鯉春病毒血癥病毒生物學研究進展

劉佳 盧玉婷 劉蕓娜 閆子豪 汪惠慶 李月紅

(吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春 130118)

鯉春病毒血癥(Spring Viraemia of Carp，簡稱SVC)是由鯉春病毒血癥病毒(Spring Viraemia of Carp Virus，簡稱SVCV)引起的1種急性、出血性疾病，該病毒屬于彈狀病毒科，其病毒粒子長80～180 nm，直徑60～90 nm，鯉科魚類易感染此病，其他科魚類及兩棲類也有感染此病毒的報道。SVC傳染性強，發(fā)病率高，死亡率高，一旦暴發(fā)，養(yǎng)殖魚死亡率可達90%以上[1-2]。鯉春病毒血癥是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)必報的動物疫病。早在1992年我國就將其列為二類動物疫病，并收錄進《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》，2008年又將其列為一類動物疫病。

SVC一旦暴發(fā)會嚴重影響水產養(yǎng)殖生產，并造成巨大的經濟損失。因此，深入研究SVCV的致病機制對于鯉春病毒血癥的防治具有重要意義。本文從SVCV的流行特點、傳播方式、臨床癥狀、生物學特征、基因組特征和蛋白結構特征等方面進行綜述，旨在為該病的后續(xù)研究提供參考。

1 流行特點、傳播方式和臨床癥狀

1.1 流行特點

SVC分布地域較廣，主要流行于歐洲和中東地區(qū)，目前有報道的國家包括奧地利、匈牙利、保加利亞、法國、德國、英國、意大利、西班牙以及捷克、斯洛伐克和俄羅斯的部分地區(qū)[2]。此外，1998年英國環(huán)境、漁業(yè)和水產養(yǎng)殖科學研究中心(The Centre for Environment, Fisheries and Aquaculture Science,簡稱CEFAS)從來自中國北京的金魚和錦鯉中分離出病毒，并鑒定為SVCV[3]。1930年，SVC在歐洲首次發(fā)現(xiàn)，當時人們稱該病為傳染性水腫，但這一觀點爭議較大，僅被少數(shù)人接受。隨后，1971年南斯拉夫的Fijan[4]在發(fā)生急性水腫的魚體中分離出SVCV病毒，被世界公認為首次發(fā)現(xiàn)。SVCV宿主廣泛，包括鯉、鰱、鳙和草魚等經濟魚類，也包括錦鯉和斑馬魚等觀賞魚類，其中鯉科魚類最為易感。SVCV通常在春季、水溫為12～22 ℃時暴發(fā)，在寒冷的冬季后，水溫開始回升，當水溫升高到15～17 ℃時魚的發(fā)病率及死亡率最高，尤其幼魚最為明顯。當水溫高于17 ℃時，成魚很少發(fā)病，但幼魚在水溫20～22 ℃時也會感染此病并有死亡。當溫度升至22 ℃以上時，SVCV雖然可感染仔魚，但不會造成養(yǎng)殖魚類大規(guī)模發(fā)病，可能是由于水溫較高時，魚類機體代謝旺盛，免疫反應較為強烈[5]。據(jù)報道，該病對歐洲1齡鯉魚的影響重大，據(jù)估計1齡鯉魚的損失在10%～15%，相當于每年4 000 t左右[6]。

1.2 傳播方式

SVCV傳播方式包括水平傳播和媒介傳播，以水平傳播為主。水平傳播的主要傳染源包括病魚和死魚等。媒介傳播包括生物性媒介和非生物性媒介，生物性媒介主要包括水蛭和魚虱等，非生物性媒介則主要為水[7]。在自然條件下，病毒可以通過鰓侵入魚體內，在鰓上皮細胞中增殖，并且儲存在痊愈的魚體內，這種魚即成為病毒攜帶者。SVCV可通過糞便、尿液、鰓和皮膚黏液等分泌物排出體外，可在水中保持感染活性4周以上，在4～10 ℃的泥漿中保持感染活性6周以上[8]。

1.3 臨床癥狀

魚類感染SVCV后主要表現(xiàn)為攝食減少，游動緩慢，不能對外界刺激及時做出反應，身體平衡能力下降，出現(xiàn)側游現(xiàn)象，甚至只臥于池底，基本不游動。病魚臨床癥狀表現(xiàn)為：眼球突出，腹部膨脹，肛門紅腫，皮膚、鰓、眼睛及內臟有出血點或出血斑，通常體色發(fā)黑、鰓絲蒼白，肌肉因出血而呈紅色，內臟水腫、有出血斑點，其中以鰾最為常見，脾臟腫大、粗糙變形，肝壞死；組織病理變化表現(xiàn)為：肝實質充血、多灶性壞死和脂肪變性，脾臟充血，網(wǎng)狀內皮細胞明顯增生，淋巴管擴張，內充滿淋巴細胞、巨噬細胞和細胞碎片，胰腺發(fā)生多灶性壞死和非化膿性炎癥，心肌變性。小腸絨毛萎縮，腎小管阻塞，空泡和透明樣變[9-10]。

2 病毒特征

2.1 基因組特征

目前，GenBank中主要有16株SVCV全基因序列(截至2020年)，其中11株來自中國(見表1)，各基因間親緣關系進化樹見圖1[11]。SVCV的基因組為線性、單股不分段的負鏈RNA，核苷酸數(shù)約為11 kb，包含5個開放閱讀框，從3′端到5′端基因的排列順序為：3′-N-P-M-G-L-5′，依次編碼SVCV核蛋白(nucleoprotein，N)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基質蛋白(matrix protein，M)、糖蛋白(glycoprotein，G)和RNA聚合酶蛋白(RNA polymerase，L)(見圖2)[12]。SVCV基因組中各個基因之間的連接區(qū)相對保守，均以2個核苷酸(C、T)為間隔，但G-L的連接以4個核苷酸(C、T、A、T)為間隔[13]。SVCV基因組的前導區(qū)有69個核苷酸，其中60～64位是N基因的轉錄起始信號AACAG，這在每個基因中是一致的，拖尾序列長49個核苷酸，含有L基因的轉錄終止信號TATG(A)7，其末端存在著與前導區(qū)反向互補的核苷酸序列，這是彈狀病毒基因組的1個主要特征，也是不分段負鏈RNA病毒的共同特征[13]。

表1 GenBank中16株SVCV全基因序列表[11]

注：SVCV-shlj4于2020年10月剛提交至GenBank中，本文未對其進行統(tǒng)計。

(a)病毒結構模型；(b)基因組組織顯示編碼的蛋白質、基因連接以及前導區(qū)和尾區(qū)

2.2 結構蛋白特征

核蛋白N由418個氨基酸組成，是病毒雙螺旋核衣殼的主要成分，相對保守，常用N基因作為靶標來檢測SVCV，且準確檢出率高。

磷蛋白P由309個氨基酸組成，磷蛋白P與核蛋白N和RNA聚合酶蛋白L蛋白結合形成核蛋白顆粒。核蛋白顆粒負責病毒的轉錄和復制。

基質蛋白M由223個氨基酸組成，M蛋白參與SVCV的組裝和出芽。有研究報道，M蛋白可引起細胞凋亡，在細胞病理效應中起重要作用[14]。

糖蛋白G是病毒主要外膜蛋白之一，由509個氨基酸組成，位于病毒粒子表面，是病毒結構的關鍵組成部分。G蛋白與細胞受體結合并介導病毒內吞作用，幫助病毒侵入動物細胞，其構象變化將由內體酸化引發(fā)，使病毒基因組從核內體釋放到細胞質中[15]。它攜帶中和抗原決定基，是DNA疫苗開發(fā)的潛在靶點。

根據(jù)G蛋白的基因序列，可進一步將SVCV分為Ia、Ib、Ic、Id等4個基因組[3]。Ia型病毒主要從英國、中國、美國和加拿大分離得到，Ib型和Ic型主要來自摩爾多瓦、烏克蘭和俄羅斯等地分離的病毒株，Id型主要來自英國、德國和奧地利。SVCV進化聚類與地理分布密切相關，可能是不同地域病毒獨立進化的結果。不同亞型的SVCV以不同的速度進化，Ia型被認為是最活躍的，有證據(jù)表明，Ia型的P基因和G基因的核苷酸突變率約為Id型的3.5倍，Ia型又進一步分為Iai和Iaii兩個亞群。其中，從中國分離的4株SVCV分別為A1、A2、BJ0505-2和SVCV-265，經鑒定，SVCV-265為Iai亞群，A1、A2、BJ0505-2為Iaii亞群。全基因重組分析發(fā)現(xiàn)，A2、BJ0505-2株為A1株與SVCV-265同源重組后代，重組部位分別位于A2的3 845～6 387 bp和BJ0505-2的3 573～6 444 bp[16]。

RNA聚合酶蛋白L由2 095個氨基酸組成，是SVCV中最大的1個蛋白，因基因序列較長，存在一次性克隆難、多次克隆連接難等問題，目前對其功能性的研究相對較少。

3 檢測技術

目前，SVCV血清學檢測技術主要有病毒中和試驗(NT)、免疫過氧化物酶試驗(IP)、免疫熒光試驗(IF)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。然而，這些技術存在費時費力且SVCV抗血清的效價不高等問題[13]。SVCV和梭子幼魚彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus,PFRV)具有共同的抗原決定簇，在IF和ELISA中發(fā)生交叉反應，兩者很難區(qū)分[17]。PFR不是OIE必須申報的疫病。應用核糖核酸酶保護試驗(RPA)可成功鑒別包括SVCV和PFR在內的13種具有交叉反應的硬骨魚病毒。此外，RPA還揭示了不同品種鯉魚和不同地點的SVCV分離株之間具有遺傳多樣性。近年來，也有應用噬菌體展示技術獲得針對SVCV的抗體來檢測病原，且該技術特異性強，無交叉反應，為SVCV的檢測奠定了簡單、經濟的基礎，有待于大范圍推廣使用。

SVCV的分子生物學檢測技術主要基于PCR檢測技術高靈敏度的優(yōu)點，包括逆轉錄PCR、套式PCR、多重實時定量RT-qPCR、TaqMan實時定量PCR等。Oreshkova等[18-19]利用逆轉錄PCR(RT-PCR)構建了M基因和G基因生物素標記的DNA探針，用斑點雜交技術檢測SVCV，該方法檢出的樣品病毒滴度TCID50達到105/g。高隆英等[20]報道了采用RT-PCR擴增G基因片段來檢測SVCV，Koutna等[21]將RT-PCR與套式PCR技術相結合，能夠快速可靠地檢測到細胞培養(yǎng)和感染組織勻漿里的SVCV。PCR檢測技術雖然特異性強、靈敏度高，但需要專門的儀器、熟練的操作手法以及無該病原污染的環(huán)境等，這些條件制約了該技術的應用[22]。

與嵌套式RT-PCR技術相比，RT-LAMP技術具有更高的特異性和敏感性，具有所需設備簡單廉價、可以在養(yǎng)殖場輕松操作等優(yōu)勢，已成功應用于水產養(yǎng)殖病害防治。此外，該技術引入了納米生物檢測方法，在特定條件下，單鏈或雙鏈寡核苷酸可與金納米粒子在膠體溶液中雜交。Saleh等[23]利用這種特異性雜交分析方法直接檢測臨床樣本中的SVCV，而無須擴增病毒RNA，該方法的特異性達100%，且不需要熱循環(huán)儀器，測試時間也更短(15 min)。

4 疫苗的研究

疫苗的研制開發(fā)是控制疫病暴發(fā)的有效策略，然而，目前尚未有能有效預防SVCV感染的疫苗。限制此種類疫苗開發(fā)的問題是滅活疫苗保護率低、減毒疫苗對病毒減毒不當?shù)取NA疫苗作為1種能夠有效替代傳統(tǒng)疫苗的疫苗而受到廣泛關注。但SVCV的DNA疫苗保護效果不理想，明顯低于其他彈狀病毒科疫苗。Kanellos等[24]根據(jù)SVCV的G蛋白設計了10種DNA疫苗，其保護率僅為11%～33%；而使用表達全長G基因的二聯(lián)疫苗時，其保護率提高到48%。由于魚的黏膜組織對抵御病原體入侵有重要的作用，黏膜免疫的激活可以防止病原體感染，這是注射疫苗無法達到的，因此，口服疫苗的研發(fā)成為新的研究方向。有研究顯示，1種轉基因植物乳酸菌共表達SVCV-G蛋白和錦鯉皰疹病毒ORF81蛋白對鯉魚和錦鯉免疫65 d后的有效保護率分別為71%和53%[25]，被免疫鯉魚的免疫球蛋白M表達明顯升高。這些結果表明，口服疫苗具有良好的免疫效果，且免疫過程簡單，避免了注射疫苗時的機械損傷，有望在日后的研究優(yōu)化后成為商業(yè)化疫苗。

5 展望

集約化水產養(yǎng)殖迅速發(fā)展的今天，如何將產出最大化是我們一直追求的目標。面對SVCV對水產養(yǎng)殖業(yè)帶來的巨大經濟損失，如何有效治療SVC仍然是水產養(yǎng)殖亟需解決的難題之一。當前，針對SVCV的防控主要采取消滅傳染源、切斷傳播途徑及保護易感魚群等方法措施，并沒有高效的防控方法，加強檢疫和免疫防控仍是防控SVC的主要手段，因此，需進一步優(yōu)化鯉養(yǎng)殖環(huán)境因子、營養(yǎng)指數(shù)、群體行為特性的各技術環(huán)節(jié)，智能化監(jiān)測鯉健康養(yǎng)殖過程中的各類參數(shù)，動態(tài)調整鯉預防技術指標[26]。此外，治療藥物及商業(yè)化疫苗的開發(fā)和研制具有很大的發(fā)展前景。目前，對SVCV基因組序列、蛋白組成和病毒結構的研究已比較明晰，但其致病途徑和機理尚需進一步深入研究。