C3a-C3aR 軸通過巨噬細(xì)胞向M1 型極化對(duì)慢性牙周炎模型小鼠炎癥反應(yīng)和組織損傷的影響

任飛龍, 羅環(huán)宇, 鄭適澤, 范心怡, 任春霞, 孟 圓, 趙 紅, 史 冊(cè), 孫宏晨

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130021）

慢性牙周炎是以牙菌斑為始動(dòng)因子的發(fā)生于牙周支持組織（包括牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)） 的慢性進(jìn)行性破壞性疾病。牙周炎不僅危害口腔健康，而且可以增加許多系統(tǒng)性疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)［1］，如糖尿病［2］、關(guān)節(jié)炎［3］、不良妊娠［4］和阿爾茲海默?。?］。目前臨床上常用的牙周炎治療方法多數(shù)是針對(duì)清除牙周微生物設(shè)計(jì)的，如牙周藥物治療、牙周基礎(chǔ)治療和牙周手術(shù)治療等。但是由于藥物濫用和耐藥、手術(shù)適應(yīng)證少及治療周期長(zhǎng)導(dǎo)致患者不能堅(jiān)持維護(hù)，造成牙周炎治療效果并不理想。因此積極探索牙周炎發(fā)生發(fā)展的詳細(xì)機(jī)制，尋找關(guān)鍵的治療靶點(diǎn)可能會(huì)給牙周炎的治療提供新思路和新方法。研究［6］表明：造成牙周組織破壞的主要原因不是牙周致病菌的直接作用，而是宿主為防御牙周致病菌的入侵而產(chǎn)生的過度的免疫反應(yīng)引起的。補(bǔ)體系統(tǒng)作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。研究［7］顯示：補(bǔ)體C3a 在牙周炎患者的牙周組織和齦溝液中表達(dá)升高，且與牙周炎的嚴(yán)重程度有關(guān)聯(lián)，但其參與牙周炎發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不清楚。此外，牙周炎發(fā)生過程中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，其中以M1 型巨噬細(xì)胞為主［8］。M1 型巨噬細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞的一種亞型，通過表達(dá)多種受體（補(bǔ)體受體及模式識(shí)別受體等） 和分泌多種炎癥因子［腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β） 和干擾素（interferon，IFN） 等］ 發(fā)揮吞噬和殺傷細(xì)菌及介導(dǎo)免疫炎癥過程的作用。巨噬細(xì)胞高表達(dá)C3a 受體（C3a receptor，C3aR），因此推測(cè)C3a-C3aR 軸通過介導(dǎo)M1 型巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)牙周炎小鼠牙槽骨喪失。本研究以C3ar基因敲除的絲線結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎小鼠為研究對(duì)象［9-10］，采用顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro computerized tomography，Micro-CT） 評(píng)價(jià)小鼠牙槽骨的吸收，采用HE 染色觀察小鼠牙周組織的改變，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS） 和M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子精氨酸酶1 （arginase 1，Arg1） 在牙周組織中的表達(dá)，探討C3a-C3aR 軸在慢性牙周炎中的作用及其機(jī)制，為牙周炎的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器基因修飾的無特殊致病菌（specific pathogen free，SPF） 級(jí)8 周齡C57BL/6 雌性小鼠18 只，體質(zhì)量18～22 g，由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （蘇） 2018-0008，飼養(yǎng)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。重組人補(bǔ)體C3a （美國(guó)R&D System 公司），iNOS 和Arg1 抗體（中國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TRIzol （中國(guó)翊圣生物科技有限公司），iNOS、TNF-α、IL-1β 和β-actin 引物［生工生物工程（上海） 股份有限公司］，UltrasensitiveTMSP （兔和鼠）免疫組織化學(xué)試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司），DAB （北京中杉金橋生物技術(shù)公司）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 儀和高速低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司），熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），厭氧培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司），渦旋混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造廠），Micro-CT 系統(tǒng)（瑞士ScancoMedicalAG 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和建模18 只小鼠以基因型不同分為C3ar+/+組、C3ar+/－組和C3ar－/－組，每組6 只。建立慢性牙周炎模型： 5% 水合氯醛（1 mL/100 g 體質(zhì)量） 麻醉小鼠，在體視顯微鏡下，采用4-0 的聚酰胺尼龍線結(jié)扎小鼠上頜左側(cè)第二磨牙，并于頰側(cè)打結(jié)，以上頜右側(cè)第二磨牙為自身對(duì)照，術(shù)后11 d 處死小鼠。

1.3 小鼠牙槽骨吸收情況評(píng)價(jià)處死小鼠后，分

離上頜骨，4% 多聚甲醛固定24 h 后，micro-CT 掃描并進(jìn)行三維重建，Image J 軟件分別測(cè)量上頜左側(cè)第二磨牙頰、 腭側(cè)近遠(yuǎn)中位點(diǎn)釉牙骨質(zhì)界（cementum enamel junction，CEJ） 至牙槽嵴頂（alveolar bone crest，ABC） 距離，單位為mm，取4 個(gè)位點(diǎn)的平均值，判斷牙槽骨吸收程度。

1.4 HE 染色觀察小鼠牙周組織病理形態(tài)表現(xiàn)固定的單側(cè)上頜組織經(jīng)15% EDTA 溶液脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成3 μm 切片。行常規(guī)HE 染色，封片后顯微鏡下觀察牙周組織結(jié)合上皮完整性、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、附著喪失水平和牙槽骨吸收情況。

1.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠牙周組織中iNOS和Arg1 蛋白表達(dá)水平牙周組織標(biāo)本常規(guī)脫蠟至水，透明質(zhì)酸酶抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉； iNOS 抗體（稀釋比例為1∶200） 和Arg1 抗體（稀釋比例為1∶200） 37 ℃水浴鍋孵育2 h，根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒說明書滴加生物素標(biāo)記的二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素生物素工作液；DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果半定量方法：采用Image Pro Plus 5.1 圖像分析軟件，經(jīng)校準(zhǔn)后檢測(cè)牙周組織棕色部分的累計(jì)光密度（integrated optical density，IOD）值，再除以所測(cè)的面積，即代表蛋白表達(dá)水平，重復(fù)3 次取平均值。

1.6 倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)體外培養(yǎng)RAW264.7 巨噬細(xì)胞系，以5×104cm－2密度將細(xì)胞接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后分為空白組、LPS 組、C3a 組和LPS+C3a 組，分別以100 μ g·L－1LPS 和200 μg·L－1C3a 處理細(xì)胞24 h 后，倒置顯微鏡（×400） 觀察各組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。

1.7 RT-qPCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞中M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子mRNA 表達(dá)水平細(xì)胞分組同“1.6”。采用TRIzol 試劑常規(guī)提取培養(yǎng)后各組細(xì)胞的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，RT-qPCR 反應(yīng)的總體系為20 μL。引物均由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。反應(yīng)條件： 預(yù)變性95 ℃、 30 s；95 ℃、 5 s，60 ℃、 30 s，共40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線95 ℃、15 s，60 ℃、 1 min，95 ℃、 15 s。以β-actin為內(nèi)參照，采用2－△△Ct法計(jì)算各組巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β 和iNOS mRNA 表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠牙槽骨ABC 至CEJ 距離，牙周組織中Arg1 和iNOS 蛋白表達(dá)水平，各組細(xì)胞中TNF-α、 IL-1β 和iNOS mRNA 表達(dá)水平均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠牙槽骨吸收情況Micro-CT 檢查結(jié)果顯示：與自身對(duì)照側(cè)比較，C3ar+/+和C3ar+/－組小鼠結(jié)扎側(cè)牙槽骨明顯吸收，C3ar－/－組小鼠結(jié)扎側(cè)牙槽骨吸收明顯減輕。C3ar+/+組、C3ar+/－組和C3ar－/－組小鼠結(jié)扎側(cè)CEJ 到ABC 距離分別為（0.883 5±0.272 5）、（0.900 8±0.103 2） 和（0.490 2±0.321 2） mm； 與C3ar+/－組 比 較，C3ar+/+組小鼠結(jié)扎側(cè)CEJ 至ABC 距離差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）； 與C3ar+/+組和C3ar+/－組比較，C3ar－/－組小鼠結(jié)扎側(cè)CEJ 到ABC 距離明顯縮短（P＜0.01）。見圖1。

圖1 Micro-CT 三維重建觀察3 組小鼠牙槽骨吸收情況（Bar=1 mm）Fig.1 Resorption of alveolar bone of mice in various groups observed with three dimensional reconstruction of Micro-CT images (Bar=1 mm)

2.2 各組小鼠牙周組織病理形態(tài)表現(xiàn)HE 染色結(jié)果顯示：C3ar+/+組和C3ar+/－組小鼠牙周結(jié)合上皮完整性被破壞，附著遠(yuǎn)離釉牙骨質(zhì)界，結(jié)締組織內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，牙槽骨吸收明顯； 與C3ar+/+組和C3ar+/－組比較，C3ar－/－組小鼠結(jié)合上皮完整性破壞，附著靠近釉牙骨質(zhì)界，上皮下結(jié)締組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)中等，牙槽骨吸收較少。見圖2。

圖2 各組小鼠牙周組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE,×100）Fig.2 Pathomorphology of periodontal tissue of mice in various groups (HE ,×100)

2.3 各組小鼠牙周組織中iNOS 和Arg1 蛋白表達(dá)水平iNOS 和Arg1 主要表達(dá)于小鼠牙周上皮下結(jié)締組織巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，染色強(qiáng)度中等。與C3ar+/－組比較，C3ar+/+組牙周組織中Arg1 和iNOS 的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）； 分 別 與C3ar+/+組 和C3ar+/－組 比 較，C3ar－/－組小鼠牙周組織中iNOS 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），Arg1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見圖3 和4。

圖3 各組小鼠牙周組織中iNOS（A—C）和Arg1（D—F）蛋白表達(dá)情況（IHC,×400）Fig.3 Expressions of iNOS and Arg1 proteins in periodontal tissue of mice in various groups (IHC,×400)

圖4 各組小鼠牙周組織中iNOS（A）和Arg1（B）蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of iNOS（A）and Arg1（B）proteins in periodontal tissue of mice in various groups

2.4 各組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn) 倒置顯微鏡下觀察：空白組細(xì)胞多為圓形且呈分散狀生長(zhǎng)；LPS 組細(xì)胞形態(tài)多變，圓形細(xì)胞明顯減少，約90% 以上細(xì)胞伸出偽足呈樹枝狀、放射狀或長(zhǎng)梭形，與M1 型巨噬細(xì)胞形態(tài)類似；與LPS 組比較，C3a 組細(xì)胞中圓形細(xì)胞有所減少，約50% 細(xì)胞變?yōu)樗笮位蚍派錉睿f明部分細(xì)胞可能發(fā)生極化；與LPS 和C3a 組比較，LPS+C3a 組細(xì)胞幾乎無圓形，且聚集呈團(tuán)生長(zhǎng)，大部分細(xì)胞可能發(fā)生M1 極化。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)（×100）Fig.5 Morphology of cells in various groups (×100)

2.5 各組細(xì)胞中M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平與空白組比較，LPS 組、 C3a 組和LPS+C3a 組細(xì)胞中iNOS 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），LPS 組和LPS+C3a 組細(xì)胞中IL-1β mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），C3a 組細(xì)胞中IL-1β mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）； 與LPS 組比較，C3a 組細(xì)胞中iNOS 、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），LPS+C3a 組細(xì)胞中iNOS 、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與C3a 組比較，LPS+C3a 組細(xì)胞中iNOS 、IL-1β 和TNF- α mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞中iNOS 、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of iNOS, IL-1β and TNF-α mRNA in cells in various groups (n=3，±s）

表1 各組細(xì)胞中iNOS 、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of iNOS, IL-1β and TNF-α mRNA in cells in various groups (n=3，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs LPS group；#P＜0.05 vs C3a group.

Group Blank LPS C3a LPS+C3a iNOS mRNA 1.00±0.06 38.76±0.47*2.26±0.12*△210.35±1.74*△#IL-1β mRNA 1.00±0.05 6.73±0.49*1.07±0.05△7.43±0.23*△#TNF-α mRNA 1.00±0.08 7.91±0.43*1.14±0.04*△10.53±0.51*△#

3 討 論

鑒于牙周炎所造成的軟組織損傷和牙槽骨喪失主要是由過度的免疫炎癥反應(yīng)引起的，因此從免疫角度探索牙周炎發(fā)生的相關(guān)機(jī)制可能為有效治療牙周炎帶來希望［11］。研究［12-14］表明：在牙周組織中許多細(xì)胞可以表達(dá)C3a 和C3aR，如各種免疫細(xì)胞（包括單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和肥大細(xì)胞等）、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞等，其中免疫細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞是主要表達(dá)C3a 和C3aR 的細(xì)胞類型。由于巨噬細(xì)胞極化在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［15］，因此本研究探討了C3a-C3aR 軸是否能通過影響巨噬細(xì)胞的功能在小鼠牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮生物學(xué)作用。

研究［16-18］表明：C3a 與C3aR 結(jié)合后會(huì)介導(dǎo)一系列的生物學(xué)效應(yīng)，通過增加細(xì)胞外蛋白調(diào)節(jié)激酶1/2 （extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2） 的磷酸化調(diào)控ATP 外流和促進(jìn)NOD 樣受體蛋白3 （NOD-like receptor protein 3，NLRP3） 凋亡小體的活化，進(jìn)而介導(dǎo)人單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌炎癥因子IL-Iβ；通過調(diào)控Ca2+的釋放促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒和分泌趨化因子進(jìn)而在超敏反應(yīng)中發(fā)揮作用，通過趨化巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)至肌肉損傷部位促進(jìn)骨骼肌損傷后修復(fù)。此外，C3a-C3aR 軸能夠通過ERK1/2、 核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB） 和信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1 （signal transducer and activator of transcription，STAT1） 等信號(hào)通路促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞極化，在小鼠單側(cè)輸尿管阻塞中加快腎臟的纖維化［19］。與以上結(jié)果相類似，本研究結(jié)果顯示：C3a-C3aR 軸能夠增加牙周炎癥組織中M1 型巨噬細(xì)胞的數(shù)量及M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)一步證明了C3a-C3aR 軸在調(diào)控巨噬細(xì)胞極化方面的作用，并且可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)介導(dǎo)牙周炎癥和軟組織破壞。

由于牙周炎的主要特征是牙槽骨喪失，而破骨細(xì)胞是牙周組織中唯一能夠?qū)е卵啦酃瞧茐牡募?xì)胞。體外研究［20］表明：C3a 可以與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的C3aR 結(jié)合直接促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，該生物學(xué)效應(yīng)可能參與了慢性牙周炎牙槽骨破壞，而本研究結(jié)果提供了另外一種可能，即C3a-C3aR軸可能通過調(diào)控M1 型巨噬細(xì)胞極化進(jìn)而導(dǎo)致牙槽骨丟失，一方面是因?yàn)镸1 型巨噬細(xì)胞能夠分泌多種炎癥因子，如白細(xì)胞介素6 （interleukin-6 ，IL-6）、 白細(xì)胞介素1 （interleukin-1，IL-1）、TNF-α和前列腺素E2 （prostaglandin E2，PGE2） 等，可以作為破骨細(xì)胞分化和激活的刺激因子，在骨吸收中發(fā)揮作用［21-22］；另一方面是因?yàn)镸1 型巨噬細(xì)胞可以刺激Th17 的分化，而Th17 細(xì)胞能夠大量表達(dá)核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL），進(jìn)而增加破骨細(xì)胞的形成導(dǎo)致牙槽骨破壞［23］。研究［24］顯示：誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞極化能夠明顯減輕牙周炎模型小鼠的牙槽骨喪失。本研究結(jié)果顯示：C3ar敲除后，代表M1/M2 型巨噬細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平比例降低，同時(shí)小鼠牙周炎的牙槽骨喪失減少，進(jìn)一步證明了C3a-C3aR 軸可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化介導(dǎo)破骨活動(dòng)導(dǎo)致牙槽骨破壞。

綜上所述，本研究通過分析C3ar敲除的牙周炎小鼠影像學(xué)和組織學(xué)表現(xiàn)，證明C3a 可能通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 型極化介導(dǎo)牙周組織炎癥和牙槽骨喪失。證實(shí)了作為宿主抗牙周致病菌的前沿，補(bǔ)體系統(tǒng)和M1 型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的過度免疫炎癥反應(yīng)會(huì)加速牙周炎的發(fā)生發(fā)展，提示以補(bǔ)體C3a 作為靶點(diǎn)治療牙周炎的潛在可能性。但是在牙周炎微環(huán)境中，補(bǔ)體系統(tǒng)和巨噬細(xì)胞的活化及功能受多種因子的調(diào)節(jié)，如何更好地調(diào)控二者的免疫反應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)而有效發(fā)揮各自的免疫防御作用，仍需進(jìn)一步探索。