基于高通量分子對接技術(shù)篩選干預(yù)COVID-19的潛在活性分子及中藥

祁建宏，董芳旭，王 軻，劉子銘，朱錦璐

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 外國語學(xué)院，濟(jì)南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，濟(jì)南 250355)

目前，SARS-CoV-2已經(jīng)蔓延到全球100多個國家和地區(qū)，許多國家面臨疫情的二次暴發(fā)?，F(xiàn)在仍然缺少針對該病毒的特效藥物，抗病毒藥物亟待研發(fā)，主要的藥物研究策略包括老藥新用、廣譜抗病毒藥物的重定位以及分子靶向藥物的開發(fā)[1]。ACE2已被證實(shí)是SARS-CoV和SARS-CoV-2的受體[2]，且SARS-CoV-2與ACE2的結(jié)合能力比SARS-CoV與ACE2的結(jié)合能力更強(qiáng)[3]，如此高的結(jié)合能力證實(shí)了SARS-CoV-2的高傳染性。3CL pro又稱主蛋白酶(Mpro)，是復(fù)制新冠病毒所必需的酶，它可能在切割病毒多聚蛋白，促進(jìn)SARS-CoV-2復(fù)制及干擾宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[4]。AXL起源于古希臘語“anexelekto”，意思是“過度的，無法控制的”[5]。20世紀(jì)80年代，AXL被首次從慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者中分離和檢測出來[6]。AXL是一種受體酪氨酸激酶，屬于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞家族，可在上皮、間充質(zhì)和造血細(xì)胞系中廣泛表達(dá)。它可以通過與生長停滯特異性蛋白6(Gas6)結(jié)合激活酪氨酸激酶，從而激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途徑、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑、核因子-κB(NF-κB)途徑等[7-8]。然而，異常的AXL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將導(dǎo)致炎癥、自身免疫性疾病和癌癥[9]。近年來，AXL在多種腫瘤中的高表達(dá)備受關(guān)注。相關(guān)研究表明，AXL參與腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖和侵襲，與腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制密切相關(guān)[8,10]。目前，已有批準(zhǔn)上市的AXL抑制劑藥物，表明AXL已成為一個重要的藥物靶點(diǎn)[11]。

目前，抗COVID-19靶向藥物的研究主要集中在ACE2和3CL pro，靶點(diǎn)數(shù)量相對較少，難以發(fā)揮協(xié)同抗病毒作用。值得注意的是，2021年由Cell Research報(bào)道的AXL是抗COVID-19的新型潛在宿主靶標(biāo)，并表現(xiàn)出良好的抗病毒活性[12]。研究者認(rèn)為ACE2主要在人體腎臟和消化系統(tǒng)中表達(dá)，但表達(dá)量很低，難以支持SARS-CoV-2的高傳染性理論，因此推測可能存在其他重要受體。研究者通過SARS-CoV-2感染實(shí)驗(yàn)和計(jì)算生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果表明，AXL可能是一種不同于ACE2的新型受體，幾乎可以在所有類型的呼吸細(xì)胞中高表達(dá)。此外，作為一種重要的跨膜蛋白，AXL介導(dǎo)著SARS-CoV-2在呼吸道細(xì)胞中的吸附和內(nèi)化。本研究基于AXL、ACE2和3CL pro篩選COVID-19的潛在活性分子(PAM)，并預(yù)測潛在中藥，為抗COVID-19藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小分子數(shù)據(jù)庫的建立

本研究基于TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)[13]數(shù)據(jù)庫篩選了COVID-19的潛在活性小分子，該數(shù)據(jù)庫是世界上最大的中藥非商業(yè)分子數(shù)據(jù)庫之一。本實(shí)驗(yàn)將TCMSP數(shù)據(jù)庫中的13 020個小分子作為研究對象，通過python腳本[14]下載所有小分子的MOL2格式文件，建立用于分子對接的小分子數(shù)據(jù)庫。

1.2 共同靶標(biāo)PAM的初步篩選

本研究采用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)抗COVID-19靶點(diǎn)與小分子數(shù)據(jù)庫的高通量分子對接。首先，以AXL為主要靶點(diǎn)，通過AutoDock Vina[15]和python腳本對小分子數(shù)據(jù)庫中的化合物進(jìn)行虛擬篩選，保留結(jié)合能力優(yōu)于原配體的PAM-Ⅰ。然后，以ACE2和3CL pro為標(biāo)志性靶點(diǎn)，分別篩選PAM-Ⅰ中的化合物PAM-Ⅱ和PAM-Ⅲ?；诜肿庸舶袠?biāo)原理，取PAM-Ⅱ和PAM-Ⅲ的交集，通過Jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html)[16]平臺進(jìn)行可視化，從而得到共靶標(biāo)PAM。此外，根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)對其進(jìn)行分類，進(jìn)一步探討抗COVID-19藥物與化合物結(jié)構(gòu)母核的相關(guān)性。

1.3 共靶標(biāo)PAM的成藥性研究

基于ADME(吸收、分布、代謝、排泄)和Lipinski規(guī)則的評價(jià)是成藥性研究的重要步驟[17]。這些方法可以幫助研究人員篩除不合格的化合物，從而節(jié)省人力、財(cái)力和物力，提高藥物研發(fā)效率。在臨床前的藥物研究中，OB>30%和DL>0.18常作為藥物ADME評價(jià)的重要標(biāo)準(zhǔn)[18-19]，而Mw<500、clogP<5和Hdon<5常作為Lipinski規(guī)則的篩選標(biāo)準(zhǔn)[20]。

1.4 臨床治療藥物的分子對接實(shí)驗(yàn)

目前，雖然沒有針對COVID-19的特效藥，但一些常規(guī)抗病毒藥物在臨床上顯示出良好的治療效果。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的可靠性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可行性，筆者檢索并收集了已上市且應(yīng)用于臨床的COVID-19治療藥物，評估這3個靶點(diǎn)與臨床藥物的結(jié)合能力。

1.5 潛在中藥的預(yù)測

通過TCMSP、TCMIP(http://www.tcmip.cn/TCMIP/)[21]、TCMID(http://119.3.41.228∶8000/tcmid/)[22]等數(shù)據(jù)庫搜集包含PAM的所有中藥。基于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和抗病毒活性原則，篩選出治療COVID-19的潛在中藥。

2 結(jié)果

2.1 共同靶標(biāo)PAM的初步篩選

本研究使用AutoDock Vina和python腳本進(jìn)行高通量分子對接，并使用PyMol軟件將對接結(jié)果可視化。對于靶點(diǎn)AXL(PDB ID : 5U6B，分辨率：2.84 ?)[23]，以原配體為中心設(shè)置對接盒子參數(shù)，中心坐標(biāo)為(24.436, -13.101, 17.081)，AXL與原配體之間的最佳結(jié)合能為-9.2 kcal/mol。一般認(rèn)為，結(jié)合能越小，兩個分子的結(jié)合力越強(qiáng)。此外，結(jié)合能低于-5 kcal/mol則認(rèn)為兩個分子具有較強(qiáng)的結(jié)合能力[24]。AXL與TCMSP數(shù)據(jù)庫對接結(jié)果顯示，139個PAM-Ⅰ不僅低于原配體的結(jié)合能，而且低于-5 kcal/mol，其中Chelidimerine與AXL的結(jié)合能力最強(qiáng)：-12.6 kcal/mol，如圖1a)。2020年，Wang等獲得了ACE2與RBD結(jié)合的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:6M0J,分辨率：2.45 ?)，并進(jìn)一步解析出了結(jié)合位點(diǎn)，為新藥研發(fā)提供極大的幫助[2]。根據(jù)ACE2-RBD的結(jié)合位點(diǎn)，將對接盒子的中心坐標(biāo)設(shè)為(-34.667，27.827，-1.149)。ACE2與139 PAM-Ⅰ的對接結(jié)果顯示，61個PAM-Ⅱ均低于中位數(shù)(-6.9 kcal/mol)，其中C-curarine與ACE2的結(jié)合能力最強(qiáng)：-8.4 kcal/mol，如圖1b)。對于3CL pro(PDB ID：6LU7,分辨率：2.16 ?)[25]，以原配體為中心設(shè)置對接盒子，中心坐標(biāo)設(shè)置為(-9.768, 11.436, 68.904)，3CL pro與原配體之間的最佳結(jié)合能為-7.8 kcal/mol。3CL pro與139 PAM-Ⅰ的對接結(jié)果表明，103個PAM-Ⅲ不僅低于原配體的結(jié)合能而且低于-5 kcal/mol，Chelidimerine與3CL pro的結(jié)合能力最強(qiáng)：-10.8 kcal/mol，如圖1c)。此外，PAM-Ⅰ、PAM-Ⅱ和PAM-Ⅲ的均方根偏差(RMSD)值均小于2 nm，表明對接體系穩(wěn)定[20]。

由于化合物可以同時作用于多個不同的靶點(diǎn)，協(xié)同發(fā)揮特定的生物學(xué)功能，即分子共靶標(biāo)原則。如圖1d)所示，有47個共靶點(diǎn)小分子作用于AXL、3CL pro和ACE2。此外，根據(jù)其結(jié)構(gòu)分為萜類、生物堿類、黃酮類、醌類、苷類和其他，其中萜類化合物在PAM中所占比例最高，如圖1e)。

2.2 Chelidimerine治療COVID-19的可行性研究

由圖1可知，Chelidimerine與AXL和3CL pro的結(jié)合能力最強(qiáng)。此外，Chelidimerine的9種構(gòu)象與ACE2具有良好的結(jié)合能力。如今，ACE2與RBD的主要結(jié)合位點(diǎn)已被證實(shí)，可將其作為Chelidimerine治療COVID-19可行性研究的重要依據(jù)。

首先，Chelidimerine與ACE2的結(jié)合分?jǐn)?shù)小于-5 kcal/mol，并且Chelidimerine位于ACE2-RBD的結(jié)合位點(diǎn)處(圖2)，發(fā)揮一定的生物效應(yīng)和空間位阻效應(yīng)。如表1所示，Chelidimerine與ACE2的成鍵類型主要是氫鍵、疏水作用和靜電力，表明它們具有較強(qiáng)的親和力。此外，成鍵類型、鍵長、局部活性位點(diǎn)等具體信息如圖3所示。目前，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，Chelidimerine是白屈菜的主要活性成分之一，而白屈菜具有一定的抗呼吸道病毒活性[26]。因此，Chelidimerine很可能是一種尚未報(bào)道的治療COVID-19的化合物。

圖1 共靶標(biāo)PAM的分子對接模式及分類Fig. 1 Molecular Docking and Classification of Co-targeting PAM

圖2 Chelidimerine與ACE2-RBD復(fù)合物對接整體圖Fig. 2 Overall Diagram of Chelidimerine Docking with ACE2-RBD Complex注：a) ～ i)：ACE2-RBD復(fù)合物中Chelidimerine的構(gòu)象分布，其中ACE2-RBD的結(jié)合位點(diǎn)處以紅色圈出。粉色：ACE2，黃色：RBD，綠色：Chelidimerine的9種構(gòu)象。

圖3 Chelidimerine與ACE2對接局部圖Fig. 3 Partial Diagram of Chelidimerine Docking with ACE2注：a) ～ i)：Chelidimerine與ACE2對接的9種構(gòu)象的成鍵信息；3種主要作用力：氫鍵(綠色)、疏水作用(紫色)和靜電作用力(橙色)；顏色越深，親和力越強(qiáng)；鍵長越短，成鍵越容易。

2.3 共靶標(biāo)PAM的成藥性研究

首先，基于ADME篩選出15個具有良好口服生物利用度和類藥性的化合物；然后，進(jìn)一步采用Lipinski規(guī)則對其進(jìn)行評價(jià)，最終得到10個具有良好藥動學(xué)特征的化合物(表2)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

2.4 臨床治療藥物的分子對接實(shí)驗(yàn)

通過文獻(xiàn)挖掘的方法，收集治療COVID-19的臨床推薦藥物，分別為Arbidol、Chloroquine、Lopinavir、Remdesivir和Ritonavir。分子對接結(jié)果顯示，它們與AXL、ACE2和3CLpro均具有良好的結(jié)合能力(表3)。此外，靶點(diǎn)與原配體/中位數(shù)、臨床藥物和PAM的平均結(jié)合能分別為-8.0 kcal/mol、-6.6 kcal/mol和-8.4 kcal/mol。因此，配體與受體的結(jié)合能力強(qiáng)弱排序?yàn)椋篜AM>原配體/中位數(shù)>臨床藥物，表明PAM與COVID-19的藥物靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合能力。

2.5 潛在中藥的預(yù)測

通過TCMSP、TCMIP和TCMID數(shù)據(jù)庫檢索含有PAM的47種中藥，其中高頻中藥有13種：木香、洋金花、浙貝母、板藍(lán)根、大青葉、青黛、白屈菜、苦地丁、桑葉、桑枝、延胡索、桑白皮和甘草。其中，11種被報(bào)道具有抗病毒活性：桑白皮[27]、洋金花[28]、浙貝母[29]、板藍(lán)根[30]、大青葉[31]、青黛[32]、白屈菜[26]、苦地丁[33]、桑葉[34]、桑枝[35]和甘草[36]。值得關(guān)注的是，它們都有一定的抗呼吸道病毒的活性。

表1 Chelidimerine與ACE2對接的9種構(gòu)象參數(shù)Table 1 Specific Parameters on Nine Conformations of Chelidimerine Docking with ACE2

表2 共靶標(biāo)PAM的成藥性參數(shù)Table 2 Druggability Parameters of Co-target PAM

表2(續(xù))

表3 配體-受體結(jié)合能力比較Table 3 Comparison of Ligand-receptor Binding Ability kcal/mol

3 討論

基于ACE2和3CL pro的研究已成為抗COVID-19藥物研發(fā)的主流，越來越多的研究證明它們在SARS-CoV-2的入侵和復(fù)制環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用[37-38]。此外，一些新靶點(diǎn)的出現(xiàn)為COVID-19的治療帶來了新的希望。Wang等證明AXL作為抗腫瘤靶點(diǎn)，也是支持SARS-CoV-2高傳染性理論的關(guān)鍵蛋白[12]。因此，AXL被認(rèn)為是SARS-CoV-2的新靶點(diǎn)，研究人員可以通過尋找其抑制劑來阻止病毒入侵宿主細(xì)胞。在這項(xiàng)研究中，筆者基于上述3個靶點(diǎn)對中藥小分子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選并預(yù)測潛在中藥，為后續(xù)的活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

本研究在獲得的10個成藥性良好的化合物中，發(fā)現(xiàn)Withanolide D和Oxysanguinarine具有抗病毒活性。2005年，Withanolide D被報(bào)道可以抑制SARS冠狀病毒的生命周期[39]；此外，Khanal和Patel等通過虛擬對接發(fā)現(xiàn)它與SARS-CoV-2相關(guān)蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，認(rèn)為它可能具有抗COVID-19活性[40-41]。還有研究者通過計(jì)算機(jī)模擬分析，初步確定從藥用植物(蛇床子草、苦地丁草、桑葉、桑枝)中提取的Oxysanguinarine對登革病毒(DENV)的復(fù)制具有潛在的抑制作用，可作為一種新型的潛在抗病毒抑制劑用于后續(xù)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分析[13,42]。

Chelidimerine作為PAM中與靶標(biāo)蛋白有最強(qiáng)親和力的潛在活性小分子，值得進(jìn)一步研究。本文基于分子對接技術(shù)探討了該化合物抗COVID-19的可行性，認(rèn)為其可能具有抗COVID-19活性。但Chelidimerine具有分子量大(>500)、口服生物利用度低(<30%)、類藥性差(<0.18)等特點(diǎn)，需要對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾與改造。此外，其毒性研究也不容忽視。

本研究中采用3個已知靶點(diǎn)(AXL、ACE2和3CL pro)篩選PAM和預(yù)測潛在中藥。然而，以下問題仍然需要重點(diǎn)關(guān)注：首先，雖然原配體和PAM具有相同的作用中心，但生物學(xué)功能可能截然不同；第二，如果PAM是一種抑制劑，被抑制的靶點(diǎn)對機(jī)體的器官和功能是否有不良反應(yīng)尚不清楚；第三，與SARS-CoV-2造成的危害相比，不良反應(yīng)是否可以接受?？傊?，本實(shí)驗(yàn)所獲得的針對COVID-19的PAM和潛在中藥可能為后續(xù)的抗病毒活性研究、新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用提供有意義的參考。