumor of zebrafishes in various groups after treated with curcumin for 48 h (n=30，±s，pixel×106）

表2 姜黃素作用48 h 后各組斑馬魚移植瘤熒光強(qiáng)度Tab.2 Fluorescence intensities of transplanted tumor of zebrafishes in various groups after treated with curcumin for 48 h (n=30，±s，pixel×106）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control Curcumin（μmol·L－1）0.625 1.250 2.500 5.000 Fluorescence intensity 24.351±0.298 24.187±0.660 24.356±0.752 22.510±0.211*18.844±0.154**

圖6 體式顯微鏡下觀察各組斑馬魚移植瘤的熒光強(qiáng)度Fig.6 Fluorescence intensities of transplanted tumor of zebrafishes in various groups

2.6 各組發(fā)生頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)

與對(duì)照組比較，0.625、1.250和2.500 μmol·L－1姜黃素組發(fā)生頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)有所減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），5.000 μmol·L－1姜黃素組發(fā)生頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7 各組斑馬魚移植瘤表現(xiàn)（A,B）和發(fā)生頭尾部轉(zhuǎn)移的斑馬魚數(shù)（C）Fig.7 Performance of transplanted tumor of zebrafishes (A,B) and number of zebrafishes with head and tail metastasis (C)after treated with different concentrations of curcumin

2.7 姜黃素作用后各組CNE-2 細(xì)胞增殖率

給藥24 h 后，對(duì)照組和10 及20 μmol·L－1姜黃素組CNE-2 細(xì)胞增殖率分別為100%、（80.8±1.0） % 和（63.8±2.7） % 。與對(duì)照組 比較，10 和20 μmol·L－1黃素組CNE-2 細(xì)胞增殖率明顯降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性。

2.8 各組CNE-2 細(xì)胞遷移率

與對(duì)照組（93.7%±2.0%） 比較，10 和20 μmol·L－1姜黃素組細(xì)胞遷移率（87.9%±2.0%和 79.0%±3.0%） 明顯降低（P＜0.01） 。見(jiàn)圖8。

圖8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組CNE-2 細(xì)胞遷移情況(×40)Fig.8 Cell migration of CNE-2 cells in various groups detected by wound healing assay(×40)

3 討 論

目前，斑馬魚疾病模型涉及廣泛，包括血液疾病［10］、心血管疾?。?1］、癌癥［12］、骨骼疾?。?3］、代謝疾?。?4］和傳染?。?5］等。基于斑馬魚研究平臺(tái)，結(jié)合中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)和特色，中藥的活性篩選和毒性評(píng)價(jià)相關(guān)研究正逐漸深入［16］。LI 等［17］研究發(fā)現(xiàn)：補(bǔ)骨脂酚能夠降低斑馬魚異種移植中乳腺癌MCF-7細(xì)胞數(shù)量而死亡率并未升高。YANG 等［18］利用斑馬魚模型對(duì)西藏大戟化合物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：大戟化合物對(duì)人肺癌A549 細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用和抗血管生成作用。GUO 等［19］建立乳腺癌異種移植瘤斑馬魚模型，檢測(cè)防己黃芪湯對(duì)異種腫瘤斑馬魚上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 生物標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)控，結(jié)果顯示：防己黃芪湯可以明顯降低Snail 家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2 （Snail family transcriptional repressor 2，Snail2）、鋅指E-box 結(jié)合同源框2 （zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2）、 Twist 家 族BHLH 轉(zhuǎn)錄因子1 （Twist family bhlh transcription factor 1，TWIST1） 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β （transforming growth factor-β，TGF-β） 等的表達(dá)，并增加上皮鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-cadherin） 的表達(dá)，從而揭示了防己黃芪湯在體內(nèi)抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲的相關(guān)作用機(jī)制。ZHOU 等［20］證明：涼膈散在斑馬魚炎癥模型和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 刺激的RAW 264.7 細(xì)胞中具有抗炎活性，且與磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK） 和磷酸化神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的基因B （phosphorylated nerve growth factor-induced gene B，NGFI-B） 的抑制有關(guān)。

然而，斑馬魚模型也有一定的局限性［12，21］：與哺乳動(dòng)物比較，斑馬魚特殊的給藥方式和藥物吸收方式會(huì)影響藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)；斑馬魚胚胎和幼魚體積較小，不易操作，且較難收集足夠的組織；異種胚胎保持在35 ℃時(shí)有利于斑馬魚的發(fā)育，但可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響；斑馬魚研究方法和檢測(cè)指標(biāo)尚不完善，目前可用的實(shí)驗(yàn)儀器和抗體較少。因此，必須進(jìn)一步推進(jìn)斑馬魚動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)化，并結(jié)合CRISPR 基因編輯技術(shù)、新興成像技術(shù)和新的行為方法等前沿技術(shù)［22］，開(kāi)展全面深入的分子機(jī)制研究，從而推動(dòng)醫(yī)學(xué)對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)和治療。

本研究構(gòu)建了斑馬魚鼻咽癌移植瘤模型，確定2.5 和5.0 μmol·L－1姜黃素作為干預(yù)模型的藥物濃度，證實(shí)了姜黃素對(duì)斑馬魚鼻咽癌移植瘤細(xì)胞增殖和遷移具有抑制作用，并在體外CNE-2 細(xì)胞中得到了一致的結(jié)論。本研究結(jié)果表明：姜黃素具有成為抗鼻咽癌藥物的潛能，同時(shí)斑馬魚移植瘤模型也可以成為鼻咽癌腫瘤研究和藥物評(píng)價(jià)的重要模型。未來(lái)本課題組將在基因和蛋白水平探討姜黃素體內(nèi)抗腫瘤的分子機(jī)制，為中藥抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。