結(jié)直腸癌腫瘤組織中TMPRSS4、c-Met、KIF18A表達(dá)水平與其病理特性和生存狀態(tài)的關(guān)系

雷新鍵，楊千洪，鄭款恒，李 瑾，李 峰

寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院腫瘤外科，福建寧德 352200

流行病學(xué)調(diào)查顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病率為25.84/100 000[1]，其發(fā)病率僅次于肺癌及乳腺癌。隨著我國(guó)居民生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，但是結(jié)直腸癌的早期癥狀不典型，患者在確診時(shí)往往已處于中晚期，所以在臨床治療中，及時(shí)有效地對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行診斷，對(duì)預(yù)后具有積極意義[2]。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前統(tǒng)一的認(rèn)知認(rèn)為，基因的突變、腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及逃離自身免疫系統(tǒng)檢查對(duì)于腫瘤的發(fā)展具有重要意義?？缒そz氨酸蛋白酶(TMPRSSs)參與細(xì)胞外介質(zhì)的降解，可促進(jìn)細(xì)胞在組織內(nèi)的遷移及擴(kuò)散，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移播散[3]。間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(c-Met)是重要的受體酪氨酸激酶，其表達(dá)的過(guò)度激活會(huì)造成正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[4]。驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員18A(KIF18A)屬于驅(qū)動(dòng)蛋白超家族中的重要成員，在機(jī)體的微管末端發(fā)揮重要的解聚酶作用，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展[5]。本研究主要通過(guò)研究結(jié)直腸癌腫瘤組織中TMPRSS4陽(yáng)性率、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平與患者病理特性和生存率的關(guān)系，進(jìn)而對(duì)患者的臨床診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2015年3月至2017年6月確診的102例結(jié)直腸癌患者作為研究對(duì)象，平均年齡(45.44±7.44)歲；男67例，女35例；體質(zhì)量指數(shù)(23.52±1.59)kg/m2；臨床TNM分期：T1～T2期50例，T3～T4期52例；臨床分型：腫塊型45例，潰瘍型32例，侵襲型25例。所有患者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)論證通過(guò)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)入院前未進(jìn)行抗腫瘤治療；(3)無(wú)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(4)已獲得知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重心臟、肝、腎功能障礙；(2)入院前3個(gè)月服用過(guò)糖皮質(zhì)激素或受體拮抗劑類(lèi)藥物；(3)中途停止治療或者轉(zhuǎn)院。

1.2研究方法 本研究在對(duì)患者的治療中，及時(shí)對(duì)患者的癌變組織及癌旁正常組織(距離病灶部位2 cm以上)進(jìn)行收集。在對(duì)患者組織的收集過(guò)程中，遵循知情自愿原則。

1.2.1TMPRSS4、c-Met水平檢測(cè) 對(duì)患者的病灶組織進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理后，采用DAB進(jìn)行顯色及復(fù)染，使用已知的組織切片作為參照，對(duì)患者的TMPRSS4、c-Met蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)患者細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色及棕褐色顆粒的數(shù)量計(jì)算陽(yáng)性率。在TMPRSS4、c-Met切片的兩個(gè)視野進(jìn)行隨機(jī)檢測(cè)，陽(yáng)性率<10%為0分，陽(yáng)性率為10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分，兩個(gè)視野的評(píng)分乘積為免疫評(píng)分，以其評(píng)分≤2分為陰性，評(píng)分>2分為陽(yáng)性[7]。

1.2.2KIF18A水平檢測(cè) 使用Trizol試劑，按試劑盒說(shuō)明書(shū)從機(jī)體病灶組織提取總RNA，勻漿后依次加入Trizol、氯仿、異丙醇及75%乙醇抽提標(biāo)本總RNA，獲取RNA后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中RNA保存液溶解，于-20 ℃保存。向總RNA中先后加入去除gDNA的DNA eraser及反轉(zhuǎn)錄酶，按說(shuō)明書(shū)配制成20 μL的體系，在37 ℃條件下行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)15 min，在85 ℃的條件下維持15 s后終止。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)。以GAPDH的表達(dá)量作為內(nèi)參。

1.3觀察指標(biāo) 比較癌變組織及癌旁組織TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平。分別對(duì)不同性別、年齡、病程、臨床分型、TNM分期患者的TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平進(jìn)行比較。對(duì)患者隨訪3年，以患者的死亡作為終點(diǎn)事件，比較生存組及死亡組患者TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平。

2 結(jié) 果

2.1癌變組織及癌旁組織TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平比較 癌變組織的TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 癌變組織及癌旁組織TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平比較

2.2不同病理組織TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平比較 不同性別、年齡患者TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而不同病程、TNM分期、臨床分型患者TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同病理組織TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平比較

2.3不同生存狀態(tài)TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平比較 通過(guò)對(duì)患者的隨訪，生存患者61例，死亡患者41例，生存組TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平明顯低于死亡組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同生存狀態(tài)TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平比較

2.4相關(guān)性分析 患者TNM分期、臨床分型、病程及生存狀態(tài)與TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平均呈正相關(guān)(r=0.165～0.998，P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 相關(guān)性分析

3 討 論

結(jié)腸癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，結(jié)直腸癌患者的病死率在所有惡性腫瘤中排于第4位[8]。近年來(lái)，隨著治療方法及手術(shù)方式的不斷改進(jìn)，結(jié)直腸癌患者的生存率仍然不夠理想[9]。而絕大多數(shù)患者在確診時(shí)已發(fā)展為中晚期，因此，早期診斷并針對(duì)性治療結(jié)腸癌具有重要的臨床意義。

本研究通過(guò)對(duì)癌變組織及癌旁組織的TMPRSS4分析顯示，癌變組織的TMPRSS4陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織。通過(guò)對(duì)不同病理狀態(tài)患者的TMPRSS4陽(yáng)性率進(jìn)行分析，隨著機(jī)體病理狀態(tài)的不斷加重及生存狀態(tài)的惡化，TMPRSS4陽(yáng)性率明顯升高。目前有研究發(fā)現(xiàn)，TMPRSS4能夠干預(yù)胚胎發(fā)育及癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，在對(duì)動(dòng)物進(jìn)行TMPRSS4基因敲除后會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的組織發(fā)育及細(xì)胞分化出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷，進(jìn)一步提示TMPRSS4黏附分子可參與器官的發(fā)育[10]。有研究顯示，在腫瘤細(xì)胞中，癌變組織TMPRSS4水平明顯高于癌旁組織，且TMPRSS4對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有調(diào)節(jié)作用[11]。此外，TMPRSS4可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄抑制因子分泌影響E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)結(jié)直腸癌患者腫瘤細(xì)胞的不斷侵染。同時(shí)，TMPRSS4可以激活黏著斑激酶和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶等下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，讓癌細(xì)胞侵襲性增加。而在本研究中，癌變組織的TMPRSS4陽(yáng)性率明顯升高，提示腫瘤的增殖能力明顯提高。廖和強(qiáng)等[12]發(fā)現(xiàn)，TMPRSS4水平隨著患者腫瘤細(xì)胞侵襲性的增強(qiáng)呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)，這揭示了TMPRSS4水平可以用于預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

本研究結(jié)果顯示，隨著患者病理狀態(tài)的加重及生存狀態(tài)的惡化，其c-Met陽(yáng)性率明顯升高，c-Met主要參與了結(jié)直腸癌患者腫瘤的擴(kuò)散。有研究認(rèn)為，人類(lèi)的c-Met基因主要通過(guò)編輯跨膜受體，進(jìn)而產(chǎn)生自身磷酸化的活性。通過(guò)自身的磷酸化及活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，下游中間體發(fā)生自身磷酸化，這在一定程度上提高了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[13]。而腫瘤細(xì)胞隨著自身的運(yùn)動(dòng)能力提升逐漸向內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞分散，增加了其侵襲性。同時(shí)，c-Met在一定程度上對(duì)新生血管的生成具有誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，導(dǎo)致患者的預(yù)后較差。在本研究中，癌變組織的c-Met陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織，提示局部病灶部位的微血管密度呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)，且患者腫瘤細(xì)胞隨著血液循環(huán)向其他組織器官擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)升高。張翔等[14]在對(duì)結(jié)直腸癌患者c-Met基因水平的分析中發(fā)現(xiàn)，患者的預(yù)后與c-Met水平呈負(fù)相關(guān)，而本研究也顯示癌變組織c-Met陽(yáng)性率升高，提示c-Met參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

KIF18A主要參與了細(xì)胞器及染色體轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞的有絲分裂中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，KIF18A在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中可沿著微管正極運(yùn)動(dòng)[15]。且在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，可在微管的末端發(fā)揮解聚酶作用。而微管的長(zhǎng)度在一定程度上決定了其解聚能力。在正常人體細(xì)胞分裂過(guò)程中，若KIF18A水平異常升高，會(huì)造成有絲分裂過(guò)程出現(xiàn)異常，導(dǎo)致出現(xiàn)大量的非整倍體，誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，KIF18A水平與細(xì)胞周期素b1的表達(dá)量相似，KIF18A水平明顯升高可能提示患者的預(yù)后能力較差[16]。本研究中，死亡組的KIF18A水平明顯高于生存組。提示隨著患者KIF18A水平的升高，腫瘤細(xì)胞的分裂能力明顯提高，這對(duì)患者的預(yù)后具有消極作用。李斌等[17]在對(duì)腫瘤細(xì)胞KIF18A水平的分析中發(fā)現(xiàn)，患者的KIF18A水平與生存關(guān)系存在顯著相關(guān)，提示KIF18A可作為結(jié)直腸癌病情進(jìn)展的重要參考。

綜上所述，結(jié)直腸癌腫瘤組織中TMPRSS4、c-Met陽(yáng)性率及KIF18A水平與患者病理特性和生存率存在一定的相關(guān)性，可作為結(jié)直腸癌診斷的輔助參考之一。