鐵鹽對(duì)海帶雌配子體生長發(fā)育的影響

賽珊 趙楠 王偉偉 羅世菊 李曉捷

(山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái) 264003)

海帶(Saccharinajaponica)是重要的大型海水經(jīng)濟(jì)藻類之一。海帶的生活史具有明顯的異形世代交替，即孢子體與配子體世代交替[1-6]。目前，海帶的人工繁育方式主要有兩種：一種是選取具有明顯優(yōu)勢的成熟孢子體作為親本進(jìn)行選擇育種；另一種是利用海帶配子體克隆進(jìn)行育苗。后一種方法具有操作簡單、品種純度高、繁育效率高等優(yōu)點(diǎn)[7-12]。海帶配子體克隆培養(yǎng)方式主要是液體保存，其中影響配子體克隆生長發(fā)育的主要因素是溫度、光照強(qiáng)度和營養(yǎng)鹽等，無機(jī)氮與磷的比例以及一些植物生長促進(jìn)劑和微量元素也對(duì)配子體的生長和發(fā)育具有非常重要的作用[13-27]，其中鐵元素對(duì)海藻的光合作用、呼吸作用以及一些代謝行為有重要的影響[28-29]。

在海帶配子體的日常保種過程中，培養(yǎng)液中需要加氮和磷這兩種營養(yǎng)鹽。缺少氮鹽會(huì)導(dǎo)致生長緩慢，缺少磷鹽會(huì)導(dǎo)致生長發(fā)育不良，而添加鐵鹽能促進(jìn)海帶配子體對(duì)氮和磷兩種營養(yǎng)鹽的吸收[30]。劉德厚等[31]的研究表明，鐵鹽對(duì)海帶配子體的生長發(fā)育有較大的影響。

為探究鐵鹽對(duì)不同品種(系)海帶雌配子體的影響，本研究通過添加不同質(zhì)量濃度Fe3+，對(duì)在低溫弱光和高溫強(qiáng)光條件下培養(yǎng)的“901”、韓國海帶和“連雜1號(hào)”3個(gè)品種(系)海帶雌配子體的生長發(fā)育情況進(jìn)行了觀察。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取實(shí)驗(yàn)室種質(zhì)庫分別保存在低溫弱光[(10.0±1.0)℃、2 μmol/(m2·s)，L]和高溫強(qiáng)光[(15.0±1.0)℃、80 μmol/(m2·s)，H]條件下狀態(tài)良好的“901”(經(jīng)國家審定的海帶品種)、韓國海帶(采自韓國的海帶地理種群)和“連雜1號(hào)”雌配子體克隆系。培養(yǎng)液為加熱煮沸的消毒海水，添加質(zhì)量濃度分別為10、1 mg/L的NaNO3-N、KH2PO4-P。

1.2 試驗(yàn)藥品

檸檬酸鐵為分析純，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)材料預(yù)處理

將海帶雌配子體克隆用循環(huán)泵氣動(dòng)打散，其濾液經(jīng)400目(孔徑38 μm)篩絹過濾后，取適量濾液于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中。在顯微鏡(10×16倍)下鏡檢打散的配子體，以平均每段3～4個(gè)細(xì)胞、每個(gè)視野有4～5個(gè)配子體段為宜。將培養(yǎng)皿放置在低溫弱光[10 ℃，≤2 μmol/(m2·s)]條件下靜置1周，使配子體段附著，便于計(jì)數(shù)。

1.3.2 正式試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置0、0.5、1.0、1.5 mg/L等4種Fe3+質(zhì)量濃度，光照周期為10 L∶14 D。分別選取保存在低溫弱光[(10.0±1.0)℃、2 μmol/(m2·s)，L]和高溫強(qiáng)光[(15.0±1.0)℃、80 μmol/(m2·s)，H]條件下的試驗(yàn)材料，放在(10.0±1.0)℃、20 μmol/(m2·s)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)持續(xù)1個(gè)月，前10 d每2 d鏡檢1次，統(tǒng)計(jì)配子體段的細(xì)胞數(shù)，之后每4 d鏡檢1次，拍照觀測配子體的生長狀態(tài)。按照以下公式計(jì)算相對(duì)生長率(RGR，%/d)和配子體排卵比率(%)。

(1)

配子體排卵比率=100×排卵細(xì)胞數(shù)/(排卵細(xì)胞數(shù)+未排卵細(xì)胞數(shù))

(2)

式(1)中，n0為初始配子體段細(xì)胞數(shù)，n1為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)配子體段細(xì)胞數(shù)，t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2013整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Tukey HSD方法進(jìn)行均值多重比較，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，設(shè)顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 鐵鹽對(duì)海帶雌配子體相對(duì)生長率和排卵比率的影響

從圖1-a可以看出，“901”(L)在Fe3+質(zhì)量濃度為0時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間越長，配子體段細(xì)胞數(shù)越多。當(dāng)Fe3+質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/L時(shí)，試驗(yàn)前8 d，配子體段的細(xì)胞數(shù)隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增多。在第8天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L組的配子體段細(xì)胞數(shù)最多，由4個(gè)增加到18個(gè)，相對(duì)生長率為22.72 %/d。第10天，由于部分細(xì)胞開始排卵，造成配子體段細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)負(fù)增長。從圖1-b可以看出，“901”(H)在試驗(yàn)開始后的前6 d，4個(gè)Fe3+質(zhì)量濃度組的配子體段細(xì)胞數(shù)均增多了。第6天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L組的配子體段的細(xì)胞數(shù)最多，由4個(gè)增加到16個(gè)，相對(duì)生長率為20.26%/d。在第10天，配子體段細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)負(fù)增長?！?01”(L)在試驗(yàn)開始后的第4天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0、0.5 mg/L的試驗(yàn)組，其配子體段的細(xì)胞數(shù)顯著低于1.0、1.5 mg/L組(P<0.05)，第8天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0 mg/L的組顯著低于其他組(P<0.05)?！?01”(H)在試驗(yàn)開始后的第6天，0 mg/L組配子體段的細(xì)胞數(shù)顯著低于1.0、1.5 mg/L組(P<0.05)，第10天，各組間沒有顯著性差異(P>0.05)。

注：柱狀圖上方不同字母表示同一時(shí)間不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)。

從圖2和圖3可以看出，在試驗(yàn)過程中，韓國海帶(L)、(H)和“連雜1號(hào)”(L)、(H)均呈現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)間越長，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度越高，配子體段細(xì)胞數(shù)增加越多的趨勢，且均在第10天，當(dāng)Fe3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)，配子體段的細(xì)胞數(shù)最多。韓國海帶(L)配子體段細(xì)胞數(shù)由3個(gè)增加到20個(gè)，相對(duì)生長率為18.26%/d；韓國海帶(H)由3個(gè)增加到24個(gè)，相對(duì)生長率為20.64%/d?！斑B雜1號(hào)”(L)由3個(gè)增加到18個(gè)，相對(duì)生長率為16.18%/d；“連雜1號(hào)”(H)由3個(gè)增加到19個(gè)，相對(duì)生長率為16.68%/d。韓國海帶(L)、(H)在試驗(yàn)開始后的前2 d，各試驗(yàn)組間沒有顯著性差異(P>0.05)。6 d后，當(dāng)Fe3+質(zhì)量濃度為0 mg/L時(shí)，韓國海帶(L)配子體段的細(xì)胞增長顯著低于其他3個(gè)質(zhì)量濃度組(P<0.05)。第10天，當(dāng)Fe3+質(zhì)量濃度為0 mg/L時(shí)，韓國海帶(H)配子體段的細(xì)胞增長顯著低于其他3個(gè)質(zhì)量濃度組(P<0.05)。“連雜1號(hào)”(L)、(H)在試驗(yàn)的前4 d，各Fe3+質(zhì)量濃度組間配子體段的細(xì)胞增長沒有顯著性差異(P>0.05)。但隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，在第10天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0、0.5 mg/L組的細(xì)胞增長數(shù)顯著低于1.0、1.5 mg/L組(P<0.05)。

注：柱狀圖上方不同字母表示同一時(shí)間不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)。

從圖1～圖3可以看出，“901”(L)在試驗(yàn)的前8 d、“901”(H)在試驗(yàn)的前6 d，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度越高，其配子體段細(xì)胞數(shù)增長速度越快。韓國海帶和“連雜1號(hào)”在試驗(yàn)的前10 d，其配子體段細(xì)胞數(shù)的增長速度基本上隨著Fe3+質(zhì)量濃度的增高而加快，并且與高溫強(qiáng)光條件下的雌配子體相比，低溫弱光條件下雌配子體的相對(duì)生長率較低。

注：柱狀圖上方不同字母表示同一時(shí)間不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)。

從圖4可以看出，“901”(L)在Fe3+質(zhì)量濃度為0 mg/L時(shí)沒有排卵現(xiàn)象，而“901”(H)的排卵比率達(dá)73.8%?！?01”(L)和“901”(H)均在Fe3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)，其配子體的排卵比率最高，分別達(dá)91.06%和100%?！?01”(L)配子體的排卵比率在4個(gè)Fe3+質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)；“901”(H)配子體的排卵比率在Fe3+質(zhì)量濃度1.0、1.5 mg/L組間沒有顯著性差異(P>0.05)，3個(gè)添加Fe3+的組顯著高于不添加Fe3+組(P<0.05)。

從圖5可以看出，韓國海帶(L)只有在Fe3+質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)有排卵現(xiàn)象，其配子體排卵比率為1.83%。韓國海帶(H)在Fe3+質(zhì)量濃度為0 mg/L時(shí)沒有排卵現(xiàn)象，在Fe3+質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)，其配子體排卵比率為4.33%，顯著高于Fe3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L的組(P<0.05)。

從圖6可以看出，“連雜1號(hào)”(L)、(H)在Fe3+質(zhì)量濃度為0 mg/L時(shí)均沒有排卵現(xiàn)象，在Fe3+質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，其配子體排卵比率最高，分別為6.23%和5.70%?！斑B雜1號(hào)”(L)配子體排卵比率在Fe3+質(zhì)量濃度0.5、1.0 mg/L兩個(gè)組間沒有顯著性差異(P>0.05)，但這兩組均顯著高于1.5 mg/L組(P<0.05)。“連雜1號(hào)”(H)配子體排卵比率在Fe3+質(zhì)量濃度為1.0、1.5 mg/L的兩個(gè)組間差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于0.5 mg/L組(P<0.05)。從圖4～圖6可以看出，鐵鹽對(duì)“901”雌配子體孤雌生殖的影響最為明顯，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度越高，配子體的排卵比率越高，而韓國海帶和“連雜1號(hào)”雌配子體的排卵比率均很低。

注：柱狀圖上方小寫字母不同表示低溫弱光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示高溫強(qiáng)光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)。

注：柱狀圖上方小寫字母不同表示低溫弱光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示高溫強(qiáng)光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)。

注：柱狀圖上方小寫字母不同表示低溫弱光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示高溫強(qiáng)光條件下不同F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 鐵鹽對(duì)海帶雌配子體生長發(fā)育狀態(tài)的影響

試驗(yàn)第2天，“901”(L)配子體(見圖7，a)的狀態(tài)沒有明顯變化。試驗(yàn)第4～6天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0 mg/L組的配子體生長較慢，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度越高，配子體營養(yǎng)生長越快。試驗(yàn)第8天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L的組中有少部分配子體細(xì)胞頂端出現(xiàn)卵囊，個(gè)別細(xì)胞排卵(見圖7，b)。試驗(yàn)第10天，0.5、1.5 mg/L的組配子體均出現(xiàn)排卵現(xiàn)象；第14～22天，進(jìn)入排卵高峰期(見圖7，c)。第22天后，卵細(xì)胞開始大量轉(zhuǎn)成孢子體(見圖7，d)?！?01”(H)在試驗(yàn)第8天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0.5、1.5 mg/L的組均開始排卵；試驗(yàn)第10天，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0 mg/L的組也出現(xiàn)了排卵現(xiàn)象；第10～18天，配子體大量排卵，第18天，卵細(xì)胞開始大量轉(zhuǎn)成孢子體。Fe3+質(zhì)量濃度越高，韓國海帶配子體營養(yǎng)生長的速度越快，在試驗(yàn)第16天，已形成復(fù)雜的分枝體和簇狀體(見圖8，a)，只有個(gè)別細(xì)胞排卵進(jìn)行孤雌生殖(見圖8，b)?！斑B雜1號(hào)”在Fe3+質(zhì)量濃度為0.5、1.5 mg/L時(shí)，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度越高，其營養(yǎng)生長越快，且色素越深(見圖9，a)，少量卵細(xì)胞則轉(zhuǎn)成小孢子體(見圖9，b)。

a.配子體;b.正在排卵;c.大量排卵;d.形成孢子體

a.簇狀體;b.排卵

a.簇狀體;b.畸形孢子體

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，“901”雌配子體孤雌生殖形成了大量的孢子體，其形態(tài)各樣，有橢圓形、扇形、帶形、波浪形等(見圖10)。但這些孢子體全部是畸形的，培養(yǎng)幾天后就會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞膨大、色素降解等現(xiàn)象，最終全部死亡(見圖11)。

圖10 各種形態(tài)的畸形孢子體

a.正常形態(tài)的孢子體; b，c，d.即將死亡的孢子體

3 討論

本試驗(yàn)通過添加鐵鹽，對(duì)在低溫弱光(L)和高溫強(qiáng)光(H)兩種條件下培養(yǎng)的“901”、韓國海帶和“連雜1號(hào)”3個(gè)品種(系)海帶雌配子體的生長發(fā)育情況進(jìn)行了觀察比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：鐵鹽對(duì)海帶雌配子體的生長發(fā)育具有顯著的促進(jìn)作用，但不同品種(系)間海帶雌配子體的表現(xiàn)并不相同。在不添加鐵鹽的情況下，除“901”(H)出現(xiàn)排卵現(xiàn)象外，其他2個(gè)品系均進(jìn)行營養(yǎng)生長；在添加鐵鹽的情況下，“901”、韓國海帶和“連雜1號(hào)”均出現(xiàn)排卵現(xiàn)象，說明鐵離子能夠促進(jìn)海帶雌配子體的孤雌生殖[32-33]。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，“901”海帶雌配子體易進(jìn)行孤雌生殖，且Fe3+質(zhì)量濃度越高，其孤雌生殖比率越高。當(dāng)Fe3+質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)，在低溫弱光和高溫強(qiáng)光條件下培養(yǎng)的“901”海帶雌配子體，其排卵比率分別高達(dá)91.06%和100%。韓國海帶和“連雜1號(hào)”的排卵比率相對(duì)較低，均不超過7%，其主要進(jìn)行營養(yǎng)生長。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，鐵離子對(duì)“901”生長發(fā)育的促進(jìn)效果比對(duì)韓國海帶和“連雜1號(hào)”更為顯著。其中，“901”(H)在不加鐵鹽的情況下排卵比率為73.8%。分析認(rèn)為，該品系比較容易受環(huán)境因素的影響，在高溫強(qiáng)光條件下，其生長被抑制，恢復(fù)到適宜條件后，配子體為了生存，對(duì)繁育有迫切的需求，因而快速排卵進(jìn)行孤雌生殖產(chǎn)生孢子體。相反，韓國海帶(L)、(H)在Fe3+質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)排卵比率最高，但也僅為1.83%和4.33%，其他Fe3+質(zhì)量濃度組的韓國海帶(L)無排卵現(xiàn)象?！斑B雜1號(hào)”(L)、(H)在Fe3+質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)排卵比率最高，但僅為6.23%和5.70%。這兩個(gè)品系均是鐵離子質(zhì)量濃度越高，配子體營養(yǎng)生長越快，這與王瀟等[34]的研究結(jié)果一致，說明適宜的鐵離子質(zhì)量濃度能夠促進(jìn)配子體的生長。本試驗(yàn)結(jié)果還表明，鐵和氮、磷營養(yǎng)鹽在促進(jìn)海帶配子體發(fā)育時(shí)具有協(xié)同作用，鐵是海帶配子體由營養(yǎng)生長到發(fā)育成熟再到有性生殖過程中的關(guān)鍵因素，但鐵質(zhì)量濃度過高會(huì)抑制海帶配子體的發(fā)育[34]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同一配子體上排卵細(xì)胞越多，越容易刺激周圍細(xì)胞成熟進(jìn)行排卵，配子體營養(yǎng)生長越受到抑制；反之，配子體營養(yǎng)生長越旺盛，排卵現(xiàn)象越少。試驗(yàn)中，孤雌生殖產(chǎn)生的卵細(xì)胞和孢子體均不易存活，在海帶和裙帶菜[35-36]中均存在這種情況。本試驗(yàn)中，海帶雌配子體孤雌生殖所形成的孢子體均為畸形，且最后都死亡了，而在戴繼勛等[35]和方宗熙等[32]的報(bào)道中有少量自然成熟的孢子體。分析其可能性，一是孤雌生殖產(chǎn)生的孢子體存在基因缺陷[37]，二是本試驗(yàn)中采用培養(yǎng)皿培養(yǎng)，其生存空間較小，不適宜生長，三是所選用的海帶品系不同。鐵鹽對(duì)海帶配子體的生長發(fā)育具有重要影響，其適宜添加濃度以及與氮、磷等其他營養(yǎng)因子的協(xié)同機(jī)理等研究對(duì)海帶苗種生產(chǎn)有著重要意義。