我國對非洲豬瘟病毒的研究進展綜述

倪俊芬 陳前嶺 仲向前

（1泗陽縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇宿遷 223700；2宿遷市畜牧獸醫(yī)站，江蘇宿遷 223899）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）已在我國“定殖”，且周邊國家的非洲豬瘟疫情也是多發(fā)頻發(fā)，對養(yǎng)豬企業(yè)仍存在較大威脅，非洲豬瘟疫情的防控形勢依然嚴峻[1,2]。目前，全球仍無非洲豬瘟疫苗上市，防控非洲豬瘟仍需靠豬場嚴格的生物安全[3]。因此，全面了解非洲豬瘟病毒是防控疫病和研發(fā)疫苗較為有效的手段，我國已有科研單位、高校在解析非洲豬瘟病毒[4,5]。了解非洲豬瘟病毒基因特征，對防控非洲豬瘟有重要意義[6]。

非洲豬瘟病毒是一種雙鏈DNA分子病毒，基因組長為170～190 kb[7]，編碼150～200種病毒蛋白，其中有68中結(jié)構(gòu)蛋白和100余種非結(jié)構(gòu)蛋白。經(jīng)解析，非洲豬瘟病毒顆粒由內(nèi)向外依次為病毒基因組、核衣殼、內(nèi)膜、衣殼和外膜組成。擬核基因組包括病毒基因組合核蛋白，其主要蛋白有DNA結(jié)合蛋白p10和pA104R；核衣殼主要蛋白有p150、p37、p35、p34、p14和p15等6種；內(nèi)膜蛋白有 pE183R、p12、p17、pE183L、p54等；衣殼主要蛋白由p72、p49、p14.5等組成；外膜的主要蛋白為CD2v。科研工作者對非洲豬瘟病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白位置和功能進行了深入研究，為非洲豬瘟病毒的快速檢測和疫苗研發(fā)提供了大量數(shù)據(jù)支撐。如郭怡德等[8]對非洲豬瘟病毒的重要毒力蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白等進行總結(jié)分析，發(fā)現(xiàn)在病毒形態(tài)維持、病毒吸附與入侵宿主細胞、病毒復制、病毒對宿主細胞代謝調(diào)控及免疫逃逸等方面有50余個結(jié)構(gòu)蛋白參與。

1 非洲豬瘟病毒功能基因的研究

非洲豬瘟病毒中已經(jīng)明確功能的有68個蛋白，且這些蛋白分布在病毒顆粒不同的位置[9]。如p54、p12、p17等屬于內(nèi)膜蛋白；p72是主要的衣殼蛋白；CD2v蛋白是典型的外膜蛋白等。68個功能蛋白中參與復制的蛋白約30個，其余為參與誘導凋亡、破壞凝血、病毒吸附、免疫逃逸等，同時仍有大部分非洲豬瘟病毒基因功能仍處于未知狀態(tài)[10]。在這些蛋白中，有些蛋白有利于非洲豬瘟病毒的檢測；有些有利于蛋白功能結(jié)構(gòu)的研發(fā)，為非洲豬瘟病毒的防控和殺滅提供參考；而還有一些則更有利于疫苗研發(fā)。因此，分析非洲豬瘟病毒蛋白的功能結(jié)構(gòu)，旨在為非洲豬瘟的防控和疫苗研發(fā)提供理論參考。

2 非洲豬瘟病毒的致病基因

2021年之前，為了更好地防控非洲豬瘟病毒，多數(shù)科研工作者以研究非洲豬瘟病毒的致病機理和非洲豬瘟病毒蛋白的表達為主，以期能夠更精準的檢測到非洲豬瘟病毒。多數(shù)學者認為CD2v蛋白是快速檢測非洲豬瘟病毒、研發(fā)非洲豬瘟疫苗的一個有效目的蛋白。如何慶等[11]對非洲豬瘟病毒的CD2v的結(jié)構(gòu)及其生物學功能進行分析，闡明非洲豬瘟病毒的致病機理。田盼盼等[12]運用各種生物信息學技術分析了非洲豬瘟病毒CD2v蛋白的理化性質(zhì)、信號肽、跨膜區(qū)、抗原性等，發(fā)現(xiàn)CD2v蛋白是親水性的分泌蛋白，具有免疫原性且為非過敏原。凌占業(yè)等[13]通過真核表達非洲豬瘟病毒的CD2v重組蛋白，建立了一種快速的ASFV間接ELISA檢測方法。

非洲豬瘟病毒由于分子量較大而通過呼吸道、消化道等傳播，因此，在非洲豬瘟病毒的檢測中，特異性目的基因片段的確定也很重要。侯景等[14,15]在研究非洲豬瘟病毒時發(fā)現(xiàn)，生豬感染非洲豬瘟病毒后，在第5 d會檢測出非洲豬瘟病毒解旋酶D1133L的抗體，第7 d該基因抗體達到高峰值。同時，還通過預測分析和亞細胞定位等方法解析了非洲豬瘟病毒解旋酶D1133L的基因結(jié)構(gòu)和功能，為后續(xù)進一步解析D1133L基因的功能和亞細胞結(jié)構(gòu)奠定基礎。張鑫宇等[16]構(gòu)建了非洲豬瘟病毒重組蛋白pK205R、pE183L、pA104R和pB602L等的多克隆抗體，篩選出p54和pK205R重組蛋白是較好的診斷抗原，可用于非洲豬瘟病毒感染后的早期或中后期血清學診斷。孫茂文等[17]、向志達等[18]發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒的A137R蛋白多克隆抗體，具有較好的免疫原性、反應性和特異性，為后續(xù)解析非洲豬瘟病毒的A137R蛋白功能和建立ASFV血清學檢測方法奠定基礎。武悅等[19]構(gòu)建非洲豬瘟多基因家族MGF-505-3R基因重組原核表達質(zhì)粒，并進行表達。發(fā)現(xiàn)MGF-505-3R蛋白為不穩(wěn)定的疏水蛋白，為我國非洲豬瘟免疫血清學診斷試劑的制備及預防控制奠定了基礎。此外，韓程程等[20]利用非洲豬瘟病毒的p54基因蛋白作為檢測目標，設計了Spinach-p54的嵌合式RNA適配體，實現(xiàn)了在RNA水平對非洲豬瘟病毒的快速檢測，且可用于市場和養(yǎng)殖場的現(xiàn)場快速檢測。曾宇晨等[21]建立了基于酶促重組酶擴增技術的非洲豬瘟病毒DNA快速檢測方法，為非洲豬瘟的流行病學調(diào)查和現(xiàn)場檢測提供了一種快速有效的檢測方法。

3 有利于非洲豬瘟病毒檢測的蛋白

目前，用于檢測非洲豬瘟病毒的蛋白種類較多，選擇一種靈敏度高、準確性好的目的蛋白建立非洲豬瘟病毒的ELISA檢測方法，便于養(yǎng)殖企業(yè)自行檢測顯得尤為重要。程佳等[22]利用非洲豬瘟病毒EP153R蛋白建立了間接檢測非洲豬瘟病毒蛋白的ELISA方法，并通過驗證發(fā)現(xiàn)其有較強的特異性和較好的重復性。鄔旭龍等[23]通過原核表達ASFVpK205R重組蛋白，建立了一種快速的ASFV間接ELISA檢測方法。王彩霞等[24]利用真核表達的非洲豬瘟病毒p72蛋白為包被抗原，建立了特異性檢測ASFV抗體的阻斷ELISA方法。王兆貴等[25]篩選以非洲豬瘟病毒pA104R蛋白作為最佳診斷抗原，用于檢測非洲豬瘟病毒的間接ELISA方法。

此外，在非洲豬瘟病毒蛋白的ELISA檢測中，抗體的選擇和制備也很重要，選擇正確的抗體可以更好地檢測出病毒，并可以提高檢測的準確性。顏世君等[26]為研發(fā)非洲豬瘟病毒的免疫診斷學試劑，制備了抗p22蛋白單克隆抗體。趙少若等[27]通過研究制備了p11.5蛋白的特異性單克隆抗體；白晶晶等[28]通過重組法制備了非洲豬瘟病毒p17蛋白的單克隆抗體；耿笑林等[29]制備了非洲豬瘟病毒K145R蛋白的單克隆抗體，趙亞茹等[30]合成了非洲豬瘟病毒K205R基因的單克隆抗體，王西西等[31]制備了DP96R重組蛋白的多克隆抗體；陳蓉等[32]重組了非洲豬瘟病毒p10蛋白和多克隆抗體；李佳佳等[33]制備了非洲豬瘟病毒H240R基因的多克隆抗體，楊博等[34]制備了非洲豬瘟病毒MGF360-9L蛋白的多克隆抗體，李杰等[35]制備了非洲豬瘟病毒p30-54基因融合蛋白的多克隆抗體，這些蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體的制備，為建立非洲豬瘟病毒抗體、抗原診斷產(chǎn)品的研究提供了重要的生物材料。

在非洲豬瘟病毒單克隆或多克隆抗體的檢測中，運用p30病毒蛋白制備抗體的頻率相對較高。如黃劍等[36]利用非洲豬瘟病毒p30結(jié)構(gòu)蛋白中的CP204L基因，制備了多克隆抗體，并對抗體進行了表達，為p30蛋白結(jié)構(gòu)功能研究奠定了基礎。劉靖等[37]構(gòu)建了表達非洲豬瘟病毒p30蛋白的細胞系、純化p30蛋白并制備單克隆抗體（MAb），為ASFV p30蛋白的深入研究及ASFV的快速檢測奠定了基礎。吳競等[38]對非洲豬瘟病毒的p30基因進行了原核表達，并建立間接ELISA檢測方法，可初步應用于非洲豬瘟病毒抗體的檢測。同時，p35[39]、p54[40]、p72[41]、pB602L[42]、pK145R[43]、pK205R[44]等蛋白在檢測非洲豬瘟病毒中也起著非常重要的作用，為進一步研發(fā)非洲豬瘟血清學診斷方法提供了參考依據(jù)。

4 有利于疫苗研發(fā)的非洲豬瘟病毒基因

當前，非洲豬瘟病毒的衣殼蛋白是研發(fā)疫苗的關鍵蛋白，據(jù)報道，非洲豬瘟病毒的衣殼蛋白主要成分是p72，此外還有五鄰體頂點蛋白（H240R）及3種不同的次要衣殼蛋白（Minor capsid protein）[45]。因此，對非洲豬瘟病毒衣殼蛋白基因的解析，成為研發(fā)非洲豬瘟疫苗的參考依據(jù)和思路，研究發(fā)現(xiàn)，非洲豬瘟病毒核衣殼的主要蛋白p72中存在可以制備疫苗的候選基因位點，如高瞻等[46]為預測非洲豬瘟病毒2018/AnhuiXCGQ株p72蛋白的T、B淋巴細胞抗原表位，對該蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進行預測分析，統(tǒng)計設計多表位疫苗，發(fā)現(xiàn)p72蛋白具有多個潛在的抗原表位，為構(gòu)建非洲豬瘟多表位疫苗提供了依據(jù)。胡永新等[47]通過合成P72蛋白中的B646L基因，并將該基因與腺病毒骨架載體進行重組，經(jīng)細胞傳代后獲得重組腺病毒，為非洲豬瘟腺病毒疫苗的研制奠定了一定基礎。此外，非洲豬瘟病毒的五鄰體頂點蛋白（H240R）也是疫苗研究的一個候選基因，王國強等[48]原核表達非洲豬瘟病毒次要衣殼五鄰體頂點蛋白（H240R），并研究其免疫原性。發(fā)現(xiàn)ASFV衣殼五鄰體頂點蛋白H240R在原核系統(tǒng)中以包涵體形式表達，純化復性的目的蛋白具有良好的免疫原性，并且可以和陽性血清反應。這些可為進一步研究H240R蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以及ASFV亞單位疫苗研制提供參考和思路。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，一種由EP402R基因編碼的糖蛋白CD2v在ASFV病毒入侵宿主和傳播擴散中發(fā)揮重要作用。因此，大多科研工作者通過CD2v蛋白在研發(fā)一些非洲豬瘟病毒的基因缺失疫苗和基因重組疫苗。何慶等[49]對ASFV的CD2v結(jié)構(gòu)及其生物學功能研究報道進行分析綜述，將為闡明疫苗研發(fā)等提供重要參考。張霽輝等[50]通過非洲豬瘟病毒的CD2v蛋白構(gòu)建了核酸重組疫苗，通過評價發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的核酸疫苗可以提高小鼠機體的免疫應答。此外，當非洲豬瘟病毒感染豬只后，引起豬器官發(fā)生炎癥反應，而病毒中的一些非結(jié)構(gòu)蛋白則可以誘導機體干擾素的產(chǎn)生，如MGF多基因家族中的一些基因，因此，MGF多基因家族在疫苗研發(fā)中具有重要的作用。蔡建秋等[51]分析了非洲豬瘟病毒中國Pig/HLJ/2018分離株MGF多基因家族的42條編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)、B細胞抗原表位區(qū)域、T細胞抗原表位區(qū)域分析，篩選出25條優(yōu)勢B細胞抗原表位序列、20條優(yōu)勢T細胞抗原表位序列，這些B、T細胞抗原表位區(qū)域為構(gòu)建非洲豬瘟多表位疫苗提供了基礎依據(jù)。蔣亞君等[52]重組了非洲豬瘟病毒的MGF360-12L基因，并在鑒定中發(fā)現(xiàn)12L重組蛋白具有較好的穩(wěn)定性，為非洲豬瘟病毒的疫苗研發(fā)提供了生物材料。除以上基因外，還有一些基因也是非洲豬瘟疫苗研發(fā)的重點基因，如非洲豬瘟病毒p49蛋白的B438L基因[53]、非洲豬瘟病毒的pI215L 蛋白[54]等。

5 其他

當前，仍沒有可以普及推廣的非洲豬瘟疫苗，因此，早期豬群的檢測和生物安全防控，仍舊是防控非洲豬瘟的主要手段。而科研工作者對非洲豬瘟病毒毒株及基因的解析仍在繼續(xù)，且在為非洲豬瘟疫苗的研發(fā)不斷積累依據(jù)。如張彥兵等[55]通過分析非洲豬瘟病毒不同毒株E165R基因啟動子序列，發(fā)現(xiàn)E165R啟動子含有3個活性區(qū)域，為解析E165R基因提供參考。楊博等[33]對非洲豬瘟病毒多基因家族中MGF360-9蛋白的研究為對非洲豬瘟病毒的靶向藥物和疫苗的研發(fā)提供了參考依據(jù)。

6 小結(jié)

綜上所述，科研人員對非洲豬瘟病毒基因的解析已積累了較多的數(shù)據(jù)，為后期我國非洲豬瘟的快速檢測和疫苗的研發(fā)提供了大量依據(jù)。盡管非洲豬瘟病毒基因的解析不斷完善，但養(yǎng)豬企業(yè)不應將希望寄托于疫苗的研發(fā)，還是應做好養(yǎng)豬場的生物安全防控，并注重養(yǎng)殖技術人員的素質(zhì)提升，防患于未然，保證養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。