石家莊市苯丙氨酸羥化酶缺乏癥的基因突變研究*

馬翠霞，封露露，李麗欣，白 雪，馬倩倩，封紀(jì)珍△

1.石家莊市婦幼保健院遺傳科，河北石家莊 050000；2.石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院體檢中心，河北石家莊 050000

正常情況下，天然食物中的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的苯丙氨酸(Phe)在肝臟苯丙氨酸羥化酶(PAH)的作用下轉(zhuǎn)化成酪氨酸，PAH缺乏的患兒可導(dǎo)致高苯丙氨酸血癥(HPA)，Phe旁路代謝增強(qiáng)，使得大量苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸從尿中排出，血中增多的Phe可以通過(guò)血腦屏障，導(dǎo)致腦內(nèi)Phe水平增高，引起腦髓鞘發(fā)育不良或脫髓鞘等腦白質(zhì)異常，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷[1]。近些年，雖然隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研究者很容易在苯丙酮尿癥(PKU)早期患兒中獲得準(zhǔn)確的分子遺傳學(xué)診斷結(jié)果，但PAH基因變異在不同地區(qū)人群中分布不同，代謝表型也存在較大差異，而患兒的基因型又是臨床表型的主要決定因素。因此，本研究旨在探討石家莊新生兒疾病篩查診治中心確診的苯丙氨酸羥化酶缺乏癥(PAHD)患兒PAH基因突變的規(guī)律及特點(diǎn)，為深入開(kāi)展PAHD的診斷及產(chǎn)前診斷、治療和遺傳咨詢(xún)提供科學(xué)的參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年5月至2020年7月在石家莊市新生兒疾病篩查診治中心確診的67例PAHD患兒作為研究對(duì)象，排除BH4缺乏癥及暫時(shí)性HPA患兒。其中男37例，女30例；經(jīng)典型PKU(cPKU)16例，輕度PKU(mPKU)11例，輕度HPA(MHP)40例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有檢查均獲得患兒家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人的知情同意，并與監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)2014年發(fā)表的《高苯丙氨酸血癥的診治共識(shí)》[2]，Phe>120 μmol/L(2 mg/dL)及血Phe與酪氨酸(Tyr)比值(Phe/Tyr)>2.0統(tǒng)稱(chēng)為HPA。其中血Phe≥1 200 μmol/L為cPKU；360 μmol/L≤血Phe<1 200 μmol/L為mPKU；120 μmol/L<血Phe<360 μmol/L為MHP。

1.3研究方法 抽取PAHD患兒及父母外周靜脈血各4 mL，采血管為2%乙二胺四乙酸二鈉抗凝，按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)所取標(biāo)本進(jìn)行核酸提取，使用 Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)檢，檢測(cè)合格后進(jìn)行基因組文庫(kù)構(gòu)建。用生物素標(biāo)記的探針與文庫(kù)DNA進(jìn)行雜交，用鏈霉親合素修飾的磁珠共價(jià)結(jié)合生物素標(biāo)記的探針抓取目的基因，磁力架吸附攜帶目的基因的磁珠，洗脫純化，富集目的基因。采用NextSeq500高通量測(cè)序儀測(cè)序。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SOAP SNP程序進(jìn)行單核苷酸序列多態(tài)分析，對(duì)于檢測(cè)到的突變位點(diǎn)嚴(yán)格按照ACMG指南[3]進(jìn)行致病性分析。對(duì)于未報(bào)道突變位點(diǎn)，使用生物信息學(xué)蛋白功能綜合性預(yù)測(cè)軟件REVEL、SIFT、PolyPhen_2、Mutation Taster、GERP+對(duì)致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)。對(duì)發(fā)現(xiàn)的致病突變?cè)谄渌谄紊?、下游設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序，從而驗(yàn)證高通量測(cè)序的結(jié)果，對(duì)患兒父母采用Sanger法進(jìn)行目標(biāo)基因突變驗(yàn)證。以上基因檢測(cè)由北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所完成。

2 結(jié) 果

2.1PAH基因突變?cè)赑AHD患兒中的分布 在67例PAHD患兒的134個(gè)PAH等位基因中共檢測(cè)到134個(gè)突變基因位點(diǎn)，61例患兒的PAH基因檢測(cè)到2個(gè)突變位點(diǎn)，其中2例患兒PAH基因?yàn)榧兒贤蛔?，所攜帶的突變基因分別為c.331C>T/c.331C>T和c.721C>T/c.721C>T，純合突變率為2.99%(2/67)，59例患兒PAH基因突變?yōu)閺?fù)合雜合突變。3例患兒PAH基因檢測(cè)到3個(gè)突變位點(diǎn)，所攜帶的突變基因分別為c.158G>A/c.842+2T>A/c.898G>T、c.158G>A/c.842+2T>A/c.1123C>G和c.158G>A/c.158G>A/c.842+2T>A。3例患兒PAH基因檢測(cè)到1個(gè)突變位點(diǎn)。

2.2PAHD患兒PAH基因突變類(lèi)型及特點(diǎn) 67例PAHD患兒PAH基因序列測(cè)定分析結(jié)果顯示，在134條染色體中總計(jì)發(fā)現(xiàn)44種突變，134個(gè)突變位點(diǎn),突變位點(diǎn)均經(jīng)一代測(cè)序驗(yàn)證。主要包括錯(cuò)義突變27種(61.36%)，剪接突變8種(18.18%)，無(wú)義突變6種(13.64%)，移碼突變兩種(4.55%)，同義突變1種(2.27%)。134個(gè)突變位點(diǎn)分布在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12外顯子及第1、4、5、7、8、10、12內(nèi)含子，其中第2外顯子檢測(cè)到的突變最多，占21.64%(29/134)；其他位置的突變頻率由高到低依次為第7外顯子(15.67%,21/134),第3外顯子(11.19%,15/134),第11外顯子(10.45%，14/134)，第6外顯子(9.70%，13/134)，第12外顯子(9.70%，13/134)。PAH基因突變位點(diǎn)主要有p.R53H(突變頻率為20.90%，28/134)，p.R243Q(突變頻率為7.46%，10/134)，p.R111X(突變頻率為6.72%，9/134)，p.Y204C(突變頻率為6.72%，9/134)，c.442-1G>A(突變頻率為5.22%，7/134)，p.Y356X(突變頻率為3.73%、5/134)，p.R413P(突變頻率為3.73%、5/134)，具體突變位點(diǎn)情況見(jiàn)圖1。

注：*標(biāo)注的基因突變位點(diǎn)為本研究中發(fā)現(xiàn)的未見(jiàn)報(bào)道基因突變位點(diǎn)。

2.3cPKU、mPKU及MHP患兒PAH基因突變位點(diǎn) 石家莊市PAHD患兒基因突變以復(fù)合雜合突變?yōu)橹?，在各型患兒中PAH基因高頻突變位點(diǎn)有所不同。16例cPKU患兒中共檢測(cè)到突變12種，其中c.1068C>A和c.331C>T突變頻率最高，均為15.63%(5/32)，其次為c.728G>A，突變頻率為12.50%(4/32)；純合突變頻率為6.25%(1/16)，其余均為復(fù)合雜合突變。

11例mPKU患兒中共檢測(cè)到突變12種，其中c.721C>T突變頻率最高，為18.18%(4/22)，其次為c.1252A>C，突變頻率為13.64%(3/22)；純合突變頻率為9.09%(1/11),其余均為復(fù)合雜合突變。

40例MHP患兒中共檢測(cè)到突變33種，其中c.158G>A突變頻率最高，為35.00%(28/80),其次為c.611A>G和c.728G>A，突變頻率均為6.26%(5/80),均為復(fù)合雜合突變，具體情況見(jiàn)表1。

表1 67例PAHD患兒PAH基因突變檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表1 67例PAHD患兒PAH基因突變檢測(cè)結(jié)果

2.4未報(bào)道的PAH基因 在石家莊市新生兒疾病篩查診治中心確診的67例PAHD患兒中發(fā)現(xiàn)134個(gè)PAH基因突變位點(diǎn)，其中有3個(gè)突變位點(diǎn)未見(jiàn)報(bào)道，分別為c.912+5G>T、c.61-1G>A和c.630T>G，對(duì)患兒及其父母進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，排除多態(tài)性位點(diǎn)可能性，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2、3、4。

注：A、B、C分別為PAHD患兒及其父母測(cè)序結(jié)果，箭頭所示為基因突變位置。

注：A、B、C分別為PAHD患兒及其父母測(cè)序結(jié)果，箭頭所示為基因突變位置。

注：A、B、C分別為PAHD患兒及其父母測(cè)序結(jié)果，箭頭所示為基因突變位置。

3 討 論

PAH基因突變是導(dǎo)致PKU發(fā)病的重要原因之一，PAH活性受損或喪失，使得血液中的Phe無(wú)法完全代謝，在體內(nèi)大量蓄積，進(jìn)一步導(dǎo)致HPA，影響患兒機(jī)體和大腦的發(fā)育。HPA為常染色體隱性遺傳病，是少數(shù)可以治療的遺傳代謝病之一。如果通過(guò)篩查能夠在早期對(duì)HPA進(jìn)行及時(shí)確診和治療，多數(shù)是可以避免其對(duì)患兒神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆損傷的情況。本研究通過(guò)對(duì)PAHD患兒基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)，不僅補(bǔ)充、完善了石家莊市PAHD患兒的基因突變圖譜，并且為PAHD患兒家庭的遺傳咨詢(xún)提供了有價(jià)值的信息。

任何一種突變都有可能導(dǎo)致PAH基因結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致PAH活性的改變，影響Phe的代謝過(guò)程。有學(xué)者報(bào)道，在中國(guó)人群中已鑒定出的PAH基因突變有100余種[4]，PAH基因突變?cè)诓煌貐^(qū)及人群中分布有所不同，代謝表型也存在較大差異，有研究表明，我國(guó)華南地區(qū)PAHD的發(fā)生率明顯低于華北地區(qū)，中部和西部地區(qū)高于東部地區(qū)[5-6]。構(gòu)建每個(gè)地區(qū)的 PAH基因突變譜有助于研究基因變異與表型的關(guān)系,更好地服務(wù)于臨床，因此，完善中國(guó)不同地區(qū) PAH基因突變譜的構(gòu)成具有重要意義。本研究中61例患兒PAH基因突變?yōu)?個(gè)突變位點(diǎn)，其中2例PAH基因?yàn)榧兒贤蛔兓?，所攜帶的突變基因分別為c.331C>T/c.331C>T和c.721C>T/c.721C>T； 59例患兒PAH基因突變?yōu)閺?fù)合雜合突變。3例患兒PAH基因突變?yōu)?個(gè)突變位點(diǎn)，所攜帶的突變基因分別為c.158G>A/c.842+2T>A/c.898G>T、c.158G>A/c.842+2T>A/c.1123C>G和c.158G>A/c.158G>A/c.842+2T>A。3例患兒PAH基因檢測(cè)到1個(gè)突變位點(diǎn)。

PAH基因突變的形式涵蓋錯(cuò)義突變、剪接突變、無(wú)義突變、移碼突變、同義突變等，石家莊市PAH基因突變類(lèi)型與之前報(bào)道的基本一致[7]，主要有錯(cuò)義突變(61.36%)、剪接突變(18.18%)、無(wú)義突變(13.64%)等，PAH基因在所有位置都有可能發(fā)生基因突變，大多數(shù)突變集中在外顯子上[8]。PAH基因突變具有高度遺傳異質(zhì)性，突變種類(lèi)繁多且分布不均，每種突變?cè)诓煌貐^(qū)和人群中的發(fā)生率存在很大差異，但某些突變位點(diǎn)在某些地區(qū)又存在一致性。

石家莊市PAHD患兒基因突變位點(diǎn)主要分布在第2、3、6、7、11和12外顯子，這與之前報(bào)道的中國(guó)和亞洲人群突變情況是一致的[9-11]。然而在不同區(qū)域及人群中又存在一定的差異，第2外顯子檢測(cè)到的突變最多，這與文獻(xiàn)[9-11]報(bào)道的情況又有所不同。

本研究67例PAHD患兒中，54.48%的突變是由7個(gè)突變位點(diǎn)引起。最常見(jiàn)的基因突變位點(diǎn)有p.R53H(突變頻率為20.90%)、p.R243Q(突變頻率為7.46%)、p.R111X(突變頻率為6.72%)、p.Y204C(突變頻率為6.72%)、c.442-1G>A(突變頻率為5.22%)、p.Y356X(突變頻率為3.73%)、p.R413P(突變頻率為3.73%)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石家莊市PAH基因常見(jiàn)突變位點(diǎn)排除了中國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)的p.R241C和p.R408Q突變[12]。

基因型與臨床表型之間具有一定的相關(guān)性，PAH基因突變位點(diǎn)的相關(guān)研究對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要意義，然而帶有相同PAH基因突變的不同PAHD患兒間也存在一定的表型差異，因此，筆者通過(guò)分析PAHD患兒的基因突變類(lèi)型與臨床表型之間的關(guān)系，可為患兒提供個(gè)體化的治療方案，并且能夠更好地為患兒的家庭提供遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷的幫助。

石家莊市PAHD患兒基因突變以復(fù)合雜合突變?yōu)橹?，其中突變頻率較高的突變位點(diǎn)有：c.158G>A、c.728G>A、c.331C>T和c.611A>G、c.442-1G>A，提示石家莊市在開(kāi)展PAHD產(chǎn)前基因診斷或進(jìn)行相關(guān)基因突變研究時(shí)，需要重點(diǎn)關(guān)注上述突變位點(diǎn)，這與國(guó)內(nèi)其他報(bào)道既有相似性也有差異性。石家莊市c.158G>A突變頻率最高，與青島市[13]、海南省[14]、安徽地區(qū)[15]PAHD患兒的PAH基因突變的特征一致，而該突變位點(diǎn)在云南地區(qū)[16]、青海地區(qū)[17]、寧夏地區(qū)[18]、陜西省[19]、浙江省[12]、內(nèi)蒙古地區(qū)[20]等卻不是高頻突變位點(diǎn)。c.1068C>A在青島市[21]突變頻率較高，而在石家莊市較低。

PAH基因突變位點(diǎn)c.728G>A、c.331C>T和c.442-1G>A與報(bào)道中我國(guó)北方群體[22]中PAH基因突變情況一致，但c.611A>G不是該報(bào)道中北方群體PAH基因突變頻率較高的突變位點(diǎn)，但此突變位點(diǎn)在石家莊市突變頻率較高。報(bào)道中南方群體[22]中PAH基因的突變位點(diǎn)c.1223G>A(p.R408Q)和c.498C>G(p.Y166X)在石家莊市也不是突變頻率較高的突變位點(diǎn)。本研究探討了石家莊市PAHD患兒的基因突變特點(diǎn)，然而在PAHD各型患兒中突變位點(diǎn)卻有所不同，cPKU患兒以c.1068C>A、c.331C>T為主，mPKU患兒以c.721C>T、c.1252A>C為主，MHP患兒以c.158G>A為主。在突變位點(diǎn)中c.1068C>A僅在5例cPKU患兒中檢出，推測(cè)c.1068C>A可能是石家莊市cPKU中PAH基因的高頻突變位點(diǎn)；c.331C>T、c.442-1G>A、c.611A>G、c.728G>A、c.1197A>T在各型患兒中均有檢出；c.721C>T僅在3例mPKU患兒(1例為純合突變)中檢出，推測(cè)c.721C>T可能是石家莊市mPKU中PAH基因的高頻突變位點(diǎn)；c.158G>A僅在27例MHP患兒(1例為純合突變)中檢出，推測(cè)c.158G>A可能是石家莊市MHP中PAH基因的高頻突變位點(diǎn)。值得注意的是，c.158G>A在中國(guó)北方的mPKU和MHP患者中的突變頻率似乎高于其他地區(qū)，這可能代表著某些人群的擴(kuò)張或遷移[22-23]。

PAH基因突變對(duì)酶活性的影響主要依賴(lài)于突變的位置和形式，本研究發(fā)現(xiàn)未報(bào)道的3種PAH基因突變位點(diǎn)c.912+5G>T、c.61-1G>A和c.630T>G，分別位于外顯子8、外顯子2和外顯子6。c.912+5G>T在健康人群數(shù)據(jù)庫(kù)中為低頻變異，根據(jù)ACMG指南[3]該變異初步判定為臨床意義未明。c.630T>G位于基因的非保守區(qū)，在健康人群數(shù)據(jù)庫(kù)中為低頻變異，根據(jù)ACMG指南[3]該變異初步判定為臨床意義未明,使用生物信息學(xué)蛋白功能綜合性預(yù)測(cè)軟件REVEL、SIFT、PolyPhen_2、Mutation Taster、GERP+預(yù)測(cè)結(jié)果分別為有害、良性、有害、有害、良性。c.61-1G>A位于基因的保守區(qū)，在健康人群數(shù)據(jù)庫(kù)中為低頻變異，根據(jù)ACMG指南[3]該變異初步判定為疑似致病性變異。這3個(gè)位點(diǎn)突變形式為剪接突變和錯(cuò)義突變，這可能會(huì)導(dǎo)致酶蛋白表達(dá)異常，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的折疊及穩(wěn)定性，從而影響酶蛋白的催化活性。這些變化與PAHD的關(guān)系亟待進(jìn)一步證實(shí)。其中發(fā)生c.912+5G>T突變的患兒為mPKU，發(fā)生c.61-1G>A和c.630T>G突變的患兒為MHP，這3個(gè)PAH基因突變位點(diǎn)在石家莊市mPKU和MHP患兒中檢出，提示在進(jìn)行mPKU和MHP患兒的確診工作時(shí)應(yīng)尤其注意這些突變位點(diǎn)的總結(jié)和分析，為以后石家莊市mPKU和MHP患兒PAH基因的突變類(lèi)型、特點(diǎn)積累數(shù)據(jù)。

目前，中國(guó)已報(bào)道的PAH基因突變類(lèi)型約有190余種，且大多為雜合變異類(lèi)型。本研究通過(guò)分析石家莊市PAHD患兒PAH基因的突變類(lèi)型、特點(diǎn)及與臨床表型間的聯(lián)系，不僅為產(chǎn)前診斷、遺傳咨詢(xún)提供了理論依據(jù)，而且對(duì)降低PAHD的發(fā)病率，提高人口素質(zhì)具有重要意義。但本研究目前的數(shù)據(jù)量尚比較少，需要進(jìn)一步增加標(biāo)本數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。