基于響應(yīng)面法優(yōu)化黑參酸乳工藝研究

尹智彥，韓 梅，林紅梅，楊利民

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

功能性食品是指具有特定營(yíng)養(yǎng)保健功能的食品，被譽(yù)為“21世紀(jì)食品”。酸奶作為一款發(fā)酵乳制品，因具有改善睡眠[1]、維護(hù)腸道菌群的生態(tài)平衡[2]等功效而受到消費(fèi)者的青睞。黑參作為人參炮制品，經(jīng)九蒸九曬工藝所得。轉(zhuǎn)變?yōu)楹趨⒌纳鷷駞?，不僅表面色澤有所改變，其有效成分和藥理活性也發(fā)生了變化，形成特有皂苷。研究發(fā)現(xiàn)，黑參中的單體皂苷Rg5具有使乳腺癌細(xì)胞凋亡[3]和保護(hù)心功能的潛力[4]，并且Park等[5]就黑參對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）的影響研究發(fā)現(xiàn)，黑參可能為預(yù)防NAFLD的一種潛在藥物。基于黑參特有的活性成分，以及保健品消費(fèi)市場(chǎng)的擴(kuò)大，黑參食品種類也有所增多。高雪峰等[6]以20%黑參濃縮液、30%桑椹濃縮液、10%黃精濃縮液和20%蜂蜜研制出一款新型黑參飲品，該產(chǎn)品不僅具有黑參與桑椹的混合香味，并且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，可作為一款日常飲品。郭勁廷等[7]以黑參和黑蒜為原料，研制了一款營(yíng)養(yǎng)豐富且受大眾喜愛(ài)的天然抗疲勞飲料。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)及Box-Benhnken（BBD）響應(yīng)面試驗(yàn)研制黑參酸乳，以期促進(jìn)人參及其炮制品在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，同時(shí)將中草藥的有效成分與具有保健功能的酸奶相結(jié)合，為新型保健品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

黑參：選取根須完整的生曬參，參考喬雪[8]的黑參炮制工藝制得；菌粉：10菌型（由保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、開(kāi)菲爾菌、乳雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌等加麥芽糊精混合組成），昆山佰生優(yōu)生物科技有限公司；白砂糖、牛奶、礦泉水，均為市售。

石英砂、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、鹽酸、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、冰乙酸、酒石酸鉀鈉、氯化鈉、甲醇、乙腈（色譜純），結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂、MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基（海博生物）、改良MRS微生物檢測(cè)配套試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

K9860型全自動(dòng)凱氏定氮儀、DL-820E型智能超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司；AUY220型電子天平，日本島津公司；GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、GI54DWS型高壓蒸汽滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司；PharmaSpec UV-1700型可見(jiàn)分光光度計(jì)、1260 infinityⅡ型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

純牛奶300 mL→預(yù)熱（60℃、3 min）→冷卻后加入混勻的白砂糖及黑參粉→均質(zhì)（均質(zhì)帶）充分混勻→滅菌（60℃，30 min）→冷卻→添加菌粉→恒溫發(fā)酵→后熟（4℃，12 h）→成品

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合大量文獻(xiàn)與預(yù)試驗(yàn)初步確定黑參酸乳的工藝基礎(chǔ)條件為：1.5 g黑參粉，1.0 g菌粉，24 g白砂糖，于39℃發(fā)酵6 h。在此基礎(chǔ)上選取不同黑參粉添加量（1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 g）、菌粉添加量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g）、白砂糖添加量（6、12、18、24、30、36 g）、發(fā)酵時(shí)間（4、6、8、10、12、14 h）及發(fā)酵溫度（35、37、39、41、43、45℃）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，采用主成分分析法對(duì)酸乳脂肪、微生物和感官品質(zhì)評(píng)分等9個(gè)生化指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，從而確定各因素的適宜值。

1.2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將菌粉添加量、白砂糖添加量、黑參粉添加量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度作為考察因素，感官品質(zhì)評(píng)分作為響應(yīng)值，進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)并設(shè)計(jì)高低2個(gè)水平，試驗(yàn)因素水平參見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平表Table 1 Plackett-Burman test factors and levels table

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素和PB試驗(yàn)為基礎(chǔ)，將因素發(fā)酵溫度（A）、黑參粉添加量（B）和白砂糖添加量（C）作為自變量，感官評(píng)分（Y）作為因變量進(jìn)行BBD試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表2。

表2 BBD試驗(yàn)因素水平表Table 2 BBD test factors and levels table

1.2.5 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.5.1 理化指標(biāo)

脂肪含量：參照GB 5009.6—2016[9]中的方法測(cè)定；蔗糖含量：參照GB 5009.8—2016[10]中的方法測(cè)定；酸度：參照GB 5413.34—2010[11]中的方法測(cè)定；蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2016[12]中的方法測(cè)定；持水力：參考畢宇[13]的測(cè)定方法；非脂乳固體含量：參照GB 5413.39—2010[14]中的方法測(cè)定。

1.2.5.2 微生物指標(biāo)

參照GB 4789.35—2016[15]中的方法測(cè)定。

1.2.5.3 人參皂苷

采用超聲提取-高效液相色譜法[16]測(cè)定。樣品前處理：精密稱取30 mL人參粉水溶液（7.2 g黑參粉加入300 mL水中）或人參酸乳置于錐形瓶中，加入30 mL甲醇，90 Hz超聲提取30 min，將上層清液過(guò)濾，重復(fù)3次，合并濾液，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，于60℃水浴蒸發(fā)，定容至5 mL棕色容量瓶，過(guò)0.22μm針孔濾膜，用于高效液相檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.6 感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

由10位同學(xué)組成感官評(píng)定小組，根據(jù)表3分別對(duì)黑參酸乳的色澤、組織狀態(tài)、滋味和氣味進(jìn)行綜合評(píng)分。將酸乳從冰箱取出，靜置15 min后取適量置于透明杯中，于自然光下觀察其色澤和組織狀態(tài)，聞其味后用溫開(kāi)水漱口品其味，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果取平均值。

表3 黑參酸奶感官品質(zhì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory scoring criteria of black ginseng yoghurt

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行主成分分析，Design-Expert 8.0.6進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)和Box-Benhnken試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、分析，應(yīng)用WPS Office繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 白砂糖添加量的篩選

主成分分析是利用降維的方式，在保證數(shù)據(jù)損失最少的前提下，將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)綜合指標(biāo)的一種多變量數(shù)據(jù)的最佳綜合簡(jiǎn)化的統(tǒng)計(jì)方法[17]。由表4可知，對(duì)不同白砂糖添加量酸乳的生化指標(biāo)進(jìn)行主成分分析后，前2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到89.97%，即能夠解釋89.97%的信息。其中主成分1的貢獻(xiàn)率為57.28%，特征值為5.16；主成分2的貢獻(xiàn)率為32.69%，特征值為2.94。在表4的基礎(chǔ)上根據(jù)綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值、權(quán)重求得各添加量的綜合評(píng)價(jià)值，綜合評(píng)價(jià)值（D值）越高產(chǎn)品品質(zhì)越好，各單因素的適宜添加量均按此方法計(jì)算。根據(jù)圖1可知，確定36 g白砂糖為適宜添加量。

圖1 不同白砂糖添加量綜合評(píng)價(jià)值Fig.1 Comprehensive evaluation values of different white granulated sugar additions

2.1.2 菌粉添加量的篩選

由表5可知，主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率分別為51.03%、27.92%，特征值分別為4.59和2.51，其中主成分1所占比重較大，代表了脂肪、持水力、蔗糖、蛋白質(zhì)、乳桿菌和感官評(píng)分。根據(jù)圖2綜合評(píng)價(jià)值的大小，將1.0 g菌粉確定為適宜添加量。

圖2 不同菌粉添加量的綜合評(píng)價(jià)值Fig.2 Comprehensive evaluation values of different bacterial powder additions

表5 不同菌粉添加量各綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 5 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different bacterial powder additions

2.1.3 發(fā)酵溫度的篩選

如表6所示，主成分1的貢獻(xiàn)率為48.19%，主成分2的貢獻(xiàn)率為34.21%，由二者可知不同發(fā)酵溫度對(duì)于蛋白質(zhì)、持水力、嗜熱鏈球菌以及乳桿菌有較大的影響。根據(jù)圖3確定選擇39℃為適宜發(fā)酵溫度。

圖3 不同發(fā)酵溫度綜合評(píng)價(jià)值Fig.3 Comprehensive evaluation values of different fermentation temperatures

表6 不同發(fā)酵溫度各綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 6 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different fermentation temperatures

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的篩選

由表7可知，主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率分別為56.25%和21.83%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到78.08%。主成分1代表了酸度、持水力、蔗糖、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌、乳桿菌和感官評(píng)分。根據(jù)圖4的綜合評(píng)價(jià)值，將10 h確定為適宜發(fā)酵時(shí)間。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間綜合評(píng)價(jià)值Fig.4 Comprehensive evaluation values of different fermentation time

表7 不同發(fā)酵時(shí)間各綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 7 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different fermentation time

2.1.5 黑參粉添加量的篩選

如表8所示，主成分1、主成分2和主成分3的貢獻(xiàn)率分別為43.68%、24.81%和13.83%，其中主成分1和主成分2所占比重較大，可知不同黑參粉添加量對(duì)于酸度、乳桿菌、持水力、蛋白質(zhì)和感官評(píng)分有較大影響。根據(jù)圖5確定適宜黑參粉添加量為7.5 g。

圖5 不同黑參粉添加量綜合評(píng)價(jià)值Fig.5 Comprehensive evaluation values of different black ginseng powder additions

表8 不同黑參粉添加量各綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 8 Comprehensive indicator coefficients and contribution rates of different black ginseng powder additions

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表9，方差分析見(jiàn)表10。由表10可知，該模型的P＜0.05，達(dá)到顯著水平，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。發(fā)酵溫度和黑參粉添加量的P值分別為0.019 3和0.020 8，表明該因素對(duì)酸乳品質(zhì)影響顯著（P＜0.05）。根據(jù)P值進(jìn)行顯著性排序：發(fā)酵溫度＞黑參粉添加量＞白砂糖添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞菌粉添加量。結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果及各因素的P值大小，綜合選擇發(fā)酵溫度、黑參粉添加量和白砂糖添加量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表9 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 9 Plackett-Burman test design and results

表10 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 10 Variance analysis of Plackett-Burman test results

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

將因素A、B和C作為自變量，感官品質(zhì)評(píng)分為因變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表11所示。通過(guò)分析得出方程Y=86.30+1.99A-0.075B-0.24C-1.55AB-0.98AC+0.6BC-2.46A2-2.79B2-2.21C2。由表12可知，模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.149 5），表明模型誤差較小。模型R2=0.977 2，R2adj=0.947 9，表明模型擬合度較高，可以解釋94.79%響應(yīng)值的變化，適用于黑參酸乳發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

表11 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 11 BBD test design and results

表12 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 12 Variance analysis of BBD experiment results

2.3.2 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖和等高線圖可進(jìn)一步反映因素間交互作用對(duì)酸乳感官品質(zhì)的影響。由圖6可知，響應(yīng)曲面皆開(kāi)口向下，表明試驗(yàn)范圍內(nèi)的感官品質(zhì)評(píng)分呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，并且等高線圖基本呈橢圓形，表明因素A與B、A與C間的交互作用顯著，且等高線中心也位于考察區(qū)域中心，表明回歸方程具有極大值。

圖6 各因素交互作用對(duì)黑參酸乳感官品質(zhì)影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the interaction effects of different factors on the sensory qualities of black ginseng yogurt

2.3.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果得到黑參酸乳的預(yù)測(cè)工藝條件及感官品質(zhì)評(píng)分的預(yù)測(cè)值，即黑參粉7.24 g、白砂糖34.89 g，于39.99℃下發(fā)酵，酸乳的感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為86.919 4分。結(jié)合實(shí)際情況，將條件調(diào)整為黑參粉7.2 g、白砂糖34.9 g、發(fā)酵溫度41℃，并進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，該工藝所得酸乳不僅口感細(xì)膩、酸甜適宜，且具有類似于咖啡的滋味和色澤。黑參酸乳的實(shí)際評(píng)分值與預(yù)測(cè)值相近，為86.5分，表明響應(yīng)面結(jié)果具有較高的可信度及應(yīng)用價(jià)值。

2.4 產(chǎn)品品質(zhì)評(píng)價(jià)

將同條件下未添加參粉的酸乳作為對(duì)照（CK），與黑參酸乳進(jìn)行品質(zhì)對(duì)比。由表13可知，黑參酸乳的脂肪含量為3.89 g/100 g（＞3.1 g/100 g），蛋白質(zhì)含量為3.23 g/100 g（＞2.9 g/100 g），蔗糖含量為10.50 g/100 g，非脂乳固體含量為9.33 g/100 g（＞8.1 g/100 g），酸度為92°T（＞70°T），相較于對(duì)照，黑參酸乳的營(yíng)養(yǎng)成分有所增加，但增幅較小。綜上所述，黑參酸乳的理化指標(biāo)不僅高于我國(guó)發(fā)酵乳食品安全標(biāo)準(zhǔn)，而且優(yōu)于同等條件下的對(duì)照酸乳?？梢?jiàn)，黑參酸乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有所提高，并且黑參粉的添加賦予了酸乳額外的健康特性。

表13 黑參酸乳理化指標(biāo)對(duì)比Table 13 Comparison of physicochemical indicators in black ginseng yogurt

益生菌為已確認(rèn)功效因子，主要為乳酸菌類。由表14可知，黑參酸乳的嗜熱鏈球菌數(shù)、雙歧桿菌數(shù)和乳桿菌數(shù)分別為2.67×109CFU/mL、5.30×108CFU/mL和3.45×106CFU/mL，而對(duì)照酸乳的嗜熱鏈球菌數(shù)、雙歧桿菌數(shù)和乳桿菌數(shù)為9.40×108CFU/mL、3.30×108CFU/mL和1.15×106CFU/mL，黑參酸乳的益生菌數(shù)不僅達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)且顯著高于標(biāo)準(zhǔn)量。相較于對(duì)照，黑參酸乳的含菌量均極顯著增加（P＜0.01），其中嗜熱鏈球菌數(shù),相較對(duì)照增加了184.04%，與梁海艷[18]和王銀平[19]在人參酸奶的研究中得到的結(jié)果相同。黑參酸乳中益生菌的增加，可能是黑參含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為益生菌的增殖提供了能量。

表14 黑參酸乳微生物數(shù)對(duì)比Table 14 Comparison of microbial numbers in black ginseng yogurt

2.5 酸乳皂苷含量

人參皂苷為人參主要藥效成分，具有抗抑郁、促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷組織修復(fù)等功效。如表15所示，黑參水溶液的皂苷種類包括Rf、Rd、Rb3、Rg3和Rh2，皂苷含量分別為0.08、0.89、0.66、2.81、0.10 mg/g。黑參酸乳中的皂苷種類包括Rf、Rb3、Rg3、Rh2和Rd，皂苷含量分別為0.03、0.39、2.50、0.07、0.95 mg/g。發(fā)酵前后的皂苷變化可能與益生菌中存在的某些酶類有關(guān)[20]。陳麗艷等[21]在人參豆豉發(fā)酵工藝以及人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化研究中也發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵可實(shí)現(xiàn)多種人參皂苷的體外轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)60%以上。

表15 皂苷含量對(duì)比Table 15 Comparison of ginsenoside contents 單位：mg·g-1

3 結(jié)論與討論

本研究以黑參為原料，通過(guò)添加白砂糖和菌粉經(jīng)恒溫發(fā)酵得到一款黑參酸乳。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)得到酸乳優(yōu)化工藝為：黑參粉7.2 g，白砂糖34.9 g，菌粉1.0 g，發(fā)酵溫度41℃，發(fā)酵時(shí)間10 h。

本試驗(yàn)將黑參與酸乳結(jié)合研制黑參酸乳，其各項(xiàng)生化指標(biāo)均符合發(fā)酵乳國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，而且兼具中藥活性成分，增加了酸乳的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，為人參及其制品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。根據(jù)《中華人民共和國(guó)食品安全法》和《新資源食品管理辦法》規(guī)定人參食用量為≤3 g/d，因此建議黑參酸乳的推薦食用量≤120 mL/d。孕婦、哺乳期婦女及14周歲以下的兒童不宜食用。