外泌體在狼瘡性腎炎診療中的研究進展

韋嫻，尤燕舞

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西 南寧 530021)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一類以持續(xù)性炎癥和自身抗體形成異常為特點的多系統(tǒng)自身免疫性疾病[1]，SLE的全球總體發(fā)病率范圍在1.5～11/10萬人年，全球患病率為13 ～7713.5/10萬人年[2]。SLE中受嚴重影響的臟器之一為腎臟，狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是導(dǎo)致SLE患者病程進展與死亡的主要因素[3]，及時準確的診療對于改善LN患者生存率尤為重要。而LN的診斷和治療指導(dǎo)通常是通過腎活檢來進行的。由于在獲取組織樣本時使用了侵入性技術(shù)，并發(fā)癥很多，包括急性出血、感染等[4]。目前，LN的實驗室標記物如蛋白尿、肌酐清除率、抗雙鏈DNA自身抗體(抗dsDNA)和低血漿補體水平(主要是C3和C4)已用于日常臨床常規(guī)監(jiān)測LN活動[5]。但這些臨床參數(shù)缺乏反映實時腎臟免疫病理活動和慢性腎臟組織損傷的敏感性和特異性[6]。因而，探索能夠區(qū)分LN活動及其嚴重程度、預(yù)測腎臟發(fā)作、監(jiān)測治療療效和疾病發(fā)展的新型生物標志物顯然是必要的。外泌體來源廣泛，人體內(nèi)幾乎所有類型的細胞都能在各種病理生理條件下釋放外泌體。外泌體(exosome)是一種直徑范圍40～100 nm的細胞外囊泡，呈雙凹圓盤狀[7]。外泌體的膜與細胞膜相似，同為磷脂雙分子層，外泌體膜上有脂質(zhì)筏限制膜流動，得天獨厚的膜結(jié)構(gòu)使它們成為細胞中的“閃送員”，可將RNA、蛋白質(zhì)和其它分子從宿主細胞轉(zhuǎn)運到受體細胞。外泌體具有多種活性，包括抗炎、抗免疫、抗凝血、促血管生成和促腫瘤活性。最近的證據(jù)[8]表明外泌體參與LN的發(fā)病機制和臨床并發(fā)癥，且在治療上也有突破。本文將總結(jié)近年來外泌體在LN診療中的研究新進展。

1 外泌體源性miRNAs作為LN生物標志物的研究

現(xiàn)有證據(jù)表明[9]，外泌體水平與LN患者的疾病活動度相關(guān)。外泌體傳遞的miRNA進行遺傳信息的傳輸，可作為自身免疫性疾病的診斷生物標志物。在LN患者中發(fā)現(xiàn)了外泌體miRNA的異常表達，這種外泌體miRNA譜可以反映LN的活動性和組織學(xué)改變。這些發(fā)現(xiàn)突出了外泌體miRNA作為LN診斷、進展、預(yù)后的理想生物標志物的有前景的應(yīng)用[10]。

1.1 外泌體源性miRNAs作為LN診斷生物標志物的研究 LN的早期診斷是提升生存率的關(guān)鍵。ICHII O等[11]于2014年首次提出了LN中的外泌體miRNA。LN以自身免疫性腎小球腎炎為特征，足細胞損傷是LN發(fā)病機制中的關(guān)鍵事件。 miR-26a在活動性LN患者的尿外泌體中顯著升高，且其表達隨著進行性腎小球損傷而顯著增加，可作為診斷活動性LN、腎小球腎炎中足細胞損傷的生物標志物。已證明miR-146a參與狼瘡小鼠模型和人類狼瘡的腎損傷[12]。ROC曲線分析揭示了尿液外泌體miR-146a在活動性LN、無腎損傷的SLE患者之間的高精度區(qū)分能力，尤其是活動期LN的患者，其診斷LN的曲線下面積(AUC)為0.82(P=0.001)[13]。與健康對照相比，LN患者尿外泌體miR-29c水平顯著降低，并且與LN患者的腎活檢慢性指數(shù)和腎小球硬化相關(guān)[14]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是腎臟疾病中的關(guān)鍵促纖維化介質(zhì)，通過刺激細胞外基質(zhì)(ECM)積累和交替激活促纖維化免疫細胞來促進腎纖維化，促進從各種細胞類型向促纖維化細胞的轉(zhuǎn)變[15]。TGF-β介導(dǎo)的腎纖維化與Smad信號的平衡息息相關(guān)，其中Smad2和Smad7具有保護作用，而Smad3具有致病性，加快腎臟纖維化及炎癥反應(yīng)[16]。機制研究[14]表明，Smad3是組織纖維發(fā)生中TGF-β信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵下游效應(yīng)器，通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)非編碼RNA來促進腎纖維化。Smad3和MMP2表達水平與慢性化呈正相關(guān)，與miR-29c水平呈負相關(guān)。外泌體miR-29c表達可能是LN中腎纖維化的非侵入性早期生物標志物。經(jīng)過進一步研究，他們的團隊發(fā)現(xiàn)LN患者尿外泌體miR-21和miR-150的過表達和miR-29c的下調(diào)會增加促纖維化分子的合成，VEGFA和SP1是這3種miRNA的共同靶基因[17]。其通過Smad3/TGFβ途徑誘導(dǎo)COL4A1的形成在腎纖維化中發(fā)揮重要作用。提供了檢測早期腎纖維化的有效策略，可用于預(yù)測LN的疾病進展?；谀I小球增殖性病變的存在和免疫復(fù)合物(IC)沉積物的定位，將LN病理分型分為Ⅰ～Ⅵ型。Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ型發(fā)病率較低，臨床上Ⅰ、Ⅱ型通常預(yù)后較好，治療方案可根據(jù)尿蛋白水平確定。Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型以及混合型(Ⅴ+Ⅳ型和Ⅴ+Ⅲ型)在臨床上較為常見。Ⅳ型狼瘡性腎炎(LNIV)是一種以彌漫性增生性病變?yōu)樘卣鞯腖N，合并細胞新月體(LNIV-CC)的LNIV患者預(yù)后更差。通過比較LNIV和LNIV-CC之間尿液外泌體中的miRNA表達譜，LI Y等[18]發(fā)現(xiàn)LNIV-CC顯示出獨特的miRNA表達譜。其中，miR-3135b、miR-654-5p和miR-146a-5p表現(xiàn)出對LNIV-CC具有顯著的預(yù)測價值，特異性為83.30%～96.60%。LN患者血清外泌體miR-155和miR-21的表達高于無腎損傷的SLE患者，而miR-146a的水平下調(diào)[19]。外泌體miR-21和miR-155表達均與蛋白尿呈正相關(guān)，外泌體miR-146a與紅細胞沉降率和抗 dsDNA 抗體水平呈負相關(guān)。外泌體miR-21和miR-155可作為伴有和不伴有LN的SLE的潛在生物標志物，兩者聯(lián)合檢測LN的AUC值為0.709。最近TAN L N等[20]的一項研究顯示，外泌體miR-451a在CD4+正常的健康人和SLE患者血清中T或B細胞明顯增多，與表現(xiàn)出腎損傷的 SLE 患者相比，沒有腎損傷的SLE患者的血清外泌體miR-451a表達水平顯著下調(diào)。SLE 患者血清外泌體miR-451a表達水平與24 h尿蛋白水平(P<0.01)和SLEDAI評分(P<0.01)呈負相關(guān)。這表明外泌體miR-451a可能是作為LN的一種新潛在生物標志物。

1.2 外泌體源性miRNAs作為LN治療及預(yù)后生物標志物的研究 外泌體中的RNA作為疾病生物標志物是極具前景的“潛力新秀”，用于預(yù)測各種腎臟疾病的嚴重程度和進展。研究者[21]比較了活動期和非活動期的LN患者尿外泌體中miR-21和 let-7a的表達水平，let-7a和miR-21在疾病活動期間在尿外泌體中的表達下調(diào)。經(jīng)長期隨訪發(fā)現(xiàn)let-7a和miR-21的表達水平在整個治療過程后增加，且與腎小球過濾率和蛋白滲漏呈負相關(guān)。Let-7a被證明能夠通過抑制自發(fā)發(fā)育的LN小鼠模型中的IL-6表達來控制炎癥。miR-21的異常表達導(dǎo)致炎癥、細胞轉(zhuǎn)化、組織纖維化和不同腎臟疾病的出現(xiàn)[22]。在LN患者中，miR-21發(fā)揮多能作用并促進B和T細胞活化。在SLE患者的外周血單個核細胞(PBMC)中，上調(diào)的miR-21可以調(diào)節(jié)患者異常的T細胞反應(yīng)。尿外泌體相關(guān)miR-21和let-7a水平可能成為對LN的臨床分期進行分類的非侵入性生物標志物，可反映患者的預(yù)后。先前對LN的研究表明[23]，Th17細胞和Tregs處于失衡狀態(tài)，具有抑制免疫反應(yīng)功能的Tregs缺陷，而參與LN發(fā)病的Th17細胞及IL-17增加。實驗證實HIF-1α可促進Th17增殖，同時抑制Tregs的發(fā)育。腎小球HIF-1α水平與LN腎小球細胞增殖評分呈正相關(guān)，體內(nèi)上調(diào)的 HIF-1α?xí)铀倮钳彴l(fā)展中的腎損傷。在預(yù)測LN臨床反應(yīng)的尿液外泌體miRNA表達譜研究中[24]，將LN患者分為有應(yīng)答者和無應(yīng)答者。與無應(yīng)答者相比，應(yīng)答者尿液外泌體 miR-31、miR-107和 miR-135b-5p 的水平顯著增加，其過表達可以通過抑制HIF-1α來改善腎臟疾病，促進腎功能的恢復(fù)。該研究首次確定了參與LN腎臟恢復(fù)的相關(guān)miRNA，尿外泌體miR-135b-5p、miR-107和miR-31-5p水平可作為LN預(yù)后評估的早期標志物。SLE患者尿外泌體中miR-146a的富集與腎損傷指數(shù)(如蛋白尿、組織學(xué)特征和狼瘡活動)密切相關(guān)，這表明其與LN發(fā)展過程中的腎小球損傷有關(guān)。在3年的隨訪中，基礎(chǔ)尿外泌體miR-146a與狼瘡活動的短期和長期變化均相關(guān)，高基礎(chǔ)水平與短期或長期隨訪中的低C3和C4值相關(guān)。體外實驗[9]表明，miR-146a通過抑制IRAK1和TRAF6對炎癥的負調(diào)節(jié)發(fā)揮保護作用，從而改善LN的活動水平?？蓪⒛蛲饷隗wmiR-146a確定為LN疾病進展的標志物。

2 外泌體源性蛋白質(zhì)作為狼瘡腎炎生物標志物的研究

有文獻報道[25]，外泌體源性蛋白質(zhì)也能反映與疾病相關(guān)的病理過程。脂質(zhì)雙層可保護外泌體蛋白免受外部蛋白酶的侵害，具有更高的敏感性，可穩(wěn)定存在于體液中而易于被檢測，因此，外泌體源性蛋白質(zhì)也是臨床應(yīng)用的理想生物標志物。蛋白質(zhì)ADAM10的一個重要底物是Notch受體[26]，Notch信號通路已被證實參與腎臟發(fā)育。在產(chǎn)前毒死蜱(CPF)暴露小鼠模型中持續(xù)激活A(yù)DAM10/Notch會導(dǎo)致成人腎纖維化加重，從而將ADAM10-Notch信號軸與腎纖維化聯(lián)系起來[27]。因此，該蛋白質(zhì)可能作為LN腎纖維化新生標志物。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)和流式細胞術(shù)分析，半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白(G3BP)也是SLE患者中一種新的循環(huán)微粒特異性標志物，與LN中沉積的免疫復(fù)合物共定位。G3BP是一種分泌的糖蛋白[28]，屬于清道夫受體富含半胱氨酸(SRCR)超家族，它參與細胞間和細胞-細胞外基質(zhì)黏附和促炎信號傳導(dǎo)。在LN患者的腎活檢中，在GBM中表現(xiàn)出腎小球G3BP/IgG共定位模式，表明G3BP存在于外泌體從循環(huán)或局部形成的免疫復(fù)合物中[29]。G3BP可以區(qū)分增殖性LN和膜性LN，并與腎組織學(xué)中的AI評分和透明沉積物呈正相關(guān)。G3BP可作為有前途的替代生物標志物，用于診斷、監(jiān)測 LN 患者的疾病活動和腎臟組織學(xué)變化。GUDEHITHLU K P等[30]發(fā)現(xiàn)LN患者的尿外泌體銅藍蛋白(CP)升高，并且在所有活檢病例中，發(fā)現(xiàn)CP強烈定位于腎小管，表明腎臟是尿液外泌體中CP的來源。隨后，在大鼠PHN(一種人膜性腎病模型)中進行的縱向研究表明，在該模型中，尿外泌體CP增加先于蛋白尿。在后來的研究中發(fā)現(xiàn)[31]，尿中CP水平與LN患者腎活檢的活動性指數(shù)相關(guān)，AI升高的患者，特別是毛細血管外增殖患者的CP濃度較高，這表明尿外泌體CP可能是LN診斷及預(yù)后判斷的早期生物標志物。CHUANG H C等[32]證明了來自SLE患者的T細胞衍生的外泌體中殺菌/通透性增加蛋白(BPI)的過表達。T細胞衍生的含有BPI的外泌體靶向幾種組織(如肝臟、腎臟和關(guān)節(jié))，并在受體小鼠中誘導(dǎo)血清IL-1β，導(dǎo)致組織炎癥。源自Lck-BPI Tg T細胞的外泌體在所有受體小鼠中誘導(dǎo)腎炎，表明含BPI的外泌體可能有助于SLE腎炎的早期診斷。隨著研究進一步進展，該團隊確定另一種蛋白嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP，也稱為人RNaseⅢ)在 SLE T 細胞衍生的外泌體中過度表達[33]。在動物實驗中，將載有ECP的外泌體注入正常小鼠體內(nèi)，導(dǎo)致受體小鼠的組織炎癥。這具有增加血漿B細胞比例和誘導(dǎo)產(chǎn)生自身抗體和高水平IFN-γ的作用，導(dǎo)致各種器官炎癥。外泌體ECP可能對于 SLE相關(guān)腎炎的早期診斷有幫助。

3 外泌體用作LN治療藥物遞送載體的研究

大多數(shù)自身免疫性疾病的特征是慢性炎癥狀態(tài)，因此減輕炎癥對于緩解患者的病情至關(guān)重要。然而，目前LN療法中治療適應(yīng)證的劑量限制延遲了它們的最佳藥效，并且LN患者可能會耐受頻繁和長期治療的非特異性器官毒性產(chǎn)生的嚴重副作用。最近報道[33]的LN新型免疫療法旨在針對與腫瘤、移植和其他自身免疫疾病重疊的生物途徑。這些靶向免疫治療提高了患者的生存率和持續(xù)時間，但它們可能僅對特定亞組患者有效，如干擾素信號低或無腎炎的活動性SLE患者。此外，這些新藥也很昂貴，因此會影響與該疾病相關(guān)的長期醫(yī)療費用。因此，迫切需要新的方法來提高LN治療的臨床療效和安全性。

大量研究發(fā)現(xiàn)[31]，外泌體途徑可能是降低炎癥反應(yīng)、改善組織修復(fù)和避免感染的有效方法。使用外泌體載藥，基于其4個方面優(yōu)勢：首先，其是天然馴化的生物大分子載體，在體液中廣泛存在，因此免疫源性低，安全性高；其二，它能夠循環(huán)至人體所有腔室，跨越血腦屏障；其三，外泌體具有一定的組織選擇性，有望實現(xiàn)非肝靶向，更精準遞送至“目標地”；其四，它同時具備內(nèi)源和外源改造的潛力，可以實現(xiàn)其更豐富的功能。糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑是LN治療的主要藥物，長期使用全身性大劑量糖皮質(zhì)激素會產(chǎn)生嚴重的不良反應(yīng)，如免疫力低下、高血糖和骨質(zhì)疏松癥。基于外泌體的納米顆粒藥物遞送已成功應(yīng)用于不同疾病治療的各種藥物，YAN F L等[34]最近的一項研究建立了一種包裹地塞米松磷酸鈉納米顆粒的仿生外泌體，其表面用葉酸(FA)-PEG-膽固醇(Chol)化合物進行了修飾，提供了一種使用外泌體作為納米載體來增強GCs對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果的有前景的策略，基于外泌體的藥物遞送系統(tǒng)具有更好的內(nèi)化能力，更弱的血液清除能力和長期循環(huán)能力。姜黃素具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)作用。姜黃素對SLE的藥理學(xué)研究表明，SLE的特征在于補體系統(tǒng)的激活，姜黃素可以抑制補體級聯(lián)反應(yīng)[35]，減少組織和各種微血管床中的自身抗原抗體沉積以及抑制抗體產(chǎn)生來增強涉及Treg細胞的調(diào)節(jié)應(yīng)答[36]，并且可通過與蛋白質(zhì)結(jié)合來防止氧化修飾蛋白質(zhì)的氧化應(yīng)激，并且還可以抑制B細胞的活化，并減少血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的足細胞損傷和細胞凋亡，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[37]。DENT E L等[38]研究也證實，口服姜黃素治療可調(diào)節(jié)自身免疫活性，并可以減輕SLE雌性小鼠的腎損傷，但其生物利用度差且在體內(nèi)清除較快。姜黃素包封到外泌體中可顯著提高姜黃素的溶解度、生物利用度和穩(wěn)定性[39]。外泌體姜黃素的使用可以利用姜黃素和外泌體的功能特性以一種附加的方式對抗炎癥相關(guān)的LN疾病。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細胞，是再生醫(yī)學(xué)中的星形細胞。除了再生能力外，還能通過外泌體途徑在細胞因子風(fēng)暴抑制、增強細胞、組織再生、細胞遷移、促進血管生成、調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MSC移植被認為是一種安全有效的LN治療方法，而LN患者的MSCs 具有衰老、細胞骨架紊亂和低生長率等特點，逆轉(zhuǎn)MSCs衰老表型可提高自體MSCs 移植治療LN的療效。與健康組相比，SLE患者血清外泌體中miR-146a水平顯著下降。這些包裹 miR-146a的外泌體被內(nèi)化到MSCs中，并通過靶向 TRAF6/NF-κB通路來緩解MSCs的衰老[40]。攜帶干細胞來源的外泌體在治療腎損傷方面表現(xiàn)出顯著的治療效果。MSC衍生的外泌體(MSC-EXOs)不僅承載了MSC本身的大部分治療作用，而且減少了對注射活細胞安全性的擔(dān)憂。MSC-EXOs通過下調(diào)IL-22和 IL-23來改善人類調(diào)節(jié)性巨噬細胞的抗炎表型，從而促進炎癥緩解。人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSC)衍生的外泌體增加了小鼠和人類狼瘡中M2巨噬細胞極化的比例，減少小鼠肺和腎臟的炎癥性淋巴細胞浸潤，抑制肺間隔增厚和纖維化，減輕腎炎以及膠原纖維和糖原的沉積。MSC衍生的外泌體通過塑造 M1/M2偏向和誘導(dǎo)抗炎M2亞型細胞來幫助保護MRL/lpr小鼠免受關(guān)鍵器官損傷[41]。MSC衍生的外泌體通過誘導(dǎo)M2巨噬細胞和Tregs極化來改善腎炎和其他關(guān)鍵器官損傷。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，外泌體作為物質(zhì)儲存器和信息傳遞器在LN的診斷和治療中發(fā)揮重要作用。介于病理類型的LN患者表達譜存在差異，因此檢測外泌體源性miRNA和蛋白質(zhì)有實現(xiàn)LN患者早期診斷和預(yù)后評估的潛力，且避開了傳統(tǒng)活檢侵入性檢測的局限性，有很大優(yōu)勢。不過研究中暴露出的問題同樣也不少：①外泌體分離提純始終未建立一套統(tǒng)一的標準，沒有一種單一的分離技術(shù)可以保證純度、速度、成本效益和同時處理大量樣品。目前的外泌體分離方法均無法避免蛋白質(zhì)污染，外泌體的規(guī)模化生產(chǎn)和高純度分離的實現(xiàn)，其還有待進一步研究；②不少研究涉及的樣本量較小，且在LN的研究中，絕大多數(shù)生物標志物在尿外泌體中發(fā)現(xiàn)，目前很少有研究比較泌尿與非泌尿外泌體在腎臟疾病中的可用性。且近年來提出的生物標志物都太過分散，重疊性差，往往只是在分析特定狀況下的一種或多種外泌體標志物，這都提示有關(guān)液體活檢的研究處于早期階段，還有待深入；③除了研究相關(guān)標志物表達的差異外，外泌體在LN潛在的病理生理發(fā)病機制及其作為治療靶點的作用機制需要進一步的研究闡明及驗證，才能發(fā)掘指導(dǎo)LN臨床治療的新思路。許多研究都集中在外泌體與炎癥和腫瘤之間的關(guān)系上，而外泌體在自身免疫性疾病中的研究還很有限；④到目前為止，與在腫瘤中的應(yīng)用相比，使用外泌體載藥治療自身免疫性疾病的研究非常罕見。但是隨著人們對外泌體更深入的研究和了解，其在LN診斷、預(yù)后評估和治療方面的前景不可估量，可以為眾多醫(yī)學(xué)問題提供解決方案。