不同濃度FSH對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響及分子機(jī)制研究

路曉琳，郝娜，成艷梅

上皮性卵巢癌是卵巢惡性腫瘤中發(fā)病率最高的一類(lèi)腫瘤，由于其早期多無(wú)明顯癥狀，不易被重視，導(dǎo)致其總體預(yù)后較差，5年生存率較低，死亡率占各類(lèi)婦科腫瘤首位[1]。目前關(guān)于卵巢癌的病因和發(fā)病機(jī)制仍不明確，有研究認(rèn)為，雌激素分泌增多對(duì)卵巢上皮細(xì)胞有刺激作用，可能增加了患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)[2]。卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)是一種由腦垂體合成并分泌的糖基化蛋白質(zhì)激素，能夠促進(jìn)卵泡成熟，與黃體素共同作用還能促進(jìn)雌激素分泌，在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，因此通過(guò)測(cè)定FSH值，可以間接判斷卵巢的功能狀態(tài)[3-4]。有研究報(bào)道，F(xiàn)SH受體在正?；蜓仔越M織的脈管系統(tǒng)中表達(dá)較少，但在人類(lèi)惡性腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，可作為惡性腫瘤診斷和治療的潛在靶標(biāo)[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH和上皮性卵巢癌的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)，能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡，其調(diào)控機(jī)制可能與PI3K/AKT途徑有關(guān)，除該通路之外，F(xiàn)SH與卵巢癌之間是否還存在其它介導(dǎo)關(guān)系還需進(jìn)一步研究[6-7]。本研究著重分析不同濃度FSH對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)功能影響，進(jìn)而更深入地探討FSH能否通過(guò)ERK通路對(duì)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展起到調(diào)控作用。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SKOV3和OAW28細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；FSH(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)；胎牛血清、Mc-Coys 5A培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基(均購(gòu)自Gibico公司)；MTT試劑盒(購(gòu)自上海避碧云天生物技術(shù)有限公司)；Transwell小室(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(購(gòu)自Thermo公司)；倒置顯微鏡(購(gòu)自Nikon公司)；流式細(xì)胞儀(購(gòu)自美國(guó)Beckman-Coulter公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞用10%胎牛血清配置的Mc-Coys 5A培養(yǎng)基；OAW28細(xì)胞用10%胎牛血清配置的RPMI1640培養(yǎng)基；兩種細(xì)胞均培養(yǎng)于37℃，5% CO2孵育箱中，用80%的細(xì)胞密度進(jìn)行傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)至取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 分別取SKOV3和OAW28細(xì)胞接種于有蓋玻片的培養(yǎng)基中，待細(xì)胞貼壁后分別加不同濃度的FSH(0，20，40，80 IU/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.3 MTT觀察SKOV3和OAW28細(xì)胞增殖能力 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3和OAW28細(xì)胞，接種于96孔板中，加入含不同濃度FSH的培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在37℃ 5% CO2孵育箱分別培養(yǎng)24、48、72 h后，吸出含藥培養(yǎng)基，加滅菌后的MTT液20 μL,繼續(xù)孵育4 h后取出，加入DMSO微微震蕩溶解，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)其吸光值(A)，并計(jì)算增殖指數(shù)=AFSH不同濃度組/A對(duì)照組×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SKOV3和OAW28細(xì)胞周期變化 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3和OAW28細(xì)胞，加入含F(xiàn)SH不同濃度的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，經(jīng)胰蛋白酶消化后，3 000 rpm離心5 min，收集全部細(xì)胞至1.5 mL離心管，用事先預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次后，加入預(yù)冷的75%乙醇，4℃條件下固定5 h，再經(jīng)1 500 rpm離心5 min，收集細(xì)胞，用PBS潤(rùn)洗一次，加入400 μL PI染液，室溫避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期變化，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3和OAW28細(xì)胞侵襲能力 將Transwell放入培養(yǎng)板中，在上室加入Matrigel基質(zhì)膠，37℃ 30 min形成基質(zhì)膜，然后將FSH不同濃度培養(yǎng)的SKOV3和OAW28細(xì)胞接種于Transwell上室，在下室加入500 μL 20% FBS細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出Transwell小室，棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用棉簽擦拭上層未遷移的細(xì)胞，用PBS清洗下層細(xì)胞3次，用乙醇固定30 min，適當(dāng)風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗，倒置晾干后在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，數(shù)量越多則侵襲能力越強(qiáng)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)不同濃度卵泡刺激素對(duì)ERK通路蛋白表達(dá)的影響 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液充分裂解后，在 4℃，12 000 r/min的條件下進(jìn)行離心取上清液，用BCA試劑盒檢測(cè)各個(gè)樣品中蛋白的濃度。若蛋白濃度相差過(guò)大，需要將樣品的蛋白濃度調(diào)至一致。將調(diào)整后的樣品加入loading buffer，混勻后煮沸10 min，恢復(fù)至室溫后離心，配置8%分離膠，在分離膠上面距頂端3 cm處加入濃縮膠，加入蛋白樣品后，80 V濃縮，120 V分離，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)NC膜2 h、脫脂奶粉室溫封閉2 h、PBST洗膜、加入一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜三次后加入二抗，室溫孵育2 h，PBST漂洗3次后采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，凝膠成像儀觀察拍照，并用Image-J 軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度卵泡刺激素對(duì)SKOV3和OAW28細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)影響

通過(guò)倒置顯微鏡觀察，SKOV3和OAW28細(xì)胞經(jīng)不同濃度FSH處理后大部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，狀態(tài)良好，只有少數(shù)細(xì)胞由棱形皺縮成圓形，呈懸浮狀態(tài)；與FSH空白組相比，加有FSH組的細(xì)胞密集度明顯增加，40 IU/L的時(shí)候細(xì)胞密度最大，見(jiàn)圖1。

圖1 不同F(xiàn)SH濃度對(duì)SKOV3和OAW28細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)影響

2.2 不同濃度卵泡刺激素對(duì)SKOV3和OAW28細(xì)胞增殖能力的影響

MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，與空白組(0 IU/L)相比，不同濃度FSH作用于SKOV3和OAW28細(xì)胞24，48，72 h后，其增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，在FSH濃度為40 IU/L作用48 h后，兩種細(xì)胞的增殖指數(shù)均達(dá)到最大，當(dāng)濃度達(dá)到80 IU/L時(shí)，雖然也促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，但增殖指數(shù)較40 IU/L略有下降，詳見(jiàn)表1和表2。

表1 不同濃度FSH作用于SKOV3細(xì)胞的增殖指數(shù)比較(%)

表2 不同濃度FSH作用于OAW28細(xì)胞的增殖指數(shù)比較(%)

2.3 不同濃度卵泡刺激素對(duì)SKOV3和OAW28細(xì)胞凋亡及周期的影響

流式檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)SH對(duì)SKOV3和OAW28細(xì)胞的凋亡起到了明顯的抑制作用，且在濃度為40 IU/L作用48 h，凋亡率最小(P<0.05)，詳見(jiàn)下頁(yè)表3；不同濃度的FSH對(duì)SKOV3和OAW28細(xì)胞細(xì)胞周期變化也有顯著影響，隨著FSH濃度增大，兩種細(xì)胞G0/G1期百分比隨之下降，S期和G2/M期百分比逐漸上升，SKOV3細(xì)胞在40 IU/L時(shí)有顯著差異，OAW28細(xì)胞在20 IU/L時(shí)開(kāi)始有明顯差異，但在40 IU/L時(shí)變化最大(P<0.05)，詳見(jiàn)下頁(yè)表4。

表3 不同F(xiàn)SH濃度作用下SKOV3和OAW28細(xì)胞的凋亡率(%)

表4 不同F(xiàn)SH濃度作用下SKOV3和OAW28細(xì)胞周期變化(%)

2.4 不同濃度卵泡刺激素對(duì)SKOV3和OAW28細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)表明，與不含F(xiàn)SH的空白組相比，不同濃度FSH均可以促進(jìn)SKOV3和OAW28細(xì)胞侵襲，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，并且在FSH濃度為40 IU/L作用48 h時(shí)，兩種細(xì)胞的侵襲能力達(dá)到最強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到80 IU/L時(shí)雖然仍有促進(jìn)作用，但較40 IU/L略有減弱，見(jiàn)下頁(yè)圖2和圖3。

圖2 不同濃度卵泡刺激素對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響圖3 不同濃度卵泡刺激素對(duì)OAW28細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5 不同濃度卵泡刺激素對(duì)ERK通路蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明，與FSH空白組相比，含有FSH的各組細(xì)胞中Ras，Raf蛋白表達(dá)水平顯著增加，使得MEK和ERK1/2磷酸化水平被活化，并且表達(dá)水平與FSH呈濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)下頁(yè)圖4和圖5。

圖4 不同卵泡刺激素濃度對(duì)SKOV3細(xì)胞中ERK通路蛋白表達(dá)的影響

圖5 不同卵泡刺激素濃度對(duì)OAW28細(xì)胞中ERK通路蛋白表達(dá)的影響

3 討論

由于卵巢癌早期患者缺乏明顯癥狀，診斷時(shí)往往已經(jīng)發(fā)展至中晚期，導(dǎo)致錯(cuò)失最佳治療時(shí)間，并且卵巢因其位置深入盆腔，在行根治手術(shù)時(shí)不易徹底清除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康[8]。因此，探究介導(dǎo)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的信號(hào)通路，闡明其調(diào)控機(jī)制，對(duì)于臨床治療卵巢癌具有十分重要的意義。有研究報(bào)道，由于FSH受體在卵巢腫瘤中過(guò)度表達(dá)，在近幾年已經(jīng)將FSH作為卵巢癌的成像生物標(biāo)記物；此外還證實(shí)FSH受體參與介導(dǎo)癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，靶向FSH受體不僅可以作為卵巢癌，而且還可以作為許多其他人類(lèi)實(shí)體癌的介入探針[9-10]。Liu XM等[11]通過(guò)建立FSH作用于HO8910和SKOV3兩種細(xì)胞模型，證實(shí)FSH 通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期時(shí)相變化促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，且當(dāng) FSH受體呈陽(yáng)性時(shí)，細(xì)胞周期變化更明顯。Yan XN等[12]從分子水平探索了FSH通過(guò)PI3K/Akt途徑對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSH對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有促增殖和抗凋亡的作用，可能是FSH與上皮細(xì)胞中的受體結(jié)合，激活了PI3K/AKT通路，導(dǎo)致突變型p53發(fā)生同向變化，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，而不能及時(shí)凋亡，加快了卵巢癌的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH可以促進(jìn)卵巢癌SKOV3和OAW28細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞從G1期向S期和G2期發(fā)展，加快了有絲分裂進(jìn)程，抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而引起細(xì)胞惡性繁殖，對(duì)卵巢癌的發(fā)展起到了催化作用，與前期文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相吻合。

Ras/Raf/MEK/ERK通路是學(xué)術(shù)界公認(rèn)的介導(dǎo)腫瘤增殖、分化和細(xì)胞存活的經(jīng)典信號(hào)通路，它與PI3K/AKT通路一樣，在腫瘤生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。有研究報(bào)道，Raf/MEK/ERK途徑對(duì)各種譜系細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡的預(yù)防，細(xì)胞周期阻滯和耐藥性的誘導(dǎo)具有不同的作用，例如Raf/MEK/ERK可能會(huì)促進(jìn)前列腺細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯，這可能受到p53的調(diào)節(jié)，因?yàn)閜53缺陷的前列腺癌細(xì)胞中野生型p53的恢復(fù)導(dǎo)致它們對(duì)化療藥物的敏感性增強(qiáng)，因此在晚期前列腺癌中，誘導(dǎo)Raf/MEK/ERK表達(dá)以促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯可能是有利的；而在造血系統(tǒng)癌癥中，抑制Raf/MEK/ERK誘導(dǎo)的增殖和耐藥性可能是有益的[14]。另有研究探索了MEK/ERK通路在肝細(xì)胞癌發(fā)生中的重要作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)索拉非尼可以降低HepG2 和HCC細(xì)胞中MEK和ERK磷酸化水平，減少腫瘤微血管生成，產(chǎn)生完全的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用[15]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肺癌細(xì)胞受到外界刺激后，則會(huì)導(dǎo)致Ras作用位點(diǎn)發(fā)生突變，持續(xù)處于激活狀態(tài)，活化的Ras不斷招募細(xì)胞漿內(nèi)Raf蛋白至細(xì)胞膜上，進(jìn)而誘導(dǎo)MEK和ERK蛋白磷酸化，造成癌細(xì)胞不可控制地增殖、惡變，同時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，間接加速了癌癥的發(fā)展進(jìn)程[16]。基于上述文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Ras/Raf/MEK/ERK途徑確實(shí)參與了多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，但在不同癌癥中的作用機(jī)制也不盡相同，本研究著重探討了FSH介導(dǎo)Ras/Raf/MEK/ERK途徑對(duì)卵巢癌增殖、凋亡的影響，結(jié)果表明FSH可以上調(diào)SKOV3和OAW28細(xì)胞中Ras，Raf，p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)，活化ERK通路，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變來(lái)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞增殖，抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡，為后期卵巢癌的臨床治療提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，不同濃度的FSH可以促進(jìn)卵巢癌SKOV3和OAW28細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期從G1期向S期和G2期轉(zhuǎn)變，抑制細(xì)胞凋亡，其調(diào)控機(jī)制可能與活化Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路有關(guān)。但本研究還存在一定的局限性，后期可以通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察體內(nèi)注射FSH對(duì)卵巢癌組織的影響，并進(jìn)一步驗(yàn)證該調(diào)控機(jī)制是否與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相一致。