胃癌患者組織中EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析*

謝貞蘭,邢益祥,李 佳,袁小慶,趙 鐵

安徽省銅陵市人民醫(yī)院病理科,安徽銅陵 244009

胃癌在惡性腫瘤中病死率居第2位，多數(shù)病死患者合并腫瘤轉(zhuǎn)移[1]。部分胃癌患者早期即可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但有關(guān)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子及生物學(xué)機(jī)制尚未明確。既往研究證實(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度等病理特征有關(guān)，胃癌組織病理學(xué)檢查可用于評(píng)估胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[2]。但僅通過(guò)腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)仍有一定誤診率，還需結(jié)合其他手段進(jìn)一步確診淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，包括影像學(xué)檢查、內(nèi)鏡檢查、病理學(xué)檢查等[3-4]。在胃癌患者中，胃癌組織中相關(guān)因子表達(dá)水平已被作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的輔助診斷手段，但目前已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)分子標(biāo)志物仍較少，需持續(xù)探討新的分子標(biāo)志物[5]。研究指出，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白參與上皮-間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化過(guò)程，與腫瘤細(xì)胞黏附連接丟失相關(guān)，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力[6]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，也可影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[7]。推測(cè)二者均與腫瘤患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但目前有關(guān)二者在胃癌組織中的表達(dá)及與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚無(wú)較多研究報(bào)道?；诖?，本研究觀察胃癌患者組織中EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析本院2016年1月至2020年11月收治的51例胃癌合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的資料，納入淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，回顧性分析本院同期收治的51例胃癌未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的資料，納入無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《胃癌規(guī)范化診療指南(試行)》[8]；(2)經(jīng)病理學(xué)檢查確診，胃癌組織學(xué)類型均為腺癌；(3)臨床資料及病理資料均完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并胃潰瘍；(2)合并其他部位原發(fā)腫瘤；(3)合并腎間質(zhì)、肝、肺纖維化；(4)合并脾功能亢進(jìn)；(5)合并糖尿??；(6)合并高尿酸血癥；(7)合并心血管疾??；(8)合并哮喘。本研究的設(shè)計(jì)符合倫理學(xué)有關(guān)規(guī)定，經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1收集基線資料 回顧性分析患者入院時(shí)基線資料，詳細(xì)記錄本研究所需資料，包括年齡、性別、腫瘤最大徑、發(fā)病部位、病程、腫瘤分化程度、TNM分期[9]、脈管內(nèi)癌栓，其中腫瘤最大徑、發(fā)病部位、腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內(nèi)癌栓均根據(jù)手術(shù)結(jié)果及手術(shù)標(biāo)本病理學(xué)檢查結(jié)果評(píng)估。

1.2.2EMT相關(guān)蛋白檢測(cè) 取手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行EMT相關(guān)蛋白檢測(cè)，EMT相關(guān)蛋白包括E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-鏈蛋白(β-catenin)等，選取E-cadherin、Vimentin、β-catenin進(jìn)行評(píng)估。試劑盒均由南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供。將組織剪碎后充分研磨，采用全蛋白提取試劑盒提取蛋白，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，TBST洗滌3次(每次5 min)，加入稀釋兔抗人E-cadherin、Vimentin、β-catenin單克隆抗體[賽默飛世爾(中國(guó))有限公司]，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次(每次5 min)，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體[賽默飛世爾(中國(guó))有限公司]，室溫下反應(yīng)1 h，TBST洗滌3次(每次5 min)。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)組織進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，反應(yīng)體系嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用以色列DNR公司Micro Chemi型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。采用Quantity One軟件分析蛋白條帶，計(jì)算吸光度(A)值，以檢測(cè)A值/內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氧酶A值作為EMT相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè) 取手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)，試劑盒均由上海研生生化試劑有限公司提供。碾碎組織，加入裂解液，采用總RNA試劑盒提取RNA，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取RNA后，檢測(cè)純度，通過(guò)紫外分光光度法檢測(cè)A值，波長(zhǎng)取260和280 nm，滿足A260/A280>1.80為合格。取1 μL RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用熒光定量試劑盒對(duì)TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)，探針由美國(guó)Bioserch-MC公司合成，探針序列為5′-FAM-CGG ACC TTG TG-CAA CTC TCC ACC TCC-TAMRA-3′，反應(yīng)體系嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4相關(guān)性評(píng)估 記錄經(jīng)手術(shù)標(biāo)本病理學(xué)檢查結(jié)果確診患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。采用回歸分析檢驗(yàn)患者腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內(nèi)癌栓、EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并分析患者胃癌組織中EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)效能。

2 結(jié) 果

2.1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組基線資料比較 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組不同腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內(nèi)癌栓的患者例數(shù)與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組E-cadherin相對(duì)表達(dá)水平低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；兩組年齡、性別、腫瘤最大徑、發(fā)病部位、病程比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組基線資料比較

2.2回歸分析檢驗(yàn)患者各主要指標(biāo)或變量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 將初步基線資料比較結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內(nèi)癌栓、E-cadherin、Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平作為自變量并說(shuō)明，見(jiàn)表2，將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況作為因變量(1=淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，0=無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，經(jīng)回歸分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌患者腫瘤分化情況、病理分期、脈管內(nèi)癌栓情況、胃癌組織內(nèi)E-cadherin相對(duì)表達(dá)水平、Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；腫瘤低分化，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期，有脈管內(nèi)癌栓，胃癌組織中Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高均是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)因子(OR>1，P<0.05)；胃癌組織中E-cadherin相對(duì)表達(dá)水平升高是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的保護(hù)因子(OR<1,P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 自變量賦值情況

表3 回歸分析檢驗(yàn)患者腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內(nèi)癌栓、胃癌組織中EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.3胃癌組織中EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線分析結(jié)果 胃癌組織中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC分別為0.863、0.833、0.831、0.838，AUC均>0.800，均有一定預(yù)測(cè)效能；最佳截?cái)嘀捣謩e取0.555、0.565、0.515、0.865時(shí)可以獲得最佳預(yù)測(cè)效能，見(jiàn)表4、圖1。

表4 胃癌組織中EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效能比較

圖1 胃癌組織中EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線圖

3 討 論

胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多步驟，包括腫瘤細(xì)胞惡變、侵襲、浸潤(rùn)等?；颊叱霈F(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后，行手術(shù)及放化療的難度增加，治療后患者仍有較高的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，且短期生存情況不理想[10]。因此，及時(shí)預(yù)測(cè)、診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并實(shí)施針對(duì)性治療尤為必要。

有研究指出，胃癌患者腫瘤分化程度、臨床分期、脈管內(nèi)癌栓等病理特征均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[11-12]。本研究初步比較發(fā)生與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的資料后行Logistic回歸分析結(jié)果顯示，胃癌患者腫瘤低分化，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期，有脈管內(nèi)癌栓，胃癌組織中E-cadherin相對(duì)表達(dá)水平降低，Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高均與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)因子。說(shuō)明除病理特征外，胃癌組織中EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平也與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，胃癌患者若Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高可能提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高風(fēng)險(xiǎn)。既往臨床常采用腫瘤分化程度、TNM分期、脈管內(nèi)癌栓評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[13-16]。腫瘤分化程度可反饋癌細(xì)胞與其起源細(xì)胞的結(jié)構(gòu)差異，分化程度越低的患者，腫瘤惡性程度越高，侵襲及浸潤(rùn)風(fēng)險(xiǎn)高，易累及淋巴結(jié)[13]。TNM分期可反饋腫瘤侵襲程度，分期Ⅲ～Ⅳ期患者的腫瘤侵襲程度較高，可侵襲黏膜下層，黏膜下層有豐富淋巴管及毛細(xì)血管，腫瘤可隨淋巴管及毛細(xì)血管轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)[14]。脈管內(nèi)癌栓被作為多種腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，存在脈管內(nèi)癌栓的胃癌患者，胃壁淋巴管網(wǎng)受癌細(xì)胞侵犯，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[15-16]。但上述特征仍難以準(zhǔn)確反饋患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，還可在此基礎(chǔ)上結(jié)合淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能的風(fēng)險(xiǎn)因子，作為輔助預(yù)測(cè)與診斷的手段。

EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移重要機(jī)制之一，表現(xiàn)為腫瘤上皮細(xì)胞受細(xì)胞外因子刺激后，失去極性，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，因此腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移[17]。EMT相關(guān)蛋白中，E-cadherin在胃癌患者中呈表達(dá)降低，主要原因在于胃癌發(fā)病后，黏附分子及基因表達(dá)改變，啟動(dòng)子胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤基序島區(qū)過(guò)度甲基化，活性氧化物、TGF-β、凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑基因升高，造成E-cadherin失活。而E-cadherin具有維持細(xì)胞和細(xì)胞間連接的作用，若E-cadherin表達(dá)降低，可使腫瘤細(xì)胞間黏附作用降低或喪失，腫瘤細(xì)胞易從原發(fā)灶脫落分離，轉(zhuǎn)移到局部淋巴結(jié)，最終造成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[18]。Vimentin具有多種功能，其表達(dá)升高時(shí)可降低細(xì)胞表面E-cadherin水平，抑制E-cadherin促進(jìn)細(xì)胞黏附作用，加速腫瘤從原發(fā)病灶處脫落[19]。此外，Vimentin表達(dá)升高可激活C-src原癌基因，C-src可進(jìn)一步使限速酶己糖激酶磷酸化，為腫瘤細(xì)胞提供充足能量，為腫瘤轉(zhuǎn)移提供有利條件，因此，腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高。而β-catenin則能與E-cadherin共同作用，形成復(fù)合物，發(fā)揮穩(wěn)定E-cadherin結(jié)構(gòu)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞黏附的作用。當(dāng)β-catenin表達(dá)升高時(shí)，復(fù)合物形成出現(xiàn)異常，腫瘤細(xì)胞難以緊密黏附，因此更易發(fā)生轉(zhuǎn)移[20]。此外，β-catenin表達(dá)升高時(shí)，可影響β-catenin/TCF信號(hào)途徑，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)，造成腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高。TGF-β1 mRNA表達(dá)升高可反饋為腫瘤細(xì)胞中TGF-β1功能增強(qiáng)。TGF-β1是重要組織修復(fù)因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化的功能。在胃癌患者中，TGF-β1可抑制免疫細(xì)胞，促使腫瘤發(fā)生免疫逃逸。此外，TGF-β1還可通過(guò)升高LMO1基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT改變，并可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，從而增加腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加[21]。

結(jié)合回歸分析結(jié)果與各項(xiàng)主要指標(biāo)增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制，推測(cè)胃癌患者組織中EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定預(yù)測(cè)甚至診斷效能。繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC均>0.800，均有一定預(yù)測(cè)效能，證實(shí)推測(cè)成立。臨床可結(jié)合患者病理特征與胃癌組織EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，預(yù)測(cè)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，若淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較高，可于根治術(shù)中實(shí)施淋巴結(jié)清掃，并于術(shù)后實(shí)施強(qiáng)化放化療，以預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。但因本研究未能探討癌胚抗原、糖類抗原125、糖類抗原199等血清腫瘤標(biāo)志物水平，結(jié)論尚有局限，還應(yīng)在未來(lái)增加上述指標(biāo)進(jìn)行研究，全面分析與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的多種指標(biāo)，進(jìn)一步提高對(duì)胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)與診斷特異度及靈敏度，對(duì)指導(dǎo)治療具有積極意義。

綜上所述，胃癌患者組織中EMT相關(guān)蛋白、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，癌組織中E-cadherin相對(duì)表達(dá)水平降低，Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高可增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，且上述指標(biāo)均可用于預(yù)測(cè)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，為淋巴結(jié)清掃術(shù)及術(shù)后強(qiáng)化放化療的實(shí)施提供參考。